Het combineren van niet-vermindert SDS-pagina analyse en chemische crosslinking om multimeric complexen te ontdekken die door disulfide verbindingen in zoogdiercellen in cultuur worden gestabiliseerd

Samenvatting

Disulfide verbanden zijn al lang bekend om de structuur van veel eiwitten te stabiliseren. Een eenvoudige methode om multimeric complexen te analyseren die door deze aaneenschakelingen worden gestabiliseerd is door niet-vermindert SDS-pagina analyse. Hier wordt deze methode geïllustreerd door het analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase van het menselijk bot Osteosarcoom Cell line U-2 OS.

Samenvatting

De structuren van vele proteïnen worden gestabiliseerd door covalente disulfide aaneenschakelingen. In recent werk is deze obligatie ook geclassificeerd als een post-translationele modificatie. Zo is het belangrijk om deze modificatie in levende cellen te kunnen bestuderen. Een eenvoudige methode om deze cysteïne-gestabiliseerde multimeric complexen te analyseren is door een methode in twee stappen van niet-vermindert SDS-pagina analyse en formaldehyde het cross-linking. Deze methode in twee stappen is voordelig als de eerste stap aan het blootleggen multimeric complexen die door disulfide aaneenschakelingen worden gestabiliseerd toe te schrijven aan zijn technisch gemak en lage kosten van verrichting. Hier, de Human Bone Osteosarcoom Cell line U-2 OS wordt gebruikt om deze methode te illustreren door specifiek analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase.

Inleiding

Disulfide verbanden zijn al lang bekend om de structuur van veel eiwitten te stabiliseren. In recent werk, deze band is ook geclassificeerd als een omkeerbare post-translationele modificatie, als een cysteïne-gebaseerde "redox switch" waardoor de modulatie van de eiwitfunctie, locatie en interactie^{1,2, 3,4}. Zo is het belangrijk om deze wijziging te kunnen bestuderen. Een eenvoudige methode om deze cysteïne-gestabiliseerde multimeric complexen te analyseren is door niet-vermindert SDS-pagina analyse⁵. SDS-pagina analy....

Protocol

1. het blokkeren van vrije cysteïne residuen gebruikend Iodoacetamide

1. Grow U-2 OS cellen in een 6 cm² schotel tot 50%-60% confluency in minimale essentiële medium met een hoge glucose met 10% foetale boviene serum en 1% natrium pyruvaat bij 37 ° c in 5% Co₂.
2. Maak een verse voorraad van 10 mM iodoacetamide net voor gebruik, dan gooi alle ongebruikte reagens.
3. Voeg 0,1 mM definitieve concentratie iodoacetamide rechtstreeks aan de cel cultuurmedia. Zachtjes Rock de schotel bij kamertemperatuur voor 2 min.

2. het oogsten van de cellen

1. Aspireren de media uit de cellen.
2. W....

Resultaten

Nucleaire dUTPase vormt een intermoleculaire disulfide koppeling vormen een stabiele dimeer configuratie door de interactie van twee cysteïne residuen gepositioneerd op het derde aminozuur van elk monomeer eiwit¹¹. Dit wordt aangetoond in Figuur 1a, B. Om ervoor te zorgen dat deze disulfide koppeling was niet een niet-specifieke interactie als gevolg van migratie afwijkingen in de niet-verminderde omgeving, t de opnemi.......

Discussie

De hier geschetste methode geeft een rechttoe rechtaan protocol voor de analyse van multimeric complexen gestabiliseerd door disulfide verbanden. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere cellen cultuurlijnen, weefsels en organismen waardoor een breed scala van toepassingen.

Een belangrijke stap in deze procedure is ervoor te zorgen dat de disulfide verbanden geen gevolg zijn van de extractie procedure. Elke vrije cysteïne residuen kunnen worden geblokkeerd met behulp van iodoac.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
16% precast TGX gels	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 dish	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL detection kit	GE	16817200
Blot transfer apparatus	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromofenol Blauw
BSA	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Drill
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus	Invitrogen	A25977
Extra thick western blotting paper	ThermoFisher	88610
Fetaal bovien serum	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher	28908
Glass-teflon homogenisator
Glycerol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Heat block	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hydrochloridezuur	VWR	2018010431
Iodoacetamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Methanol	Pharmco	339000000
Non-fat dry milk	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Power supply	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF membrane	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Secondary antibody	Cell signaling	70748
Small cell scraper	Tygon	S-50HL class VI
Sodium chloride	RPI	S23020
Sodium pyruvate	Gibco
Sonicator	Branson	450
Sponge pad voor blotting	Invitrogen	E19051
Stir plate	Corning	PC353
Sucrose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, met Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine running buffer	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ray film	ThermoFisher	34090