Het combineren van niet-vermindert SDS-pagina analyse en chemische crosslinking om multimeric complexen te ontdekken die door disulfide verbindingen in zoogdiercellen in cultuur worden gestabiliseerd

Samenvatting

Disulfide verbanden zijn al lang bekend om de structuur van veel eiwitten te stabiliseren. Een eenvoudige methode om multimeric complexen te analyseren die door deze aaneenschakelingen worden gestabiliseerd is door niet-vermindert SDS-pagina analyse. Hier wordt deze methode geïllustreerd door het analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase van het menselijk bot Osteosarcoom Cell line U-2 OS.

Samenvatting

De structuren van vele proteïnen worden gestabiliseerd door covalente disulfide aaneenschakelingen. In recent werk is deze obligatie ook geclassificeerd als een post-translationele modificatie. Zo is het belangrijk om deze modificatie in levende cellen te kunnen bestuderen. Een eenvoudige methode om deze cysteïne-gestabiliseerde multimeric complexen te analyseren is door een methode in twee stappen van niet-vermindert SDS-pagina analyse en formaldehyde het cross-linking. Deze methode in twee stappen is voordelig als de eerste stap aan het blootleggen multimeric complexen die door disulfide aaneenschakelingen worden gestabiliseerd toe te schrijven aan zijn technisch gemak en lage kosten van verrichting. Hier, de Human Bone Osteosarcoom Cell line U-2 OS wordt gebruikt om deze methode te illustreren door specifiek analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase.

Inleiding

Disulfide verbanden zijn al lang bekend om de structuur van veel eiwitten te stabiliseren. In recent werk, deze band is ook geclassificeerd als een omkeerbare post-translationele modificatie, als een cysteïne-gebaseerde "redox switch" waardoor de modulatie van de eiwitfunctie, locatie en interactie^{1,2, 3,4}. Zo is het belangrijk om deze wijziging te kunnen bestuderen. Een eenvoudige methode om deze cysteïne-gestabiliseerde multimeric complexen te analyseren is door niet-vermindert SDS-pagina analyse⁵. SDS-pagina analyse is een techniek die in vele laboratoria wordt gebruikt, waar de resultaten kunnen worden verkregen en worden geïnterpreteerd snel, gemakkelijk, en met minimale kosten, en is voordelig over andere technieken die worden gebruikt om disulfide aaneenschakelingen zoals massaspectrometrie 6 te identificeren ^,7 en circulaire dichroism⁸.

Een belangrijke stap in het bepalen of deze methode is een geschikte techniek om te helpen bij een studie is om grondig te onderzoeken de primaire sequentie van het eiwit van belang te verzekeren zijn er cysteïne residu (s) aanwezig. Een andere nuttige stap moet om het even welke vorige gepubliceerde kristalstructuren onderzoeken of een bioinformatica toepassing gebruiken om de driedimensionele structuur van de proteïne van belang te onderzoeken om te visualiseren waar het cysteïne residu (s) kan worden gevestigd. Als het residu (s) aanwezig is op de buitenkant kan het een betere kandidaat om een disulfide koppeling in plaats van een cysteïne residu begraven op de binnenkant van de structuur te vormen. Het is echter belangrijk op te merken dat eiwitten structurele veranderingen kunnen ondergaan op substraat interacties of eiwit-Eiwitinteracties waardoor deze residuen vervolgens worden blootgesteld aan het milieu ook.

Geïdentificeerde multimeric complexen kan vervolgens worden geverifieerd met chemische cross-linking met behulp van formaldehyde. Formaldehyde is een ideale cross-linker voor deze verificatie techniek als gevolg van de hoge cel permeabiliteit en korte cross-linking span van ~ 2-3 Å, zorgen voor de opsporing van specifieke eiwit-Eiwitinteracties^9,10. Hier wordt deze methode geïllustreerd door het analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase van het menselijk bot Osteosarcoom Cell line U-2 OS¹¹. Dit protocol kan echter worden aangepast voor andere cel lijnen, weefsels en organismen.

Protocol

1. het blokkeren van vrije cysteïne residuen gebruikend Iodoacetamide

1. Grow U-2 OS cellen in een 6 cm² schotel tot 50%-60% confluency in minimale essentiële medium met een hoge glucose met 10% foetale boviene serum en 1% natrium pyruvaat bij 37 ° c in 5% Co₂.
2. Maak een verse voorraad van 10 mM iodoacetamide net voor gebruik, dan gooi alle ongebruikte reagens.
3. Voeg 0,1 mM definitieve concentratie iodoacetamide rechtstreeks aan de cel cultuurmedia. Zachtjes Rock de schotel bij kamertemperatuur voor 2 min.

2. het oogsten van de cellen

1. Aspireren de media uit de cellen.
2. Was drie maal de cellen met 5 mL koud fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Aspireren de definitieve PBS was oplossing Voeg dan 1 mL koude PBS toe.
3. Schraap de cellen uit de bodem van de schotel met behulp van een cel schraper. Met behulp van een 1 mL Pipet de PBS en de cel schorsing en afzien van alle vloeistof in een 1,5 mL micro centrifugebuis.
4. Draai de cellen op 7.500 x g gedurende drie minuten bij 4 °c. Aspireren de PBS, waardoor de cel pellet achter. De cel pellet kan worden opgeslagen bij-80 °C tot de verwerking

3. extractie van eiwitten

1. Bereid 100 µ L van een 1x lysis buffer verdund in ddH₂O (Zie de lijst van materialen). Voeg phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) onmiddellijk voor gebruik toe aan een eindconcentratie van 1 mM.
2. Voeg 50 µ L van de 1x lysis buffer rechtstreeks aan Cell pellet en suspend. Incubeer dit op ijs voor 5 min.
3. Bewerk voor 8 s met behulp van de constante Pulse Mode op 40% (Zie tabel van materialen voor geen ultrasoonapparaat; pas als nodig is voor verschillende sonicators), waarbij het extract op ijs.
4. Draai het extract bij 4 °C gedurende 5 min bij 16.000 x g. De bovendrijvende is de oplosbare eiwitfractie. De analyse van Bradford kan worden uitgevoerd om eiwitconcentratie te bepalen indien gewenst.

4. monstervoorbereiding

1. Neem 10 µ L van het oplosbare eiwit extract en voeg 10 µ L van een 1x Laemmli SDS-sample buffer toe (4% SDS, 20% glycerol, 0,004% bromophenol blauw, en 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Voeg geen reductie reagentia toe.
2. Houd monsters op ijs als SDS-pagina analyse zal worden uitgevoerd die dag; voor opslag op lange termijn,-20 °C is aangewezen. Vlak voor het uitvoeren van de gel, verwarm het monster voor 5 min bij 85 ° c.

5. in vivo formaldehyde cross-linking van endogene eiwitten in U-2 OS cellen

1. Kweek U-2 OS cellen in een 175 cm² kolf tot 70% – 80% confluency (zie sectie 1).
2. Voer de formaldehyde crosslinking reactie
   1. In een rook kap, een hoeveelheid van 37% formaldehydeoplossing gekocht van commerciële bronnen. Voeg de formaldehyde fixatief direct toe aan het medium tot een final concentratie van 1% en broed op kamertemperatuur met zachte agitatie gedurende 15 min.
   2. Om de reactie te doven, voeg 1,25 M glycine tot een definitieve concentratie van 0,125 M en Incubeer bij kamertemperatuur met zachte agitatie op een tuimelschakelaar voor 5 min.
3. Was de cellen met 5 mL koude PBS drie keer. Aspireren de laatste PBS Wash oplossing en voeg 10 mL PBS. Schraap de cellen uit de bodem van de kolf met behulp van een cel schraper.
4. Maak met behulp van een pipet van 10 mL de PBS-en cel ophanging en verdeel alle vloeistof in een kegelvormige centrifugebuis van 15 mL. Draai de cellen bij 500 x g voor 2 min bij 4 °c. Aspireren de PBS, waardoor de cel pellet achter.

6. fractionering van kernen

1. Bereid 10 mL homogenisering buffer: 0,25 M sacharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, en 0,5% BSA bij pH 7,4. Voeg PMSF onmiddellijk voor gebruik toe aan een 1 mM eindconcentratie en 3mL van kernen Suspension buffer (0,1% Triton X-100 in PBS).
2. Voeg 5 mL homogenisering buffer rechtstreeks aan de cel pellet en suspend volledig. Centrifugeer de suspensie bij 500 x g gedurende 2 min bij 4 °c en verwijder vervolgens de bovendrijvende.
3. Suspendeer de pellet in 5 mL homogenisering buffer. Gebruik een strakke glas-Teflon homogeniseer, dounce Meng cellen op 10 slagen/500 rpm.
4. Centrifugeer de suspensie bij 1.500 x g gedurende 10 min bij 4 °c, en gooi de bovendrijvende.
   Opmerking: Gebruik de bovendrijvende voor isolatie van mitochondriën door centrifugeren bij 10.000 x g voor 10 min.
5. Schors de pellet in 1 mL kernen schorsing buffer en incubeer op ijs voor 10 min.
6. Centrifugeer bij 600 x g voor 10 min. Gooi de bovendrijvende weg.
7. Suspendeer de pellet in 1 mL kernen suspensie buffer en centrifugeer opnieuw. Verwijder de bovendrijvende. De laatste pellet zal worden geïsoleerde kernen.

7. extractie van eiwitten

1. Herhaal sectie 4, behalve het toevoegen van 25 µ L van de 1x lysis buffer rechtstreeks aan de cel pellet dan schorsen.

8. monstervoorbereiding

1. Bereid twee monsters voor SDS-pagina door het nemen van 10 µ L elk van de oplosbare eiwit extract en voeg 10 µ L van 2x Laemmli SDS-sample buffer en 1 µ L van 2-mercaptoethanol (BME).
2. Verwarm één steekproef voor 5 min bij 37 °C en het tweede monster 15 min bij 98 °C om de formaldehyde dwarsverbinding om te keren.

9. SDS-pagina analyse

1. Bereid 1 L van 1x tris-Glycine lopende buffer voor (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0,1% (w/v) SDS).
2. Stel de SDS-pagina lopende apparaten in.
   Nota: dit protocol gebruikt een 16% geprefabriceerde TGX sds-pagina. Van de nota, een percentage gel kan worden gebruikt.
   1. Per de fabrikant protocol, open het pakket de gel is opgeslagen in en verwijder de cassette.
   2. Verwijder de kam die langs de putten en de tape van de onderkant van de cassette.
   3. Plaats de gel in het lopende apparaat.
   4. Vul de kamer met de 1x lopende buffer tot de putten zijn ondergedompeld in vloeistof. Met behulp van een plastic pipet, spoel de putten met de running buffer.
3. Laad de monsters op de gel, samen met 10 µ L voorbevlekt standaard marker.
4. Voer de gel op 200 V tot de kleurstof voorkant is ongeveer 1 cm van de onderkant van de gel.

10. westelijke vlek

1. Bereid 1 L van 1x overdrachts buffer voor (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 20% methanol) en bewaar bij 4 °C tot het gebruik.
2. Verwijder voorzichtig de gel en open de cassette. Met behulp van een scheermes, zorgvuldig knippen en ontdoen van de stapelen gel. Pick-up van de gel met behulp van een hoek en plaats deze in een lade met overdracht buffer, waardoor het zachtjes Rock voor 5 min.
3. Terwijl de gel schommelt, plaats een ijs blok (opgeslagen in-20 ° c) in de transfer tank en voeg de overdracht buffer om ¾ volledige.
4. NAT de polyvinylidene fluoride (PVDF) membraan door te weken in 100% methanol voor 30 s.
5. Zodra de 5 min zijn verstreken, voor te bereiden op het opzetten van de overdracht in een lade met overdracht buffer. De overdrachts buffer zou genoeg moeten zijn om de vlek volledig onder te dompelen. Stel de Blot-overdracht als volgt in: onderaan de cassettehouder (zwart); dan een dikke spons, extra dik vloeipapier, de Polyacrylamide gel, een PVDF membraan, extra dik vloeipapier, en een dikke spons; dan eindelijk de top van de cassettehouder (wit) aan de bovenkant.
6. Vergrendel de cassette en plaats het apparaat in de transfer tank met het PVDF membraan naar de positieve anode en de gel naar de negatieve. Bovenkant van de eenheid met overdrachts buffer tot uw overdracht volledig wordt ondergedompeld.
7. Plaats het apparaat op de top van een roer plaat. Voeg een roer bar aan het apparaat en beginnen roeren op 125 rpm.
8. Looppas bij 100 V voor 60 min.
9. Terwijl de overdracht wordt uitgevoerd, bereiden een oplossing van 5% poedermelk opgelost in tris-gebufferde zoutoplossing, met tween-20, pH 7,5 (TBST).
10. Demonteer het apparaat en verwijder het membraan, wijzend op welke kant in contact met de gel was; Zorg ervoor dat deze kant blijft in de lade voor de resterende stappen.
11. Week het membraan voor 2 min in tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), gevolgd door het blokkeren van het membraan door incubatie in 5 mL van 5% melk-TBST oplossing voor 30 min bij kamertemperatuur.
12. Vervang de melk met een verse 4 mL van 5% melk-TBST oplossing en voeg het primaire antilichaam bij de juiste verdunning (in dit geval, onze verdunning is 1:2000 voor de dUTPase antilichaam) en incubeer 's nachts met zachte schommelen bij 4 ° c.
13. De volgende dag, verwijder de vlek van de 4 °C tuimelschakelaar aan een tuimelschakelaar van de ruimtetemperatuur, die de primaire antistof oplossing verwijdert.
14. Doe drie snel wast met TBST, met behulp van voldoende vloeistof om volledig onder de Blot, gevolgd door 3 wasbeurten, 5 min elk, langzaam schommelen.
15. Na de laatste wasbeurt, voeg 5 mL van de 5% melk-TBST oplossing en rock de vlek voor 15 min dan weggooien.
16. Voeg secundair antilichaam verdund in 5% melk-TBST bij de gewenste concentratie. (In dit geval 1:5000 verdunning van geiten anti-konijn verdund in 5 mL van 5% melk-TBST oplossing)
17. Incubeer bij kamertemperatuur, schommelen voor 1 uur, dan gooi de oplossing.
18. Doe drie snelle wast met TBST, gevolgd door 3 wasbeurten, 5 min elk, schommelen langzaam, dan gooi de laatste wasbeurt en voeg 5 mL TBS.
19. Bereid een 1:1 mengsel van een ECL chemiluminescentie detectie-oplossingen (1 mL van elk reagens voor een laatste volume van 2 mL) en voeg dit rechtstreeks aan de vlek incubatie voor 1 minuut.
20. Verwijder het membraan met een pincet en DEP de hoek met een laboratorium vegen, het verwijderen van overtollige oplossing. Plaats het membraan in shrink wrap en plaats het eiwit kant in een x-ray cassette.
21. Bloot het membraan aan x-ray film. Het tijdstip van de blootstelling zal variëren.

Resultaten

Nucleaire dUTPase vormt een intermoleculaire disulfide koppeling vormen een stabiele dimeer configuratie door de interactie van twee cysteïne residuen gepositioneerd op het derde aminozuur van elk monomeer eiwit¹¹. Dit wordt aangetoond in Figuur 1a, B. Om ervoor te zorgen dat deze disulfide koppeling was niet een niet-specifieke interactie als gevolg van migratie afwijkingen in de niet-verminderde omgeving, t de opnemi...

Discussie

De hier geschetste methode geeft een rechttoe rechtaan protocol voor de analyse van multimeric complexen gestabiliseerd door disulfide verbanden. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere cellen cultuurlijnen, weefsels en organismen waardoor een breed scala van toepassingen.

Een belangrijke stap in deze procedure is ervoor te zorgen dat de disulfide verbanden geen gevolg zijn van de extractie procedure. Elke vrije cysteïne residuen kunnen worden geblokkeerd met behulp van iodoac...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
16% precast TGX gels	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 dish	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL detection kit	GE	16817200
Blot transfer apparatus	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromofenol Blauw
BSA	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Drill
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus	Invitrogen	A25977
Extra thick western blotting paper	ThermoFisher	88610
Fetaal bovien serum	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher	28908
Glass-teflon homogenisator
Glycerol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Heat block	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hydrochloridezuur	VWR	2018010431
Iodoacetamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Methanol	Pharmco	339000000
Non-fat dry milk	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Power supply	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF membrane	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Secondary antibody	Cell signaling	70748
Small cell scraper	Tygon	S-50HL class VI
Sodium chloride	RPI	S23020
Sodium pyruvate	Gibco
Sonicator	Branson	450
Sponge pad voor blotting	Invitrogen	E19051
Stir plate	Corning	PC353
Sucrose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, met Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine running buffer	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ray film	ThermoFisher	34090