Kunstmatige RNA polymerase II-rek complexen voor het ontleden van co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen

Samenvatting

Hier beschrijven we de assemblage van RNA polymerase II (Pol II) rek complexen waarvoor alleen korte synthetische DNA en RNA oligonucleotiden en gezuiverde Pol II. Deze complexen zijn nuttig voor het bestuderen van mechanismen die onderliggende co-transcriptionele verwerking van transcripties in verband met het Pol II rek complex.

Samenvatting

Eukaryotische mRNA-synthese is een complex biochemisch proces dat transcriptie van een DNA-template vereist in een precursor RNA door de multi-subunit enzym RNA polymerase II en co-transcriptionele capping en splicing van de precursor RNA om de volwassen mRNA te vormen. Tijdens de mRNA-synthese is het RNA polymerase II rek complex een doelwit voor regulering door een grote verzameling van transcriptiefactoren die de katalytische werking beheersen, evenals de capping, splicing en 3 '-processing enzymen die de volwassen mRNA creëren. Vanwege de inherente complexiteit van mRNA synthese, eenvoudigere experimentele systemen waardoor isolatie en onderzoek van de verschillende co-transcriptionele stadia hebben grote nut.

In dit artikel beschrijven we een dergelijk eenvoudig experimenteel systeem dat geschikt is voor het onderzoeken van co-transcriptionele RNA-capping. Dit systeem is gebaseerd op gedefinieerde RNA polymerase II rek complexen geassembleerd van gezuiverde polymerase en kunstmatige transcriptie bubbels. Wanneer geïmmobiliseerd via biotinyleerd DNA, deze RNA polymerase II rek complexen bieden een gemakkelijk losse tool voor het ontleden van co-transcriptionele RNA capping en mechanismen waarmee de rek complex rekruteert en regelt capping enzym tijdens Co-transcriptionele RNA-capping. We verwachten dat dit systeem kan worden aangepast voor het bestuderen van werving en/of assemblage van eiwitten of eiwitcomplexen met rollen in andere stadia van mRNA-rijping gekoppeld aan het RNA polymerase II-rek complex.

Inleiding

Eukaryotische boodschapper RNA (mRNA) synthese is een uitgebreid biochemisch proces waarbij synthese van een onverwerkte precursor RNA door RNA polymerase II en verwerking van de precursor RNA om de volwassen mRNA te leveren. De RNA-verwerkingsstappen van capping, splicing en polyadenylering worden grotendeels co-transcriptioneel uitgevoerd. Het Pol II rek complex fungeert als een steiger die de activiteiten van veel van de RNA-verwerkings enzymen aanwerkent en organiseert. Bijgevolg zal ons uiteindelijke begrip van hoe volwassen eukaryotische Mrna's worden gegenereerd, sterk afhangen van de ontwikkeling van experimentele systemen om een dissectie van de biochemische ....

Protocol

1. assemblage van kunstmatige rek complexen en Pol II Walking

1. Immobiliseer 1 nmol van non-template DNA oligo met een 3 ' Biotine molecuul op magnetische kralen.
   Opmerking: de volgende stappen kunnen vooraf worden uitgevoerd om u voor te bereiden op toekomstige experimenten. Alle in dit Protocol gebruikte oligo-sequenties zijn beschikbaar in tabel 1. RNA oligos worden gesynthetiseerd met 5 '-trifosfaat modificaties.
   1. Voeg 200 μL magnetische kralen (10 mg/mL) toe aan een laag-eiwitbinding 1,5 mL buis en plaats vervolgens op een magnetisch rek voor 2 min.
   2. Terwijl de buis op de magnetische rek, verwijder de ....

Resultaten

Figuren 2 en 3 vertonen representatieve resultaat reacties die worden gebruikt om kunstmatige rek complexen te genereren met transcripties van verschillende lengtes door uitbreiding of Pol II uit verschillende bronnen. Figuur 4 toont hoe deze rek-complexen kunnen worden gebruikt om co-transcriptionele CTD-fosforylering-afhankelijke RNA-capping te testen.

Discussie

Studies die zijn gericht op het ontleden van gebeurtenissen gekoppeld aan het Pol II rekcomplex zoals RNA verwerking en regulatie van de transcriptie verlenging zelf kunnen sterk worden vergemakkelijkt door het gebruik van een zeer gezuiverd enzymsysteem. Het opzetten van dergelijke enzym systemen kan een uitdaging zijn. Door de organisator afhankelijke transcriptie van Pol II zijn ten minste vijf algemene transcriptiefactoren vereist. Voorbereiding en inventarisatie van deze factoren kan maanden duren; Vandaar dat de sn.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi	Perkin Elmer	NEG007H001MC	Voor radiolabeling van RNA
2x RNA loading dye	New England Biolabs	B0363S	Zeer aanbevolen. Voor het voorbereiden van RNA tijdens het laden van gel
40% Bis:Acrylamide-oplossing	Biorad	1610144
Bovine Serum Albumine (20 mg/mL)	New England Biolabs	B9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK-complex)-eiwit, actief, 10 µg	Millipore Sigma	14-476	Gebruikt om Pol II CTD te fosforyleren
DNA-oligonucleotiden	IDT		Zie Tabel 8 voor zuiverheidsspecificaties
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies Invitrogen	65001	We hebben ook Dynabeads M-280 streptavidin gebruikt zonder probleem, maar geven de voorkeur aan MyOne Streptavidin-kralen omdat ze langzamer sedimenteren
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	AM9516	Zeer aanbevolen. Verft nucleïnezuurpellet blauw waardoor reacties veel gemakkelijker te hanteren zijn
Hoefer SE600 standaard dubbel gekoeld verticaal elektroforesesysteem met 1 mm ruimtes en 15 welschep	Hoefer	SE600-15-1.5
MaXtract hoge dichtheid buizen (1,5 mL)	Qiagen	129046	Zeer aanbevolen. Bevat een hoge dichtheidsgel die een stabiele barrière vormt tussen waterige en organische fasen; verbetert RNA-opbrengsten tijdens extracties
Proteinase K-oplossing (20 mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	25530049
RNA-oligonucleotiden	Trilink		Zie Tabel 8 voor meer details
Gist Anorganische Pyrofosfatase (100 eenheden/mL)	New England Biolabs	NEBM2403S	Alleen vereist tijdens afkapreacties