Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide intestinale Organoids te bestuderen en te wijzigen epitheel cel bescherming tegen salmonella en andere pathogenen

Samenvatting

Human geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide intestinale organoids bieden spannende mogelijkheden om te modelleren van ziekten in vitro. We tonen de differentiatie van hiPSCs in intestinale organoids (iHOs), de stimulatie van deze iHOs met cytokines, en de microinjectie van salmonella typhimurium in de iHO lumen, waardoor de studie van een epitheel invasie door deze Pathogen.

Samenvatting

De intestinale ' organite ' (iHO) systeem, waarin 3-D structuren vertegenwoordiger van de epitheel bekleding van de menselijke darm kan worden geproduceerd uit de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) en onderhouden in de cultuur, biedt een spannende kans om te vergemakkelijken de modellering van de epitheel reactie op enterische infecties. In vivo, intestinale epitheelcellen (IECs) spelen een belangrijke rol bij de regulering van de intestinale homeostase en kan direct remmen pathogenen, hoewel de mechanismen waarmee dit gebeurt zijn niet volledig opgehelderd. De cytokine interleukin-22 (IL-22) is aangetoond dat een rol spelen in het onderhoud en de verdediging van de darmepitheel barrière, met inbegrip van het induceren van een release van antimicrobiële peptiden en chemokines in reactie op infectie.

We beschrijven de differentiatie van gezonde controle hiPSCs in iHOs via de toevoeging van specifieke cytokine combinaties om hun cultuurmedium voordat inbedding ze in een kelder membraan matrix op basis van prointestinale cultuursysteem. Eenmaal ingebed, de iHOs worden geteeld in de media aangevuld met Noggin, R-spondin-1, epidermale groeifactor (EFG), CHIR99021, prostaglandine E2, en Y-27632 betahistinedihydrochloride monohydraat. De wekelijkse passages door hand verstoring van iHO fijnstructuur leiden tot de vorming van ontluikde iHOs, met wat die een crypt/vlokken structuur tentoonstellen. Alle iHOs tonen een gedifferentieerd epitheel bestaande uit beker cellen, enteroendocrine cellen, Paneth cellen, en gepolariseerd enterocyten, die kan worden bevestigd via immunokleuring voor specifieke markers van elke cel subset, transmissie elektronenmicroscopie (TEM), en kwantitatieve PCR (qPCR). Om infectie te modelleren, salmonella ENTERICA Serovar typhimurium SL1344 zijn microinjected in het lumen van de iHOs en uitgebroed voor 90 min bij 37 ° c, en een aangepaste gentamicine bescherming assay wordt uitgevoerd om de niveaus van intracellulaire identificeren bacteriële invasie. Sommige iHOs zijn ook voorbehandeld met recombinant Human IL-22 (rhIL-22) voorafgaand aan de infectie om vast te stellen of dit cytokine is beschermend tegen salmonella -infectie.

Inleiding

In de afgelopen jaren, de studie van gastheer-pathogeen interacties is versterkt door de ontwikkeling van ' organite ' modellen, waarin 3-D voorstellingen van het intestinale epitheel kan worden geproduceerd uit verschillende progenitoren. ' Primaire ' organoids kan direct worden gegenereerd uit intestinale stamcellen geoogst uit intestinale biopten. Daarnaast kan intestinale organoids worden opgewekt uit hiPSCs. Hetzelfde kan worden gezegd van een groot aantal weefsels, met maag¹,^{Lever 2}, pancreas^3,4, hersenen^5,6, Lung⁷, en prostaat⁸ organoids gebruikt door veel onderzoekers te modelleren Ziekte. Er zijn tal van spannende toepassingen van de organite systeem, met inbegrip van modellering kanker⁹ en drug screening¹⁰, maar hier richten we ons op het gebruik van iHOs als een infectie model, met behulp van S. enterica Serovar typhimurium (S. Typhimurium) als voorbeeldige ziekteverwekker en voor behandeling met IL-22 als therapie.

In deze studie, de hiPSCs gebruikt voor het genereren van iHO zijn ' Kolf2 ' iPSCs, gegenereerd uit een gezond individu en verkrijgbaar bij de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Initiative Consortium (HipSci; www.hipsci.org), een Open-Access Reference panel van gekenmerkt hiPSC lijnen¹¹. Een voordeel van het gebruik van hiPSCs als progenitoren voor organoids is dat er nu uitgebreide banken van gezonde donor iPSC lijnen beschikbaar, wat betekent dat de resultaten kunnen worden gevalideerd in een aantal cel lijnen met verschillende genetische achtergronden. Bovendien, indien onderzoekers willen kijken naar specifieke ziekte-geassocieerde enkelvoudige nucleotide polymorfismen (SNPs), is het mogelijk om chips te gebruiken/Cas9 om mutaties ingenieur in een gezonde cel lijn, waardoor zowel een mutant lijn en het behoud van de isogenic controlelijn voor vergelijking¹². In onze ervaring, hiPSC-afgeleide intestinale organoids zijn groter in omvang dan hun primaire tegenhangers en meer consistent in de cultuur, waardoor voor een minder technisch uitdagende Microinjection en mogelijk waardoor een meer divers scala van pathogenen te worden Studeerde. iHOs kan worden cryogene bewaard, en we hebben gepropageerd iHO culturen voor maximaal een jaar om materiaal te produceren voor experimenten.

In vivo, IECs spelen een belangrijke rol in het reguleren van intestinale homeostase en kan direct remmen pathogenen, hoewel de mechanismen waarmee dit gebeurt zijn niet goed begrepen. De cytokine IL-22 is bekend dat een rol in het onderhoud van de darmepitheel barrière¹³ hebben en is betrokken bij de inductie en secretie van antimicrobiële peptiden en chemokines in reactie op infectie¹⁴. Het wordt geproduceerd door geactiveerde T-cellen (in het bijzonder, Th17 cellen), alsmede door Natural Killer (NK) cellen en bindt aan een heterodimere receptor bestaat uit IL-22R1 en IL-10R2 subeenheden¹⁵. De receptor voor IL-22 wordt uitgedrukt basaal op IECs, betekenend dat in het iHO model, het mogelijk is om organoids met rhIL-22 door zijn toevoeging aan cultuurmiddel¹⁶eenvoudig voor te behandelen. Één nadeel van het organite systeem is dat het de bijbehorende immune reactie mist die normaal door andere immune cel types wordt geleverd; echter, modellen zijn in opkomst die poging om organoids met intestinale lymfocyten om beter te vertegenwoordigen deze^17,18.

Het gebruik van de Microinjection systeem is de sleutel tot het simuleren van infecties in de iHO model, omdat dit maakt de directe levering van pathogenen aan de apicale oppervlak van het epitheel, zoals zou optreden in het geval van in vivo infectie. De toevoeging van fenol rood aan de bacteriële oplossing geïnjecteerd in de iHO markeert degenen die zijn geïnfecteerd, dus het vermijden van herhaalde injecties van dezelfde iHO. Organoids als schepen voor infectie modelleren groeien in gebruik, met pathogenen zoals pylori pylori,¹⁹ de Norovirus,²⁰ het rotavirus,²¹ Shiga toxine-producerende Escherichia coli²², Cryptosporidium²³, en de Zika virus²⁴ te hebben aangetoond om te overleven en te repliceren binnen deze systemen. Deze technologie zou kunnen worden toegepast op een breder scala van pathogenen, met name voor organismen die moeilijk zijn om de cultuur, zoals protozoa, of de mens beperkte pathogenen, met het oog op directe informatie over de menselijke epitheel reactie op infectie te verkrijgen.

Protocol

1. kweken en Passaging van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Opmerking: Alle methoden beschreven hier gebruik van commercieel beschikbare menselijke cel lijnen. Alle weefselcultuur werk hieronder beschreven moet worden gedaan in een klasse II laminaire stroming kap. iPSCs worden routinematig gehandhaafd in stamcellen kweekmedium (Zie de tabel van materialen), volgens de instructies van de fabrikant, die het mogelijk maakt een weekend-vrije cultuur van iPSCs. iPSCs kan worden aangepast van andere iPSC cultuursystemen met relatief gemak.

1. Passage de cellen zodra de kolonies dekking ongeveer 80% – 90% van het plaatoppervlak.
2. Bereid platen voor de passage 1 h vóór het gebruik door toevoeging van vitronectin 10 μg/mL verdund in Dulbecco fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS; zonder calcium [ca] of magnesium [mg]) aan weefsel-cultuur-behandelde platen. De volumes voor coating zijn afhankelijk van de plaatgrootte en zijn te vinden in de instructies van de fabrikant. Gedurende deze tijd, warme stamcellen cultuurmedium tot kamertemperatuur (RT).
3. Verwijder de media van de iPSCs klaar voor passage en was de cellen 2x met DPBS (zonder CA of mg).
4. Voeg EDTA-oplossing (Zie de tabel van materialen) aan de platen, zorg ervoor dat het gehele oppervlak is bekleed en Incubeer bij RT voor 5 – 8 min. Wanneer gaten beginnen te verschijnen in het midden van de iPSC kolonies, aspireren en gooi de EDTA-oplossing.
5. Voeg de cultuurmiddel van de stam cel aan de putten toe; verjagen de iPSCs door zachtjes wassen van de media over de plaat oppervlak een paar keer. De iPSCs worden doorgang als bosjes en niet als enkele cellen, dus zorg ervoor dat de EDTA-oplossing niet wordt overgelaten aan te lang. Verplaats elke verdreven iPSCs naar een 15 mL conische buis.
6. Aspireren de vitronectin van de voorgelakte platen en vervang deze door het stamcel kweekmedium. Omkeren van de iPSC schorsing een aantal keren om ervoor te zorgen dat de iPSCs niet hebben afgerekend op de bodem van de kegelvormige buis, en voeg het juiste volume van de schorsing om een 1:10 verdunning van de cellen op een nieuwe plaat te geven. Split ratio's kunnen worden aangepast, afhankelijk van de iPSC groeisnelheid, die kan variëren tussen iPSC lijnen.
7. Rock de plaat om de iPSCs over het oppervlak te verspreiden en plaats deze in een incubator op 37 °C/5% CO₂. Voer de iPSCs de dag na passaging.

2. differentiatie van iPSCs tot de dikke darm

1. Op dag 0, splits de iPSCs op een weefsel-cultuur behandelde schotel van 10 cm, voorgelakt met vitronectin zoals beschreven in stap 1,2, in 10 ml stamcel kweekmedium aangevuld met activin a (10 ng/ml) + basis fibroblastgroei factor (bFGF; 12 ng/ml). Voeg de groeifactoren direct voor gebruik toe aan de media; Doe dit in alle volgende stappen.
2. Op dag 1, verander de media (10 ml van het de cultuurmiddel van de stam cel met activin A [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]).
3. Op dag 2, begin de differentiatie door de media te veranderen in 10 ml stamcel kweekmedium aangevuld met de volgende groeifactoren: activin a (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), Bone morfogenetische Protein 4 (BMP-4; 10 ng/ml), phosphoinositol 3- kinase remmer LY294002 (10 μM), en GSK3 remmer CHIR99021 (3 μM).
4. Op dag 3, verander de media in 10 ml van het de cultuurmiddel van de stam cel dat met activin a (100 ng/ml) wordt aangevuld, bFGF (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml), en LY294002 (10 μM). Endoderm specificatie geïnduceerd door deze media moet resulteren in zichtbare veranderingen in de iPSC kolonie morfologie in de komende 24 uur.
5. Op dag 4, verander de media in 10 ml van RPMI/B27 media aangevuld met activin a (100 ng/ml) en bFGF (100 ng/ml).
   Opmerking: RPMI/B27 media bevat 500 mL RPMI medium met L-glutamine supplement (Zie tabel 1), 10 ml B27 supplement (50x, serumvrij) en 5 ml van niet-essentiële aminozuren. Optioneel: Voeg 5 mL penicilline-streptomycine (10.000 U/mL) toe. Filter-Steriliseer voor gebruik.
6. Op dag 5, verander de media in 10 ml van RPMI/B-27 media aangevuld met activin a (50 ng/ml).
7. Op dag 6, om te beginnen met het patroon van de achterste endoderm naar de dikke darm, verander de media tot 10 ml van RPMI/B27 media aangevuld met CHIR99021 (6 μm) + retinol zuur (3 μm).
8. Herhaal stap 2,7 op de dagen 7, 8en 9. Tijdens deze stappen, zichtbare 3-D structuren van de dikke darm moet duidelijk worden, met betrekking tot het oppervlak van de plaat.
9. Op dag 10, embed de resulterende dikke darm in de kelder membraan matrix (Zie de tabel van materialen).

3. inbedding van de dikke darm in de kelder membraan matrix

1. Make-up iHO basis groeimedia (500 mL van Advanced Dulbecco modified Eagle medium [DMEM]/F12, 10 mL B27 supplement [50x, serumvrij], 5 mL N2 supplement [100x, serumvrij], 5 mL 1 M 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), en 5 mL niet-essentiële aminozuren [100x]. Optioneel: Voeg 5 mL penicilline-streptomycine toe [10.000 U/mL]; filter-Steriliseer voor gebruik. Zie tabel 1).
2. Verwijder de media van de dikke darm plaat, en was de plaat 1x met DPBS (zonder CA of mg). Voeg 5 mL Collagenase oplossing toe aan de plaat en Incubeer bij 37 °C voor 5 min.
   1. Produceren Collagenase oplossing door toevoeging van 500 mg Collagenase IV poeder tot 400 mL van geavanceerde DMEM/F12. Na deze, voeg 100 mL van het serum vervangen (Zie de tabel van materialen), 5 ml L-glutamine (200 mm), en 3,5 l van 2-mercaptoethanol, en Swirl de oplossing te mengen. Filter-Steriliseer de oplossing zodra de Collagenase poeder volledig is opgelost.
      Opmerking: Dit kan worden opgeslagen bij-20 °C voor maximaal 6 maanden in kleinere fracties.
3. Activeer de Collagenase door 5 mL iHO basis groeimedia toe te voegen aan de plaat en schraap de dikke darmcellen met behulp van een cel schraper, het verzamelen van de dikke darm schorsing in een 15 mL conische buis.
4. Centrifugeer bij 240 x g voor 1 min en Pipetteer van de bovendrijvende.
5. Voeg 10 mL media toe, breek de dikke darm in kleinere stukjes door voorzichtig te pipetteren, en centrifugeer opnieuw bij 95 x g voor 1 min.
6. Was de cellen 2x in iHO basis groeimedia door het herhalen van stap 3,5. Hersuspendeer de cellen in een klein volume van de basis groeimedium (~ 300 – 500 l) en voeg ongeveer 100 l van deze oplossing toe aan 1,5 mL van de kelder membraan matrix. De matrix moet blijven op het ijs in deze tijd als het zal beginnen te stollen snel op RT.
7. Het opzetten van een 24-Well plaat op een plaat kachel op 37 ° c en spot uit 60 l in een put van de 24-Well plaat. Laat het kort in te stellen en controleer de dichtheid onder een microscoop.
   1. Indien nodig, voeg meer dikke darm oplossing om de kelder membraan matrix in stappen tot de gewenste concentratie wordt bereikt, en ter plaatse de oplossing in de resterende putten.
8. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 min; Voeg vervolgens 800 l van iHO base Growth media met groeifactoren toe aan elke put van de 24-Well plaat bij de volgende concentraties (Zie tabel 1): 500 ng/ml R-spondin-1, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml epidermale groeifactor (EFG), 3 μM CHIR99021, 2,5 μM prostaglandine E2, en 10 μM Y-27632 betahistinedihydrochloride monohydraat (ROCK remmer).
9. Verander de iHO base groeimedia om de 2 – 3 dagen, of onmiddellijk als de media begint te verkleuren. Na de eerste zaaien in de kelder membraan matrix, laat de iHOs te ontwikkelen voor 7 dagen voordat ze te splitsen. Door dag 3 – 4, moeten de afzonderlijke bollen in de cultuur zichtbaar zijn.
   1. Voor media verandering alleen, weglaten Y-27632, want dit is alleen nodig bij het splitsen/zaaien.

4. onderhoud en doorgang van iHOs

1. Om geleidelijke ontdooien, stak het vereiste volume van de kelder membraan matrix in een overdekte ijsemmer bij 4 ° c 's nachts, 24 uur voorafgaand aan de splitsing.
2. Verwijder de media van de iHOs en vervang deze met 500 l van de cel-hijs-oplossing (Zie de tabel van de materialen) per well. Incubeer bij 4 °C voor 40 – 50 min, op welk punt de iHOs in de oplossing zou moeten drijven.
   1. Optioneel: gebruik een in-Hood Imaging systeem om alleen iHOs te selecteren met de gewenste morfologie (Zie de tabel van de materialen).
3. Pipetteer de iHO/cel opheffende oplossing in 15 mL conische buizen en probeert de iHOs niet te breken. Laat de IHOs om te regelen voor 3 – 5 min en verwijder de bovendrijvende en enkele cellen.
4. Hersuspendeer de iHOs in 5 mL iHO basis groeimedium en pipet ze voorzichtig om te wassen. Centrifugeer bij 95 x g voor 2 min.
5. Het opzetten van een 24-Well plaat op een plaat kachel op 37 ° c in de kap.
6. Verwijder de bovendrijvende en hersuspendeer de iHOs in ~ 300 – 500 l van base groeimedia, met behulp van een P1000 pipet te breken de iHOs in kleinere brokken. Merk op dat de kracht die moet worden toegepast zal variëren afhankelijk van de iHO lijn en rijping staat, dus begin zachtjes, het verhogen van de kracht indien nodig.
7. Plaats ~ 100 l van de iHOs (het volume is afhankelijk van de dichtheid van de oplossing) in 1,5 mL van de kelder membraan matrix en pipet kort te mengen.
8. Spot uit 1 x 60 l van de kelder membraan matrix in een put van de 24-Well plaat, laat het stollen voor ~ 30 s, en controleer dan de dichtheid onder de Microscoop. Als de dichtheid te laag is, voeg meer iHOs aan de matrijs toe.
9. Herhaal stap 4,8 tot de juiste dichtheid is verworven, en dan ter plaatse de rest van de matrix in een 24-Well plaat.
10. Plaats het in een incubator bij 37 °C voor 10 min en, dan, overlay het met 800 l van de basis groeimedium met groeifactoren, zoals beschreven in stap 3,7.
11. Ter voorbereiding van de iHOs voor een invasie assay experiment (geschetst hieronder), passage de iHOs 4 – 5 dagen voorafgaand aan het experiment zoals beschreven in de stappen 4.1 – 4.10, maar plaats 120 l van de matrix iHO oplossing gegenereerd in stap 4,7 in 5 mm glasbodem microinjectie gerechten.
    1. In plaats van het verlaten van de iHO schorsing in een druppel als met routine passaging, verspreid de druppel over de bodem van de schotel om een dun laagje matrix te creëren. Bedek het met 2,5 mL basis groeimedium plus groeifactoren.
       Opmerking: Als antibiotica zijn gebruikt in de cultuurmedium, moeten deze worden verwijderd en vervangen door niet-antibioticum aangevuld media voor Microinjection experimenten.

5. voor stimulatie van iHOs met rhIL-22

1. Aspireren de media van de iHOs en vervang het met verse base groeimedia (die niet mogen bevatten antibiotica) 18 h voorafgaand aan de invasie assay.
2. Voeg rhIL-22 toe aan cultuurmedia tot een eindconcentratie van 100 ng/mL.

6. Microinjection van iHOs en intracellulaire invasie assays

1. Op de dag voorafgaand aan het experiment, het opzetten van S. Typhimurium SL1344 cultuur in 10 mL van Luria-Bertani Bouillon en Incubeer bij 37 °C 's nachts met schudden.
2. Op de dag van het experiment, als een microscoop met een gesloten warmte kamer beschikbaar is, zet hem aan en laat de temperatuur tot 37 ° c te bereiken voorafgaand aan het starten van de assay.
3. Verdun nachtelijke bacteriële culturen in DPBS (bevattend CA en mg) aan een optische dichtheid van 2 bij 600 nm (OD₆₀₀) en, dan, meng het 1:1 met fenol rood.
4. Laad de microinjectie schotel met iHOs op de Microscoop fase, verwijder het deksel, en breng de iHOs in focus, klaar voor de injectie om te beginnen.
5. Draai de injector en de arm controlestations aan. Zorg ervoor dat de injector is ingesteld op een druk van 600 kPa en een injectietijd van 0,5 s. Als het niet reeds weg van het Microscoop stadium wordt gesteund, roteer de injectie wapen om ervoor te zorgen het is.
6. Het opzetten van een 6 μm micro Injection boor Tip door het verwijderen van de verpakking en de plastic cilinder van de naald. Verwijder de grip hoofd uit de injecterende arm.
7. Laad de boor tip met 10 l van de entmateriaal, en grijp de boor Tip voorzichtig op zijn stompe uiteinde. Plaats de boor tip in de grip hoofd en bevestig het aan de Microinjection arm.
8. Beweeg de arm voorzichtig in de positie zodat de naald 1 – 2 cm boven de microinjectie schotel ligt. Gebruik de arm-regelaar om de naald Tip positie in het midden van de schotel en lager totdat het is net over het oppervlak van de media.
   1. Het programma van de arm controlestation om de naald terug te keren naar dit punt na alle injecties.
9. Focus de Microscoop op de iHOs en selecteer het doel te injecteren. Plaats de naald net boven en rechts van de iHO te worden geïnjecteerd en beweeg de naald naar beneden en lateraal in de iHO lumen.
10. Druk op de knop injecteren op de microinjector; de fenol-gekleurd bacteriële mengsel zal voortkomen uit de naald. Injecteren elke iHO 3x. Injecteren ten minste 30 iHOs per voorwaarde.
    Opmerking: Wegens heterogeniteit in iHO grootte en structuur binnen een cultuur, is het noodzakelijk om een groot aantal iHOs te injecteren om voor variatie te controleren.
11. Wanneer alle vereiste iHOs worden geïnjecteerd, verwijder de microinjectie plaat van het podium, vervang het deksel, en Incubeer de plaat bij 37 °C voor 90 min.
12. Na 90 min, aspireren de groeimedia en vervang deze door 3 mL cel hijs oplossing; Incubeer bij 4 °C voor 45 min.
13. Verplaats de iHOs/cel-hijs oplossing voorzichtig naar een 15 mL conische buis met 5 mL DPBS. Zorg ervoor dat alle geïnjecteerde iHOs zijn verwijderd van de plaat (spoel de plaat met 1 mL van de DPBS indien nodig). Centrifugeer bij 370 x g voor 3 min.
14. Verwijder de bovendrijvende en hersuspendeer de iHOs in de basis groeimedia met gentamicine op 0,1 mg/mL (Voeg 1 mL media toe; gebruik vervolgens een P1000 pipet ~ 50x te breken de iHOs, en voeg 4 mL van de verdere media).
15. Incubeer bij 37 °C voor 1 h om extracellulaire bacteriën te doden.
16. Centrifugeer de iHOs bij 370 x g voor 3 min en aspireren de bovendrijvende, waardoor zo weinig mogelijk. Was de iHOs 1x met DPBS en centrifugeer opnieuw.
    Opmerking: Deze stap verwijdert gentamicine, wat belangrijk is als alle resterende gentamicine kan doden intracellulaire bacteriën zodra de cellen zijn lysed.
17. Hersuspendeer de iHOs in 500 l van lysis buffer (Zie de tabel van de materialen) en scheid de organoids handmatig door het pipetteren van ~ 50x. Laat dit mengsel 5 min bij RT.
18. Serieel Verdun de resulterende oplossing 10-voudige in DPBS tot 10-¹, 10^-2, en 10^-3 concentraties te genereren. Pipetteer 3 x 20 l druppels van de nette en verdunde oplossingen op voorverwarmde LB agar platen.
19. Incubeer overnachten bij 37 °C en voer kolonie tellen en berekening van de kolonie-vormende eenheden (CFU) uit. Kolonie telt zal weerspiegelen de aantallen intracellulaire bacteriën die werden vrijgelaten tijdens de cel Lysing proces.

7. cel bevriezing en herstel

Opmerking: Zoals eerder opgemerkt, is het mogelijk om cryogene iHOs te behouden en te reconstrueren wanneer gewenst. De bevriezing en ontdooiing processen worden hieronder beschreven.

1. Selecteer de putten van iHOs u wilt bevriezen. Voeg cel opheffende oplossing aan de putten toe en incubeer voor 40 – 50 min bij 4 °C. De iHOs zou in de oplossing moeten drijven.
2. Pipet de iHOs voorzichtig in een conische buis van 15 mL en laat ze zich vestigen. Verwijder de media en was de iHOs 1x met basis groeimedia (geen groeifactoren).
3. Centrifugeer bij 95 x g voor 2 min, verwijder de bovendrijvende, en vervang het door een aangewezen volume van cel bevriezend middel (Zie de lijst van materialen; gebruik het medium volgens de instructies van de fabrikant), decanteren de iHOs in cryogene flacons.
   1. Bewaar de flacons in a-80 °C vriezer 's nachts om meer geleidelijke bevriezing mogelijk te maken; dan, breng ze naar vloeibare stikstof opslag.
4. Om de iHOs te reconstrueren, snel ontdooien een cryogene flacon bij 37 °C met behulp van een water/kraal bad; Pipetteer de inhoud voorzichtig in 10 mL basis groeimedia (geen groeifactoren). Laat de iHOs te vestigen en de media te vervangen door ~ 300 l van verse base groeimedia.
   1. NIET handmatig scheiden iHOs. Voeg iHOs aan kelder membraan matrix en plaat ze uit, zoals beschreven in punt 3.

Resultaten

Na het begin van het differentiatie proces, moeten de cellen passeren het stadium van de definitieve endoderm vorming, gevolgd door dikke darm patroon voorafgaand aan inbedding in de kelder membraan matrix. Sferoïden zal vormen en culturen met grote hoeveelheden van vervuilende materiaal zal duidelijk over een periode van enkele weken als de iHOs volwassen. Voorbeeld afbeeldingen van het differentiatie-, inbed-en passaging proces worden weergegeven in Figuur 1.

De opstelling van het Microinjection systeem is zoals aangetoond in Figuur 2. De iHOs zijn microinjected met de fenol rood/bacteriële oplossing en behouden hun rode kleur, waardoor de identificatie van geïnfecteerde iHOs om dubbele injecties te voorkomen. Tellingen van vergulde intracellulaire bacteriën worden uitgevoerd naar aanleiding van de gewijzigde gentamicine bescherming assay; voor stimulatie met rhIL-22 beperkt de S. Typhimurium infectie, met minder intracellulaire bacteriën waargenomen na rhIL-22 behandeling (Figuur 3). We hebben ook routinematig proces geïnfecteerde iHOs voor immunokleuring, of TEM, om de visualisatie van host IEC-bacteriële interacties (Figuur 4) te vergemakkelijken.

Figuur 1: gerichte differentiatie van iPSCs tot iHOs. Representatieve opeenvolging van differentiatie van iPSCs aan iHOs, die de morfologische waargenomen veranderingen en de groeifactoren demonstreert die worden vereist om deze veranderingen te drijven. De definitieve endoderm wordt gevormd bij dag 4 van de differentiatie, na blootstelling aan specifieke concentraties van combinaties van activin A, FGF, BMP-4, LY294002, en CHIR99021. Na 8 dagen, het patroon van deze definitieve endoderm met specifieke concentraties van CHIR99021 en retinol zuur resulteert in dikke darm vorming. Postembedding, sferoïde vorming wordt waargenomen. Na aanhoudende passaging met behulp van een ondersteunende kelder membraan matrix bedekt met medium aangevuld met prointestinale proliferatie factoren R-spondin 1, Noggin, EFG, CHIR99021, en prostaglandine E2, de sferoïden vooruitgang in de budded iHOs. (Beelden werden genomen op 4x-10x vergroting). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Microinjection van een iHO met S. Typhimurium. (A) het Microinjection systeem (Zie de materiaallijst) datin de milieu kamer is ingesloten; Hierdoor kan de iHOs in een gecontroleerde omgeving (37 °C/5% CO₂) worden geïnjecteerd. (B) de bacteriële entmateriaal wordt rechtstreeks geleverd in de iHO lumen met behulp van een microcapillaire gehecht aan de Microinjection systeem. (C) door het mengen van bacteriële inoculums met fenol rood, is het duidelijk welke iHOs zijn geïnfecteerd, waardoor het vermijden van dubbele injecties van dezelfde iHO. De beelden werden genomen op 10x vergroting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Voor behandeling van iHOs afgeleid van de Kolf2 Cell line met rhIL-22 beperkt de S. Typhimurium SL1344 invasie in intestinale epitheelcellen. Voor gentamicine bescherming assays, iHOs werden behandeld met 100 ng/mL rhIL-22 18 h voorafgaand aan de infectie, of onbehandeld, en uitgebroed voor 90 min postinfection. De gegevens zijn middel van drie technische replicaties voor drie biologische repliceert ± SEM. Voor significantie het testen, werden de tests van Mann-Whitney U gebruikt; p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: interactie van IECs met S. typhimurium SL1344. Deze panelen tonen iHOs geïnjecteerd met S. Typhimurium SL1344 en uitgebroed voor 3 uur, voorafgaand aan de fixatie en verwerking voor (a) immunofluorescentie of (B) transmissie elektronenmicroscopie. In paneel A, bacteriën worden gezien binnen de iHO lumen en de interactie met het epitheel. Kernen zijn gekleurd met 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilactate (blauw), celmembranen met phalloidin (rood), en bacteriën met CSA-1 (groen). De beelden zijn genomen op 20x vergroting. Panel B toont drie verschillende intracellulaire verwerkings trajecten van salmonella na de invasie; bacteriën worden gezien (a) binnen een salmonella-bevattende vacuole, (b) vrij binnen het cytoplasma, en (c) ondergaan autophagy. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

RPMI/B27 medium
Component:	Bedrag:
RPMI 1640 media met glutamine supplement	500 mL
B27 serum-gratis supplement 50x	10 mL
iHO basis groeimedium
Component:	Bedrag:
Geavanceerde DMEM/F12	500 mL
B27 serum-gratis supplement 50x	10 mL
N2 serum-gratis supplement 100x	5 mL
HEPES 1 M	5 mL
L-glutamine 200 mM	5 mL
Groeifactoren voor iHO basis groeimedium
Component:	Bedrag:
Recombinant mens R-spondin1	500 ng/mL
Recombinante menselijke Noggin	100 ng/mL
Epidermale groeifactor (EFG)	100 ng/mL
Prostaglandine E2	2,5 µ M
CHIR99021	3 µ M
Y-27632 betahistinedihydrochloride monohydraat	10 µ M

Tabel 1: media recepten.

Discussie

Dit protocol schetst de differentiatie van hiPSCs in iHOs en hun nut als een model waarin te simuleren enterische infecties. Hieronder geven we een overzicht van de kritieke stappen in het protocol en eventuele wijzigingen of verbeteringen die we hebben aangebracht.

Dit protocol stroomlijnt het differentiatie proces van hiPSCs ten opzichte van eerder gepubliceerde werk²⁵. De eerder gebruikte methodes vereisten de overdracht van hiPSCs van andere hiPSC cultuursystemen (b.v., voeder-afhankelijke hiPSC cultuur) aan chemisch-bepaald middel-Polyvinyl Alcohol (CDM-PVA). Deze overdracht naar CDM-PVA duurt meestal 2 – 3 weken en vereist dagelijkse voeding van de hiPSCs. Dit protocol was ook niet constant efficiënt, met sommige differentiaties die ontbreken; Daarom hebben we trialed differentiatie met dezelfde groeifactoren, maar te beginnen met hiPSCs geteeld in stamcellen cultuurmedium (in plaats van CDM-PVA) en vervanging van CDM-PVA met stamcel cultuurmedium tijdens differentiatie dagen 0 tot 3. Dit is succesvol geweest voor de vijf onafhankelijke hiPSC lijnen tot nu toe trialed, waardoor het differentiatie proces veel sneller en efficiënter. Dit maakt het ook mogelijk weekend-vrije kweken van hiPSCs voorafgaand aan differentiatie, waardoor meer flexibiliteit in de hiPSC cultuur. iHO lijnen geproduceerd door deze methode zijn fenotype voor markers van intestinale epitheel zoals we eerder hebben beschreven voor de hiPSC lijnen Kolf2, Yemz1, en Lise1¹⁶ en lijken fenotypisch niet te onderscheiden van iHOs geproduceerd met behulp van de vorige Protocol.

Na het zaaien, iHOs vereisen ten minste 1 maand van routine passaging, met splitsing om de 4 – 7 dagen om de rijping te vergemakkelijken. Merk op dat er zal enige variatie in iHO ontwikkeling afhankelijk van de gebruikte iPSC lijn en de dichtheid van de oorspronkelijke cultuur. Tijdens de eerste paar passages, zullen er zichtbaar verontreinigende cellen zijn die niet iHOs zijn. Deze zullen uiteindelijk sterven, waardoor een schone cultuur van sferische en, na ongeveer 4 weken, ontluikde iHOs. Daarnaast kan een in-Hood Imaging systeem worden gebruikt om te selecteren en passage alleen iHOs met de gewenste morfologie. Als iHOs volwassen, zullen zij vereisen splitsing elke 6 – 7 dagen, afhankelijk van de groei en de dichtheid. Als een van de volgende voorkomen, iHOs moet worden gesplitst voorafgaand aan dit punt: de Luminale holten van de iHOs beginnen te vullen met dode cellen, de kelder membraan matrix begint te desintegreren, de iHOs beginnen te groeien uit de kelder membraan matrix, of de cultuur is te dicht en de media begint te gaan geel zeer snel.

Zodra de iHO cultuur is vastgesteld, als op enig moment de verschijning van de iHOs verandert of anders is dan verwacht (bijvoorbeeld, de culturen blijven sferische, in plaats van ontluikende), fenotyping via Immunohistochemistry en qPCR voor cel markers zou moeten worden herhaald om ervoor te zorgen dat de differentiatie van de cel types binnen de iHOs (bijvoorbeeld, beker cellen, Paneth cellen) intact blijft. Als iHOs niet meer onderscheidt, dan zouden zij moeten worden weggegooid en opnieuw onderscheiden of een vroegere passage van iHOs zou moeten worden ontdooid en worden opnieuw samengesteld. Als de iHOs ophouden te differentiëren, de mogelijke oorzaken zijn de leeftijd van de cultuur (als het meer dan 6 maanden oud), de activiteit van de groeifactoren (ervoor te zorgen dat deze worden opnieuw samengesteld volgens de instructies van de fabrikant en bevroren gehouden in kleine fracties te vermijden meerdere Freeze-dooi cycli), te frequente of gewelddadige passages (in het algemeen, passaging moet slechts een keer per week, en als de iHOs handmatig worden gescheiden te krachtig op een regelmatige basis, zullen ze ophouden om volledig te differentiëren).

We vestigden via RNA sequencing dat IL-22 stimulatie 18 uur voorafgaand aan de infectie upreguleert antimicrobiële genen en degenen die betrokken zijn bij de barrière verdediging fenotype. Voorafgaand aan het gebruik van nieuwe iHsO voor analyses die prestimulatie met rhIL-22 (of een alternatieve cytokine impliceren als het systeem voor dit wordt gebruikt), is het raadzaam om de activiteit van genen te controleren die worden gekend om door cytokine (in het geval van IL-22 , gebruikten wij DUOX2 en LCN2) via qPCR na stimulatie van de iHOs, om receptor uitdrukking en intacte signalering te verzekeren. Voorafgaand aan het eerste gebruik van IL-22, hebben we ook uitgevoerd Immunohistochemistry naar de IL-22 receptor op iHOs lokaliseren om vast te stellen dat de expressie van de IL-22 receptor was basal, wat betekent dat de voor stimulatie kan eenvoudig worden bereikt door het toevoegen van rhIL-22 aan de iHO cultuur Medium. Nochtans, als een receptor apicaal wordt uitgedrukt, kan dit protocol moeten worden aangepast om ligands apicaal te leveren.

Valkuilen met betrekking tot de Microinjection systeem zijn over het algemeen gerelateerd aan de delicatesse van de naalden die nodig zijn voor de injectie. Hier gebruiken we commercieel verkrijgbare boor tips met een 6 μm lumen. Het is mogelijk om de injectienaalden trekken uit glazen capillairen²⁶ hoewel dit kan minder uniform, wat leidt tot lekkages van de naald tip of inconsistente volumes worden geïnjecteerd in de iHOs. Het is belangrijk om zeker te zijn dat de injectie heeft plaatsgevonden in de iHO lumen, dat is een reden voor het gebruik van fenol rood als een kleurstof; de iHOs zal zichtbaar uit te breiden en houd de rode entmateriaal, waardoor zekerheid over welke iHOs zijn geïnjecteerd. Af en toe naalden zal verstoppen met puin van de iHO muur; Als dit het geval is, verwijder dan de naald Tip van binnenuit de iHO en druk op de clean -knop op de Microinjection systeem. Dit zal een korte periode van hogere luchtdruk veroorzaken die de stagnatie zou moeten ontruimen. Het zal ook wat lekkage van de bacteriële entmateriaal op de plaat veroorzaken; Daarom, als dit gebeurt, moet de schone actie worden herhaald op alle platen om de gelijkheid van bacteriële entmateriaal per plaat te waarborgen. Één groot voordeel van hiPSC-afgeleide iHOs is hun grootte. Intestinale organoids van muizen en primaire menselijke organoids zijn veel kleiner (meten tot ~ 100 μm en 100 – 300 μm, respectievelijk²⁷, versus 250 – 1500 μm voor hiPSC-afgeleide iHOs), wat betekent dat injecties van grote hoeveelheden organoids langzamer zal zijn. Hierdoor kunnen grootschalige injectie experimenten worden geproefd in de hiPSC-afgeleide iHOs. Het is ook mogelijk om de Luminale inhoud van de iHOs te bestuderen door hen postinfection en manueel het scheiden van iHOs in DPBS te oogsten, die hun Luminale inhoud vrijgeven. Voor de Microinjection raden wij u aan een hoge concentratie van bacteriën te gebruiken. We vonden dat lagere concentraties niet voldoende waren om een reactie te genereren van de IECs bestaande uit de iHOs. Daarnaast was het moeilijk om vervolgens te lokaliseren interne bacteriën met microscopie. Inoculums kan moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende bacteriestammen.

Samengevat, hiPSC-afgeleide iHOs bieden een veelbelovend model voor het rechtstreeks ontleden van de epitheel reactie op enterische infecties, hetzij door het bestuderen van intracellulaire invasie telt, beeldvorming, het meten van cytokine niveaus in de iHO supernatants, of het oogsten van RNA om studie transcriptie veranderingen na blootstelling aan pathogenen. Hun nut zal nog duidelijker in de toekomst voor het vaststellen van infectie modellen voor de mens-beperkte pathogenen en in het exploiteren van de mogelijkheden van het gebruik van deze technologie om onderzoek te personaliseren door het bestuderen van specifieke ziekte-gerelateerde genetische mutaties en drugs reacties.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
5 mm glass bottom injection dishes	MatTek corporation	P50G-0-14-F
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Alexa fluor 647 phalloidin	Life Technologies	A22287	Gebruik bij 1:1.000 concentratie
B27 serum-vrij supplement	Life Technologies	17504044	Voorraadconcentratie 50x, eindconcentratie 1x
BMP-4 recombinant humaan eiwit	R&D	PHC9534	Voorraadconcentratie 10 μg/mL, eindconcentratie 10 ng/mL
Cell recovery solution (cell lifting solution)	BD	354253
CHIR99021	Abcam	ab120890-5mg	Voorraadconcentratie 3 mM, eindconcentratie 3 µM
Collagenase, type IV poeder	Life Technologies	17104019	Reconstitueer bij 0,1%
Corning cryogene vials	Corning	430487
Costar TC behandelde 24 well kweekplaten	Corning	CLS3527
DAPI dilactaat	Sigma-Aldrich	D9564-10MG	Gebruik bij 10 nM concentratie
Dulbecco’s PBS (geen MgCl2 of CaCl2)	Life Technologies	14190-144
Dulbecco’s PBS (met MgCl2 en CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8662-100ML
Epidermale groeifactor	R&D	236-EG-200	Voorraadconcentratie 100 μg/mL, eindconcentratie 100 ng/mL
Eppendorf TransferMan NK2 (micro-injectiesysteem)	Eppendorf	920000011
Eppendorf Femtojet express  (micro-injectiesysteem)	Eppendorf	5248 000.017
Essential 8 Flex medium kit (stamcel kweekmedium)	Life Technologies	A2858501
EVOS XL beeldvormingssysteem (in-hood beeldvormingssysteem)
Gentamicine	Sigma-Aldrich	G1272-10ML	Voorraadconcentratie 10 mg/mL, eindconcentratie 0,1 mg/mL
Gezeik tegen Salmonella, CSA-1	Insight Biotechnology	02-91-99	Gebruik bij 1:20 concentratie
HEPES 1 M	Life Technologies	15630056
KnockOut Serum Replacement (serum vervanging)	Gibco	10828010
GlutaMAX supplement (glutamine supplement	ThermoFisher
L-glutamine	Life Technologies	A2916801	Voorraadconcentratie 200 mM, eindconcentratie 2 mM
LY294002	Promega UK	V1201	Voorraadconcentratie 50 mM, eindconcentratie 10μM
Matrigel, GFR, fenolvrij (basement membraan matrix)	Corning	356231
MEM niet-essentiële aminozuren  oplossing (100x)	Gibco	11140035
N2 serum-vrij supplement	Life Technologies	17502048	Voorraadconcentratie 100x, eindconcentratie 1x
Penicilline-streptomycine	Life Technologies	15140163	Voorraadconcentratie 10.000 U/mL, eindconcentratie 100 U/mL
Fenol rood	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Piezo Drill Tip Muis ICSI, 25° tip hoek, 6 µm binnendiameter	Eppendorf	5195000087
Prostaglandine E2	Sigma	P0409-1MG	Voorraadconcentratie 2,5 mM, eindconcentratie 2,5 mM
Recombinant humaan FGF basic	R&D	233-FB-025	Voorraadconcentratie 100 μg/mL, eindconcentratie 100 ng/mL
Recombinant humaan IL-22	R&D	6057-NG-100	Voorraadconcentratie 100 μg/mL, eindconcentratie 100 ng/mL
Recombinant humaan Noggin	R&D	6057-NG-100	Voorraadconcentratie 100 μg/mL, eindconcentratie 100 ng/mL
Recombinant humaan R-spondin1	R&D	4645-RS-025	Voorraadconcentratie 25 mg/mL, eindconcentratie 500 ng/mL
Recombinant humaan/muis/rat Activin A	R&D	338-AC-050	Voorraadconcentratie 100 μg/mL, eindconcentratie 100 ng/mL
Recovery cell kweek bevriezingsmedium (cel bevriezingsmedium)	Gibco	12648010
Retinoïnezuur	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Voorraadconcentratie 3 μM, eindconcentratie 3 mM
RPMI 1640 media met Glutamax supplement (RPMI Medium met L-glutamine supplement)	Life Technologies	61870010
Triton X-100 (cel lyseren buffer)	Sigma-Aldrich	RES9690T-A101X	Gebruik bij 1% concentratie
Versene (EDTA oplossing)	Life Technologies	15040066
Vitronectine XF	Stemcell Technologies	7180
Y-27632 dihydrochloride monohydraat	Sigma-Aldrich	Y0503-1MG	Voorraadconcentratie 3 mM, eindconcentratie 10 mM