Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Driedimensionale patroon van gemanipuleerde biofilmen met een doe-het-zelf bioprinter

9.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59477

⸱

16 mei 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bionanoscience & Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 2Department of Biology, University of Rochester

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een methode voor het transformeren van een goedkope commerciële 3D-printer in een bacteriële 3D-printer die het afdrukken van gedessineerde biofilmen kan vergemakkelijken. Alle noodzakelijke aspecten van de voorbereiding van de bioprinter en bio-Ink worden beschreven, evenals verificatiemethoden om de vorming van biofilmen te beoordelen.

Samenvatting

Biofilms zijn aggregaten van bacteriën ingebed in een zelf geproduceerde ruimtelijk-patroon extracellulaire matrix. Bacteriën in een biofilm te ontwikkelen verbeterde antibioticaresistentie, die potentiële gevaren voor de gezondheid vormt, maar kan ook gunstig zijn voor milieu-toepassingen, zoals zuivering van drinkwater. De verdere ontwikkeling van anti-bacteriële therapeutische en biofilm-geïnspireerde toepassingen zal de ontwikkeling van reproduceerbare, ingenieurable methodes voor biofilm verwezenlijking vereisen. Onlangs is een nieuwe methode van biofilm voorbereiding met behulp van een aangepaste driedimensionale (3D) printer met een bacteriële inkt is ontwikkeld. Dit artikel beschrijft de stappen die nodig zijn om deze efficiënte, goedkope 3D bioprinter die meerdere toepassingen in bacteriële-geïnduceerde materiaal verwerking biedt te bouwen. Het protocol begint met een aangepaste commerciële 3D-printer waarin de extruder is vervangen door een bio-inkt dispenser aangesloten op een spuitpomp systeem waardoor een controleerbare, continue stroom van bio-inkt. Om een bio-inkt te ontwikkelen die geschikt is voor het drukken van biofilm, werden de gemanipuleerde bacteriën van Escherichia coli opgeschort in een oplossing van alginaat, zodat zij in contact met een oppervlakte stollen die calcium bevat. De opneming van een inductor chemisch product binnen het druk substraat drijft uitdrukking van biofilm proteïnen binnen de gedrukte bio-inkt. Deze methode maakt het mogelijk 3D-afdrukken van verschillende ruimtelijke patronen, bestaande uit discrete lagen van gedrukte biofilmen. Dergelijke ruimtelijk gecontroleerde biofilmen kunnen als modelsystemen dienen en kunnen toepassingen in veelvoudige gebieden vinden die een brede invloed op de maatschappij, met inbegrip van antibiotische weerstands preventie of drinkwaterreiniging, onder anderen hebben.

Inleiding

Er is momenteel een toenemende behoefte aan milieuvriendelijke, duurzame oplossingen te ontwikkelen voor de productie van ruimtelijk gedessineerde materialen, als gevolg van het groeiende aantal markten voor dergelijke materialen1. Dit artikel stelt een eenvoudige, economische methode voor de productie van dergelijke materialen voor en biedt daarom een groot spectrum van toekomstige toepassingen aan. De hier gepresenteerde methode maakt het mogelijk driedimensionale (3D) afdrukken van ruimtelijke structuren met behulp van een bio-inkt met levende bacteriën. Bacteriën blijven levensvatbaar binnen de gedrukte structuren voor meer dan een week, waardoor de bacteriën om natuurlijke of engineered metabole activiteiten uit te voeren. Gedrukte bacteriën kunnen daardoor de gewenste componenten binnen de gedrukte structuur produceren en deponeren, bijvoorbeeld het creëren van een functionele cross-linked biofilm2.

Traditionele methoden voor de productie van geavanceerde materialen te betrekken hoge energie-uitgaven (bijv. hoge temperaturen en/of druk) en kan produceren grote hoeveelheden chemisch afval, vaak toxische stoffen die kosten-uitgebreid gebruik vereisen3 ,4. In tegenstelling, meerdere bacteriële soorten zijn in staat om materialen die gemakkelijk toepasbaar kunnen zijn in verschillende industrieën te produceren. Deze materialen omvatten polymeren zoals polyhydroxyalkanoaten (PHA)5 of poly (glycolide-co-lactide) (PGLA)6, bacteriële cellulose7, bacteriële concrete materialen8, Biomimetic composieten9, amyloid lijmen10, of Bio-based elektrische schakelingen11, onder anderen. Bovendien, bacteriële productie van waardevolle materialen meestal plaatsvindt op bijna-omgeving temperaturen en druk en in waterige omgevingen, zonder dat of het produceren van toxische verbindingen. Terwijl de productie van materialen met bacteriën is aangetoond in de literatuur en sommige industriële toepassingen zijn al naar voren gekomen12,13, een betrouwbare methode voor ruimtelijke patroon van dergelijke materialen blijft een uitdaging.

Dit artikel toont een rechttoe rechtaan methode van het omzetten van een goedkope commerciële 3D-printer in een 3D-bacteriële printer. Het protocol laat zien hoe u een bio-inkt voor te bereiden met en het behoud van de levende bacteriën, alsmede hoe substraten op waarop de 3D-druk kan worden uitgevoerd voor te bereiden. Deze methode is geschikt om te gebruiken met een verscheidenheid van natuurlijke en gemanipuleerde bacteriestammen in staat om materialen te produceren. Deze bacteriën kunnen ruimtelijk worden verdeeld binnen een 3D-gedrukte structuur en nog steeds hun metabole activiteit, die zal resulteren in een ruimtelijke verdeling van de gewenste materialen geproduceerd door de bacterie.

Deze drukmethode maakt additieve productie van biofilmen, aggregaten van bacteriën omgeven door een zelf geproduceerde extracellulaire matrix. Biofilms zijn heterogene 3D-netwerken waarin eiwitten, polymeren, bacteriële cellen, zuurstof en voedingsstoffen zijn allemaal ruimtelijk gestructureerd14. Terwijl in de vorm van een biofilm, bacteriën vertonen een verhoogde antibioticaresistentie en structurele robuustheid, waardoor ze moeilijk uit te roeien van oppervlakken, waaronder medische katheters en implantaten. De sleutel tot biofilm eigenschappen, en ook de grootste uitdaging voor biofilm onderzoek, lijkt de heterogeniteit van de biofilmen15,16,17. De productie van ruimtelijk gecontroleerde model biofilmen is van bijzonder belang omdat het de ruimtelijke patronen van biofilm componenten zou kunnen reproduceren of afstemmen, waardoor het begrip van de stabiele afzetting van biofilmen op vrijwel elk oppervlak in Aard.

Dit artikel presenteert een methode voor de productie van biofilmen met behulp van 3D-gedrukte hydrogels met gemanipuleerde E. coli bacteriën die biofilm eiwitten te produceren in de aanwezigheid van een inductor, alsmede de methoden van verificatie van de biofilm formatie2 . De belangrijkste extracellulaire matrix componenten van deze biofilmen zijn curli kuller amyloid vezels18 die zelf-geassembleerd CsgA eiwitten bevatten. Wanneer de ontworpen E. coli bacteriën worden bewogen om CsgA proteïnen uit te drukken, vormen zij een stabiel model biofilm dat de cellen tegen wordt weggespoeld van de drukoppervlakte beschermt. Een dergelijke 3D gedrukte biofilm kan ruimtelijk worden gecontroleerd en kan dienen als een nuttig onderzoek instrument voor het onderzoek van multischaalde biofilm structuur-functie mechanica of materiomics19. Deze op maat gemaakte biofilmen zullen het begrip van de principes van biofilm vorming en hun mechanische eigenschappen helpen, die verder onderzoek naar de mechanismen van antibiotische weerstand onder andere toepassingen toelaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. conversie van een commerciële 3D-printer in een 3D-bioprinter

  1. Verwijder de extruder en de kachel van een commerciële 3D-printer (delijst van materialen) van de printer frame, en haal de bedrading regelen van deze elementen van de belangrijkste printplaat (Figuur 1a). Aangezien de sensor die de operationele temperatuur van de printer controleert moet functioneel zijn om met de printersoftware te communiceren, uit de druk software het algoritme verwijderen dat vertragingen druk tot de operationele temperatuur wordt bereikt.
  2. Verbind een pipet uiteinde (200 µ L tip) via siliconen buizen (binnendiameter van 1 mm) tot een 5 mL spuit in een spuitpomp. Monteer de pipet tip op de 3D-printer extruder hoofd als een vervanging voor de originele extruder (Figuur 1b).
  3. Als er meer dan een type van bio-inkt zal worden gebruikt, monteren extra buizenstelsel (s) en pipet tip (s) op de printer.

2. ondergrond voorbereiding voor 3D printen

  1. Voeg 4 mL 5 M CaCl2 oplossing toe aan 400 ml van 1% w/v agar opgelost in Luria-Bertani Bouillon (lb) medium, aangevuld met passende antibiotica en inducerende (hier 34 µ g/ml chlooramfenicol en 0,5% rhamnose).
  2. Doseer 20 mL van de LB-agar oplossing in elke 150 mm x 15 mm Petri schaaltje. Droog 30 min bij kamertemperatuur met het deksel half open.
    Opmerking: het protocol kan hier onderbroken worden door deze druk substraten op te slaan bij 4 °C gedurende maximaal enkele dagen.

3. bio-inkt voorbereiding

  1. Bereid een natrium alginaat oplossing (3% w/v), en verhit naar het kookpunt drie keer om de oplossing te steriliseren. Opslag bij 4 °C tot gebruikt.
  2. Grow e. coli MG1655 Pro ΔcsgA ompR234 (e. coli ΔcsgA) bacteriën die plasmiden pSB1C3-groene fluorescente proteïne (GFP) (constitutieve GFP uitdrukking)2 of pSB1C3-GFP-CsgA (constitutieve GFP uitdrukking, rhamnose-afleidbaar CsgA expressie) overnachting bij 37 °C met schudden bij 250 rpm in 50 mL van LB medium met 34 µ g/mL chlooramfenicol en 0,5% rhamnose.
  3. Centrifugeer de cel cultuur voor 5 min bij 3.220 x g om de bacteriën te korrelen. Verwijder de bovendrijvende.
  4. Re-Suspend de bacterie pellet in 10 mL LB medium en voeg 10 mL natrium alginaat (3% w/v).

4.3D drukproces

  1. Installeer en open de software voor 3D-afdrukken (delijst met materialen) op een computer. Sluit de 3D-printer aan op de computer. Verplaats de printkop naar de thuis positie door op de knop ' Startpagina ' te klikken voor de X-, Y-en Z-as.
  2. Plaats voor elke afdruk een voor bereide druk substraat op een bepaalde locatie op het afdruk bed.
  3. Kalibreer de hoogte van de printkop in de Z-as.
    1. Verhoog de printkop tot een hoogte van 22 mm onder handmatige controle, zodat het niet zal botsen met de rand van de petrischaal bij het verplaatsen naar de gewenste positie. Plaats de printkop overtop van de plaat en verplaats deze naar beneden tot de pipet-Tip contact met het afdruk oppervlak heeft. Wijs deze Z-as-positie toe als Z1 (de hoogte van het afdruk oppervlak).
    2. Verhoog de printkop en verplaats deze buiten het plaat gebied door handmatige bediening in de X-, Y-en Z-as. Als de werkafstand tussen de printkop en het plaatoppervlak wordt gedefinieerd als Z2, voert u Z1 + Z2 in het afdruk programma in als de Z-waarde tijdens het afdrukken.
  4. Programma de drukvorm door een zelf-ontwikkelde punt-voor-punt coördinaat-bepaalde methode volgens het gewenste traject.
    1. Als het gewenste traject een rechte lijn is, definieer dan alleen de begin-en eindpunten. Inclusief extra punten op gebogen lijnen zal resulteren in vloeiender bochten. Verplaats de printkop handmatig naar elk punt sequentieel, en noteer de coördinaten van deze punten in volgorde. Voer al deze coördinaten en de printkop bewegende snelheid voor elk gedrukt segment in de G-code-editor.
  5. Voor en na het afdrukken, til de printkop op een afstand hoger dan de plaat rand (20 mm), en beweeg direct uit de plaat regio. Sla dit programma op als een G-codebestand en laad het direct voor gebruik in volgende afdrukken, terwijl u de hoogte van de Z-as opnieuw meet voor elk nieuw substraat.
    Opmerking: Zie tabel 1 voor een voorbeeld G-code voor het afdrukken van een vierkant.
  6. Laad het voorgeprogrammeerde G-codebestand. Open de G-code editor in de software, en het programma in de commando's voor het afdrukken van de gewenste vorm. Op elke opdrachtregel kan de positie van de printkop worden gewijzigd in de X-, Y-en/of Z-as. Voer de Z-waarde tijdens alle druk stappen in als Z1 + Z2 (hoogte van drukoppervlak + werkafstand).
    Opmerking: de bewegende snelheid is ook instelbaar; 9.000 mm/min is een geschikte waarde voor typische printsnelheden.
  7. Laad de vloeibare bio-inkt in de spuit (en) en monteer ze in de spuitpomp (en) van de 3D bioprinter.
  8. Druk de bio-inkt af op het druk substraat door op de knop afdrukken te klikken.
  9. Tijdens het afdrukken, controle van de printkop beweging volledig door de software. De spuitpomp handmatig starten voordat de printkop in contact komt met het drukoppervlak.
    Opmerking: de coördinatie van de spuitpomp en de printer wordt empirisch bepaald afhankelijk van de extrusie snelheid, de snelheid waarmee de printkop naar het eerste afdruk punt gaat en de beginpositie van de printkop. Als de oorspronkelijke printkop positie 20 mm bedraagt, met een printkop snelheid van 9.000 mm/min en een extrusie-snelheid van 0,1 mL/h, start u de spuitpomp onmiddellijk nadat het afdrukken is gestart. Als de extrusie snelheid wordt gewijzigd van 0,1 mL/h tot 0,3 mL/h, wacht dan 2 − 3 s om de spuitpomp te starten nadat het afdrukken is gestart.
  10. Stop de spuitpomp zodra de printkop bij het laatste afdruk punt aankomt. Stop de spuitpomp voordat de printkop opheft aan het einde van het drukproces, anders overtollige bio-inkt zal dalen op de drukkerij substraat en vermindering van de afdrukresolutie.
  11. Voor de bouw van 3D-structuren, de controle van alle bewegingen van de printkop in de G-code-editor. Typ de afdruk hoogte van de eerste laag. Verhoog de Z-waarde in de G-code met 0,2 millimeter voor de tweede laag om de afdruk hoogte te verhogen. Daarna, Verhoog de Z-waarde met 0,1 millimeter wanneer het bewegen zich aan een hogere laag. Verplaats de plaat niet tijdens het drukproces.
  12. Voor het meten van de breedte en hoogte van de gedrukte hydrogel, gebruik een stalen liniaal geplaatst onder of naast het monster.

5. kweken en testen van de effectiviteit van de productie van biofilm door E. coli

  1. Incubeer de gedrukte monsters bij kamertemperatuur voor 3 − 6 dagen om de productie van biofilm componenten (curli kuller vezels) mogelijk te maken. Afbeelding van de platen met behulp van een camera of TL-scanner.
  2. Voor het oplossen van de alginaat matrix, Voeg 20 mL van 0,5 M natrium citraat oplossing (pH = 7 aangepast met NaOH) aan de druk substraten, en incubeer voor 2 uur met 30 rpm schudden bij kamertemperatuur. Gooi de vloeistof en het beeld van de platen weer te vergelijken met de beelden van de platen voor citraat behandeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De eerste stap voor een succesvolle 3D-druk van biofilmen is het omzetten van een commerciële 3D-printer in een bioprinter. Deze conversie wordt bereikt door het verwijderen van de extruder en de kachel van de printer, ontworpen voor het afdrukken met een polymere inkt, en het vervangen van deze met componenten die geschikt zijn voor het afdrukken van bio-inkt met levende bacteriën (Figuur 1a). De extruder wordt vervangen door een pipet tip (of tips, als meer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol hier gepresenteerd voor 3D-afdrukken van gemanipuleerde biofilms heeft twee kritieke stappen. Eerst is de voorbereiding van de agar drukoppervlakte, die de meest kritieke factor aan het produceren van een specifieke druk resolutie is. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het drukoppervlak plat is en dat het pipet uiteinde op de printkop op de juiste hoogte van het oppervlak is geplaatst. Als de oppervlakte niet vlak is, zal de het werkafstand tijdens het drukproces veranderen. Als de werkafstand kleiner...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door een AOARD toelage (nr. FA2386-18-1-4059), de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO/OCW) als onderdeel van de grenzen van het programma van de nanowetenschap, en het Advanced Materials NWO-NSFC programma (No. 729.001.016). De auteurs erkennen laboratorium hulp van Ramon van der Valk en Roland Kieffer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3D printerCoLiDo3D-P Kit
3D printing softwareCoLiDoPrint-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
AgarSigma-Aldrich05040
CaCl2 dihydrateSigma-AldrichC7902
CentrifugeEppendorf5810 R
ChloramphenicolSigma-Aldrich3886.1
LB broth powderSigma-AldrichL3022
Orbital shakerVWR89032-092Model 3500
Petri dishVWR25384-326150 x 15 mm
RhamnoseSigma-Aldrich83650
Silicon tubingVWR DENE 3100103/25
Syringe pumpProSense B.V. NE-300
Sodium alginateSigma-AldrichW201502
Sodium citrate monobasicSigma-Aldrich71498
Sodium hydrooxideVWR28244.295

Referenties

  1. Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
  2. Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
  3. Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
  4. Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287(2017).
  5. Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
  6. Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
  7. Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860(2017).
  8. Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
  9. Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
  10. Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
  11. Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
  12. Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
  13. Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
  14. Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
  15. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
  16. Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
  17. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  18. Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
  19. Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
  20. Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
  21. Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
  22. Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
  23. Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
  24. Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
  25. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  26. Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D bioprinterBiofilmprintenAlginaat bio inktEscherichia coliZ as kalibratieSpuitpompCurli expressieNatriumcitraatPetrischaalG code editor
Driedimensionale patroon van gemanipuleerde biofilmen met een doe-het-zelf bioprinter
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.