Toepassing van consistente massage-achtige perturbaties op muis kalveren en het monitoren van de resulterende intramusculaire drukveranderingen

Samenvatting

Hier beschrijven we de protocollen voor het toepassen van gedefinieerde mechanische ladingen op muis kalveren en voor het bewaken van de gelijktijdige intramusculaire drukveranderingen. De experimentele systemen die we hebben ontwikkeld kunnen nuttig zijn voor het onderzoek van het mechanisme achter de gunstige effecten van lichaamsbeweging en massage.

Samenvatting

Massage wordt over het algemeen erkend als gunstig voor het verlichten van pijn en ontsteking. Hoewel eerdere studies hebben gemeld anti-inflammatoire effecten van massage op skeletspieren, de moleculaire mechanismen achter zijn slecht begrepen. We hebben onlangs een eenvoudig apparaat ontwikkeld om lokale cyclische compressie (LCC) toe te passen, die intramusculaire drukgolven kan genereren met variërende amplituden. Met behulp van dit apparaat hebben we aangetoond dat LCC inflammatoire reacties van macrofagen in situ moduleert en de immobilisatie-geïnduceerde spieratrofie verlicht. Hier beschrijven we protocollen voor de optimalisatie en toepassing van LCC als een massage-achtige interventie tegen immobilisatie-geïnduceerde ontsteking en atrofie van skeletspieren van muis achterpoten. Het protocol dat we hebben ontwikkeld kan nuttig zijn voor het onderzoek van het mechanisme onderliggende gunstige effecten van lichaamsbeweging en massage. Ons experimentele systeem biedt een prototype van de analytische benadering om de mechanische regulatie van spier homeostase te verheldering, hoewel verdere ontwikkeling moet worden gemaakt voor uitgebreidere studies.

Inleiding

Massage is over het algemeen erkend als gunstig voor zowel pijnverlichting en verbetering van de fysieke prestaties onder competitieve atleten en niet-atleten gelijk^1,2. In feite, eerdere studies hebben aangetoond dat massage onderdrukt lokale ontsteking³ en vraagt herstel van de post-oefening spier schade^4,5. Moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de gunstige effecten van massage blijven grotendeels onbekend.

Een van de moeilijkheden met het mechanistische onderzoek naar massage heeft betrekking op de reproduceerbaarheid van experimentele technieken waarmee massage-achtige interventies worden getest. In eerdere studies betrekken experimentele procedures die massage nabootsen voornamelijk de toepassing van fysieke ingrepen met lichaamsdelen van de beoefenaren, zoals palmen en vingers^6,7,8. Dit maakt het moeilijk om precies te reproduceren hun magnitude, frequentie, duur, en modus.

Veel apparaten zijn ontwikkeld om gedefinieerde mechanische belastingen toe te passen op de doelweefsels. Bijvoorbeeld, Zeng et al. hebben een pneumatisch systeem ontwikkeld voor de lengte-Wise mechanische belasting van ratten ' achterledematen⁹ en Wang et al. hebben een mechatronisch apparaat ontwikkeld dat massage-achtige mechanische ladingen kan toepassen op achterpoten van ratten en konijnen met Real-time feedback controle¹⁰. In vergelijking met hen, onze lokale cyclische compressie (LCC) systeem is veel eenvoudiger, veeleisende veel minder kosten voor de bouw. Niettemin, we kunnen reproduceren de intramusculaire drukveranderingen die worden gegenereerd tijdens de milde spiercontractie. Met behulp van dit apparaat, we hebben met succes aangetoond dat de massage-achtige mechanische interventies moduleren lokale interstitiële vloeistof dynamiek en verlichten immobilisatie-geïnduceerde spieratrofie¹¹.

Hier beschrijven we de details van ons apparaat en het Protocol, die kunnen helpen bij het verkennen van de moleculaire mechanismen achter de positieve effecten van oefeningen en massages. De schema's van het protocol worden gepresenteerd als aanvullend figuur 1.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd onder de goedkeuring door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van het nationaal revalidatiecentrum voor personen met een handicap.

1. immobilisatie van de muis bilaterale achterpoten

Opmerking: mannelijke C57BL/6 muizen werden gebruikt voor experimenten op de leeftijd van 11-12 weken na acclimatie gedurende ten minste 7 dagen.

1. Voldoende anesthetiseren een muis met behulp van natrium pentobarbital (50 mg/kg i.p.). Zorg ervoor dat muizen niet reageren op een hindledemaat teen knijpen.
   Opmerking: Voer de procedure van immobilisatie tussen 10 uur en 7 p.m. uit om de mogelijke effecten op de toevoer activiteit van muizen te minimaliseren.
2. Breng chirurgische tapes op de bilaterale achterbenen van de muis gelegd in een rugligging met de kniegewrichten verlengd en enkelgewrichten plantar-flexed.
3. Plaats een aluminium draad (Zie tabel met materialen) op de romp op L4-5 wervelkolom niveau en spoel de draad in een spiraalvormige configuratie rond de achterpoten met 5 mm openingen tussen elke draai van de spiraal laag (Figuur 1a). Zorg ervoor dat u de draad niet te strak in de spoel en Vermijd het verstoren van de lokale bloedtoevoer.
4. Om de mogelijkheid van het ontsnappen van de bedrading te minimaliseren, immobiliseer de heupgewrichten op de positie van 90 ° ontvoering door het handmatig aanpassen van de configuratie van aluminium draad.
5. Keer de muizen terug naar hun oorspronkelijke kooien. 3 h later, zorg ervoor dat ze herstellen van anesthesie en toegang tot voedsel en water zoals gebruikelijk.
6. Huis 3-6 geïmmobiliseerde muizen per kooi als vóór immobilisatie.

2. meting van de intramusculaire druk van de muis gastrocnemius spieren

Opmerking: verschillende gewichten van cilindrische eenheden (36 g, 66 g en 200 g) werden getest in de drukbewakings experimenten gecombineerd met LCC. Deze meting werd afzonderlijk uitgevoerd van de experimenten om spier ontsteking en atrofie te analyseren (zie stap 3-5 voor meer details) d.w.z. dat de muizen die aan de drukmeting onderworpen zijn, niet werden gebruikt voor histologische analyses.

1. Omdat drukmeting leidt tot meer invasieve ingrepen (bijv. huid incisie en naald inbrengen) in vergelijking met de bedrading van de achterledematen en LCC, gebruikt u een mengsel van drie verdovingsmiddelen (Medetomidine 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg en butorphanol 5,0 mg/kg, i.p.). Zorg ervoor dat muizen niet reageren op de hindledemaat teen pinch.
2. Leg de muis in een liggende positie, maak een 2-mm incisie met een scalpel op het achterste kalf na ontharing met een elektrisch scheerapparaat en semi-steriliseren van het huidoppervlak met 70% ethanol-en chloorhexidine-geweekte absorberend katoen.
3. Steek een 20 G inwoning naald in de gastrocnemius spier met een stompe hoek (150 ° – 170 °) op het huidoppervlak.
4. Gebruik de plastic schede van de naald als een geleider, plaats een sensor van de bloeddruk Telemeter (Zie tabel van de materialen) in het midden van de buik van gastrocnemius spier, en verwijder vervolgens de schede van de spier.
5. Nadat u de huid met 4-0 nylon hecht, past u LCC toe met verschillende gewichten van cilindrische eenheden op het kalf in de muizen (zie stap 3 voor meer informatie) en bewaakt u de intramusculaire druk met behulp van software voor biologische signaalanalyse (Zie tabel van Materialen).
6. Keer de muizen terug naar hun oorspronkelijke kooien. 3 h later, zorg ervoor dat ze herstellen van anesthesie/analgesie en hebben toegang tot voedsel en water zoals gebruikelijk.

3. lokale cyclische compressie (LCC) op muis kalveren

1. Met uitzondering van de intramusculaire drukmeting en euthanatatie (dat wil zeggen, cervicale dislocatie), gebruik natrium pentobarbital (50 mg/kg i.p.) voor anesthesie.
2. Demonteer de muis van de bedrading van de achterledematen en leg deze in een liggende positie met de kniegewrichten verlengd en de enkelgewrichten plantar-flexed zodat de kalveren naar boven. Bevestig de muis achterpoten niet op het podium.
3. Breng LCC aan op het kalf door verticaal een cilindrische gewichtseenheid (Figuur 1b) te verplaatsen die bedekt is met een kussenpad (figuur 1c) bij 1 Hz gedurende 30 minuten per dag, 7 dagen.
4. Na elke aanval van de dagelijkse LCC, re-Wire de muis achterpoten.

4. immunohistochemische analyse van gastrocnemius

1. Euthanctie de muis door cervicale dislocatie onder adequate anesthesie/analgesie door intraperitoneale injectie van een mengsel van drie verdovingsmiddelen (Medetomidine 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg, en butorphanol 5,0 mg/kg).
2. Na het ontharen van het achterste kalf oppervlak, maak een huid incisie, en ontleden gastrocnemius spieren door scheiding van tibio-fibulaire bot met behulp van een chirurgische schaar en snel bevriezen ze in een optimale snijtemperatuur samengestelde oplossing.
3. Bereid met behulp van een cryostat Cryo-sectie monsters van gastrocnemius-spieren op glazen dia's. Bewaar de monsters in een vriezer van 80 °C tot de analyse.
4. Neem de monsters van de gastrocnemius Cryo-sectie om te worden geanalyseerd uit de vriezer en dehydraat ze door het drogen van de lucht bij kamertemperatuur.
5. Gebruik een Liquid blocker pen om een gebied te tekenen dat alle Cryo-secties op de dia bevat. De cirkel zal voorkomen dat de oplossingen van de glijbaan vloeien.
6. Vermijd het drogen van de monsters door de glaasjes in een bakje te plaatsen waarin een vochtige omgeving wordt gecreëerd met een door water geweekte papieren doek.
7. Breng 100 μL blokkerende buffer (fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,25% caseïne, dragerproteïne en 0,015 M natrium azide) gedurende 30 min bij kamertemperatuur aan.
8. Spoel de dia's tweemaal door met PBS-T (PBS met 0,1% polyoxyethyleen polyethyleenglycolsorbitaanmono monolauraat (Zie tabel van de materialen) gedurende 5 minuten te bebroed.
9. Breng 100 μL primair antilichaam, verdund met PBS, aan op elk monster, bedek het bakje met een deksel en incuberen 's nachts bij kamertemperatuur.
10. Was 3 keer met PBS-T (5 min voor elke wasbeurt).
11. Breng 100 μL secundair antilichaam verdund met PBS op elk monster aan en incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    Opmerking: gebruik voor anti-laminin kleuring Alexa Fluor 568-geconjugeerd secundair antilichaam. Voor anti-F4/80, anti-MCP-1, en anti-TNF-α, gebruik Alexa Fluor 568-of 488-geconjugeerd secundair antilichaam.
12. Was 3 keer met PBS-T (5 min voor elke wasbeurt).
13. Breng 100 μL DAPI-oplossing verdund met PBS-T op elk monster aan en incuberen gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
14. Was 3 keer met PBS-T (5 min voor elk).
15. Monteer de samples met afdekmedium en dek ze af met dekstroken.

5. histo-Morfometrische analyse van gastrocnemius

1. Plaats de monster glaasjes op een fluorescentiemicroscoop (Zie tabel met materialen) en Bekijk de monsters met een 20 × doelstelling met geschikte filters (DAPI-B, 360/40 nm voor excitatie en 460/50 nm voor emissie; GFP-B, 470/40 nm voor excitatie en 535/50 nm voor emissie; FRITC, 540/25 nm voor excitatie en 605/55 nm voor emissie.
2. Gebruik de software voorbeeld analyse (Zie tabel met materialen), meet het transversale gebied (CSA) van elke myofiber en Tel het aantal F4/80-, MCP-1-en TNF-α-positieve cellen.
   Opmerking: Bepaal de CSA van elke myofiber door het traceren van de interne marge van het kelder membraan gevisualiseerd met anti-laminin-2-immunokleuring.

Resultaten

In overeenstemming met onze eerdere observaties¹², werd de CSA van gastrocnemius myovezels significant verlaagd door de hindledemaat immobilisatie (Figuur 2A, B). Bovendien onthulde onze immunofluorescentie kleurings analyse dat cellen die MCP-1 en TNF-α uitdrukken, beide belangrijke rollen spelen bij het reguleren van ontstekingsprocessen^13,14, significant verhoogd in gastrocnemius spier weef...

Discussie

We hebben een methode beschreven voor het toepassen van een massage-achtige mechanische stimulus, die ontstekingsremmende effecten heeft. Ons systeem heeft de volgende voordelen, zelfs in vergelijking met de eerder gerapporteerde. Ten eerste, eerdere studies niet kwantificeren de mechanische krachten toegepast² of gedefinieerd hun magnitudes op basis van de meting op het lichaamsoppervlak, maar niet in de weefsels¹⁰. In tegenstelling, we gemeten intramusculaire druk met beh...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aluminiumdraad	DAISO JAPAN	B028	Een aluminiumdraad wordt gebruikt om beperking door de draad te voorkomen
Bloeddruk telemeter	Millar	SPR-671	Een bloeddruk telemeter wordt gebruikt om intramusculaire druk te meten.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI is een fluorescerende sonde die vaak wordt gebruikt om DNA te kleuren voor fluorescentiemicroscopie.
Geiten anti-konijn Alexa Fluor 488 (Verdunningsverhouding, 1:500)	Invitrogen	A11034	Antilichaam voor immunohistochemisch kleuring.
Geiten anti-rat Alexa Fluor 568 (Verdunningsverhouding, 1:500))	Invitrogen	A11077	Antilichaam voor immunohistochemische kleuring.
ImageJ	NIH	N/A	Analysesoftware voor beeld
LabChart8	ADInstruments		Analysesoftware voor het verwerven van biologische signalen.
Prolong gold	Thermo Fisher Scientific	P36930	Prolong gold is voor het plaatsen van gekleurde monsters.
Proteïne Block Serum-Free	Dako	X090930-2	Voor het blokkeren van niet-specifieke achtergrondkleuring in immunohistochemische procedures.
Ratten monoklonaal anti-laminine-2 antilichaam (Verdunningsverhouding, 1:1000)	Sigma Aldrich	L0663	Antilichaam voor immunohistochemische kleuring.
Ratten monoklonaal anti-F4/80 antilichaam (Verdunningsverhouding, 1:500)	Abcam	ab6640	Antilichaam voor immunohistochemische kleuring.
Konijn polyklonaal anti-MCP-1 antilichaam (Verdunningsverhouding, 1:1000)	Abcam	ab25124	Antilichaam voor immunohistochemische kleuring.
Konijn polyklonaal anti-TNF-α antilichaam (Verdunningsverhouding, 1:1000)	Abcam	ab66579	Antilichaam voor immunohistochemische kleuring.
Chirurgisch tape	3M Japan	1530EP-0	Chirurgisch tape wordt gebruikt om gewrichtsbeweging te beperken.