Imaging integrine spanning en cellulaire kracht bij Submicron resolutie met de Sensor van een integratieve spanning

Yuanchang Zhao; Nathaniel  M. Wetter; Xuefeng Wang

doi:10.3791/59476

Method Article

Imaging integrine spanning en cellulaire kracht bij Submicron resolutie met de Sensor van een integratieve spanning

DOI:

10.3791/59476

⸱

April 25th, 2019

Yuanchang Zhao¹ , Nathaniel M. Wetter¹ , Xuefeng Wang²

¹Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, ²Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Integrine spanning speelt belangrijke rol in verschillende functies van de cel. Met de sensor van een integratieve spanning, is integrine spanning gekalibreerd met picoNewton (pN) gevoeligheid en beeld bij submicron resolutie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleculaire spanning langs integrine-ligand obligaties is het fundamentele mechanische signaal in het integrine-traject dat belangrijke rol in de vele functies van de cel en gedrag speelt. Als u wilt kalibreren en afbeelding van integrine spanning met hoge kracht gevoeligheid en ruimtelijke resolutie, ontwikkelden we een integratieve spanning sensor (ITS), een fluorescerende spanning op basis van DNA-sensor. Het ITS is geactiveerd om lichten als een moleculaire spanning, ondersteunen kracht dus omzetten in fluorescerende signaal op moleculair niveau. De drempel van de spanning voor ITS activering is afstembare in de range van 10 – 60 pN die goed dekt het dynamisch bereik van integrine spanning in cellen. Op een substraat met een ITS geënt, is de spanning van integrine Adherente cellen gevisualiseerd door fluorescentie en beeld bij submicron resolutie. Het ITS is ook compatibel met structurele beeldvorming van de cel zowel vaste cellen in levende cellen. Het ITS is met succes toegepast op de studie van bloedplaatjes contractie en cel migratie. Deze paper detailleert de procedure voor de synthese en de toepassing van ITS in de studie van integrine overdraagbare cellulaire kracht.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen, is afhankelijk van integrins houden en uitoefenen van cellulaire krachten aan de extracellulaire matrix. Integrine-gemedieerde cel adhesie en kracht overdracht zijn cruciaal voor cel verspreiding van¹^,², migratie³^,⁴en⁶^,⁷van de⁵^,van de overleving. Op de lange termijn beïnvloedt integrine biomechanische signalering ook cel proliferatie⁸^,⁹^,¹⁰ en differentiatie

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC, 8-16-8333-I) van de Iowa State University.

1. synthese van de integratieve spanning sensor

Aanpassen en bestellen van ssDNAs (Zie de Tabel van de materialen).
Opmerking: De ssDNA-sequenties zijn als volgt. Het bovenste deel is /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. De lagere strengen zijn als volgt.
12 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio//5Cy3 /
23 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT//5Cy3/CCC
33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de ITS, werd de integrine spanning kaart van vis keratocytes gevangen. Hieruit blijkt dat een keratocyte migreert en integrine spanning op twee kracht tracks (figuur 2A genereert). De resolutie van de kaart van kracht was gekalibreerd om 0.4 µm (figuur 2B). Hoge integrine spanning concentreert zich op de achterste marge (figuur 3A). ITS toont ook verschillende specifieke patronen van verschillend.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ITS is een zeer toegankelijke maar toch krachtige techniek voor mobiele dwingen toewijzing in termen van zowel de synthese en de toepassing. Met alle materialen klaar, kan de ITS gesynthetiseerd worden binnen 1 dag. Tijdens experimenten, zijn slechts drie stappen van de oppervlaktelaag nodig voorafgaand aan cel beplating. Onlangs, we verder vereenvoudigd de coating procedure naar een stap door de ITS rechtstreeks te koppelen aan bovien serumalbumine, waardoor directe fysieke adsorptie van ITS glas of polystyreen oppe.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door het opstarten Fonds verstrekt door Iowa State University en door het National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA-biotin	Sigma-Aldrich	A8549
Neutravidin	Thermo Fisher Scientific	31000
Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	434301
upper strand DNA	Integrated DNA Technologies	N/A	Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA	Integrated DNA Technologies	N/A	Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group	Peptides International	PCI-3696-PI
IMDM	ATCC	‎62996227
FBS	ATCC	302020
Penicillin	gibco	15140122
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706
200 uL petri dish	Cellvis	D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	N/A	spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit	Hoefer	SE410-15-1.5	Device for electroporesis
CHO-K1 cell line	ATCC	CCL-61
NIH/3T3 cell line	ATCC	CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody	EMD Millipore	90227	Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A28175	Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen	A22287
Eclipse Ti	Nikon	N/A	microscope

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Imaging integrine spanning en cellulaire kracht bij Submicron resolutie met de Sensor van een integratieve spanning

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles