Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kunstmatige RNA polymerase II-rek complexen voor het ontleden van co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59497

⸱

13 mei 2019

 ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Kansas University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we de assemblage van RNA polymerase II (Pol II) rek complexen waarvoor alleen korte synthetische DNA en RNA oligonucleotiden en gezuiverde Pol II. Deze complexen zijn nuttig voor het bestuderen van mechanismen die onderliggende co-transcriptionele verwerking van transcripties in verband met het Pol II rek complex.

Samenvatting

Eukaryotische mRNA-synthese is een complex biochemisch proces dat transcriptie van een DNA-template vereist in een precursor RNA door de multi-subunit enzym RNA polymerase II en co-transcriptionele capping en splicing van de precursor RNA om de volwassen mRNA te vormen. Tijdens de mRNA-synthese is het RNA polymerase II rek complex een doelwit voor regulering door een grote verzameling van transcriptiefactoren die de katalytische werking beheersen, evenals de capping, splicing en 3 '-processing enzymen die de volwassen mRNA creëren. Vanwege de inherente complexiteit van mRNA synthese, eenvoudigere experimentele systemen waardoor isolatie en onderzoek van de verschillende co-transcriptionele stadia hebben grote nut.

In dit artikel beschrijven we een dergelijk eenvoudig experimenteel systeem dat geschikt is voor het onderzoeken van co-transcriptionele RNA-capping. Dit systeem is gebaseerd op gedefinieerde RNA polymerase II rek complexen geassembleerd van gezuiverde polymerase en kunstmatige transcriptie bubbels. Wanneer geïmmobiliseerd via biotinyleerd DNA, deze RNA polymerase II rek complexen bieden een gemakkelijk losse tool voor het ontleden van co-transcriptionele RNA capping en mechanismen waarmee de rek complex rekruteert en regelt capping enzym tijdens Co-transcriptionele RNA-capping. We verwachten dat dit systeem kan worden aangepast voor het bestuderen van werving en/of assemblage van eiwitten of eiwitcomplexen met rollen in andere stadia van mRNA-rijping gekoppeld aan het RNA polymerase II-rek complex.

Inleiding

Eukaryotische boodschapper RNA (mRNA) synthese is een uitgebreid biochemisch proces waarbij synthese van een onverwerkte precursor RNA door RNA polymerase II en verwerking van de precursor RNA om de volwassen mRNA te leveren. De RNA-verwerkingsstappen van capping, splicing en polyadenylering worden grotendeels co-transcriptioneel uitgevoerd. Het Pol II rek complex fungeert als een steiger die de activiteiten van veel van de RNA-verwerkings enzymen aanwerkent en organiseert. Bijgevolg zal ons uiteindelijke begrip van hoe volwassen eukaryotische Mrna's worden gegenereerd, sterk afhangen van de ontwikkeling van experimentele systemen om een dissectie van de biochemische mechanismen die onderliggende rekrutering voor het rek complex te maken en regulatie van enzymen die verantwoordelijk zijn voor co-transcriptionele capping, splicing en polyadenylering.

Het is niet verrassend dat de ontwikkeling van dergelijke experimentele systemen moeilijk is geweest. Een belangrijke belemmering is de opmerkelijke complexiteit van de Pol II-transcriptie zelf, waarbij het simpelweg reconstitueren van basale transcriptie door Pol II in vitro een minimumreeks van vijf algemene transcriptie initiatie factoren vereist: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF en TFIIH 1. Bovendien vereist het reconstitueren van elke vorm van gereguleerde Pol II-transcriptie in vitro een nog grotere reeks transcriptiefactoren en coregulatoren. Zo is een belangrijk doel geweest om eenvoudigere experimentele systemen te ontwikkelen die de reconstitutie van actieve Pol II-rek complexen mogelijk maken, geschikt voor onderzoek naar de functionele koppeling van Pol II-transcriptie en RNA-verwerking.

Een dergelijke eenvoudigere methode voor het reconstitueren van actieve Pol II-rek complexen is nuttig gebleken voor structurele en biochemische studies van het verlengen van Pol II en, meer recentelijk, voor het onderzoeken van co-transcriptionele RNA-verwerking2,3 ,4,5. In dit artikel laten we zien hoe Pol II rek complexen bereid uit gezuiverde Pol II en synthetische transcriptie bellen effectief kunnen worden gebruikt om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de co-transcriptionele capping van ontluikende Pol II transcripten.

Capping verwijst naar de covalente toevoeging van een 5 '-Guanosine "dop" aan de 5 '-trifosfaat einde van ontluikende Pol II transcripten. Het GLB is belangrijk voor de volgende stappen van mRNA rijping, transport, vertaling, en andere processen6,7. Het GLB wordt co-transcriptioneel toegevoegd aan Pol II transcripten door een enzym dat "capping enzyme" wordt genoemd. In zoogdiercellen zijn actieve sites die verantwoordelijk zijn voor de RNA 5 '-trifosfatase en guanylyl transferase-activiteiten van het capping enzym opgenomen in één polypeptide8. Het capping enzym wordt gerekruteerd naar het Pol II rek complex door middel van interacties met nog te definiëren oppervlakken op het Pol II lichaam en de Rpb1 Carboxy-terminale domein (CTD) fosforyleerd op Ser5 van zijn heptapeptide herhalingen5. In het rek complex, het capping enzym katalyseert toevoeging van een 5 '-Guanosine Cap zodra de ontluikende transcriptie bereikt een lengte van ten minste 18 nucleotiden en is voortgekomen uit de polymerase RNA uitgang kanaal. In de eerste stap van de capping reactie hydrolyseert de trifosfatase het RNA 5 '-trifosfaat om een 5 '-difosfaat te leveren. In de tweede stap wordt GTP gehydrolyseerd tot GMP door de guanylyl transferase, die een GMP-capping enzym intermediair vormt. Ten slotte brengt de guanylyl transferase GMP over naar het 5 '-difosfaat einde van de ontluikende transcriptie om het GLB te produceren.

Een opmerkelijk kenmerk van de capping reactie is dat co-transcriptionele capping (d.w.z. het afdekken van transcripten geassocieerd met functionele Pol II-rek complexen) veel efficiënter is dan het afdekken van vrij RNA5,5. Zo is een belangrijke vraag in het veld geweest hoe deze dramatische activering van capping wordt bereikt via interacties van het capping-enzym met het Pol II-rekcomplex. In dit protocol beschrijven we de assemblage van actieve RNA polymerase II rek complexen met alleen gezuiverde RNA polymerase II en kunstmatige transcriptie bubbels. Deze methoden maken het creëren van RNA polymerase II rek complexen met transcripten van gedefinieerde lengte en sequentie mogelijk. In een recente studie, gebruikten we deze gedefinieerde RNA polymerase II rek complexen als een model voor het onderzoeken van aspecten van de mechanismen van RNA capping5. In het bijzonder toonden we aan dat (i) het afdekken van RNA in verband met deze rek complexen meer dan 100-voudig efficiënter was dan het afdekken van vrij RNA en (II) werd gestimuleerd door TFIIH-afhankelijke fosforylering van de Pol II CTD. De hier beschreven aanpak kan in principe worden aangepast om substraten te genereren voor het bestuderen van andere co-transcriptionele RNA-verwerkings reacties die verband houden met het Pol II-rek complex.

In sectie 1 van dit protocol worden kunstmatige rek complexen gemaakt door het gloeien van een synthetisch sjabloononderdeel DNA oligonucleotide op een RNA-oligonucleotide dat complementair is aan 3 '-end tot ongeveer 9 nucleotiden van het template-strand-DNA. Pol II wordt vervolgens op het DNA: RNA duplex geladen. Het rekcomplex wordt vervolgens aangevuld door toevoeging van een gedeeltelijk aanvullend, niet-template-strand-DNA-oligonucleotide dat met biotine wordt aangeduid op 3 '-end (Figuur 1 en Figuur 2a). Het RNA-oligonucleotide wordt door Pol II in deze rek-complexen verlengd om van transcripten van gedefinieerde lengte en sequentie te maken bij toevoeging van geschikte combinaties van van-nucleotiden. Bovendien, met behulp van een combinatie van wassingen te verwijderen van de rechtsgebied nucleotiden en verdere toevoeging van verschillende combinaties van nucleotiden, men kan "lopen" Pol II naar verschillende posities langs de DNA-sjabloon en synthetiseren van RNA van gedefinieerde lengtes. RNA wordt vervolgens gezuiverd en onderworpen aan elektroforese in denaturerende ureum-pagina gels. In sectie 2 van het protocol worden kunstmatige rek complexen gebruikt om co-transcriptionele RNA-capping te analyseren. Het gepresenteerde voorbeeld meet het effect van de TFIIH-afhankelijke fosforylering van de Pol II CTD op co-transcriptionele RNA-capping. In dit experiment meten we de mate van co-transcriptionele capping als een functie van capping enzym concentratie (5, 15 en 45 ng per reactie) en tijd (1, 2 en 4 min).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. assemblage van kunstmatige rek complexen en Pol II Walking

  1. Immobiliseer 1 nmol van non-template DNA oligo met een 3 ' Biotine molecuul op magnetische kralen.
    Opmerking:     de volgende stappen kunnen vooraf worden uitgevoerd om u voor te bereiden op toekomstige experimenten. Alle in dit Protocol gebruikte oligo-sequenties zijn beschikbaar in tabel 1. RNA oligos worden gesynthetiseerd met 5 '-trifosfaat modificaties.
    1. Voeg 200 μL magnetische kralen (10 mg/mL) toe aan een laag-eiwitbinding 1,5 mL buis en plaats vervolgens op een magnetisch rek voor 2 min.
    2. Terwijl de buis op de magnetische rek, verwijder de vloeistof uit de buis zonder verstoring van de kralen. Om de kralen te wassen, verwijder de buis uit het rek, voeg 1 mL 5 mM tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, terug de buis naar het rek, en verwijder de wasoplossing na 2 min.
    3. REPEAT Spost nog 2 keer aan met 200 μL van dezelfde buffer.
    4. Respendeer magnetische parels in 400 μL van 10 mM tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, buffer. Meng vervolgens met 380 μl H2O en 20 μL van 10 μM niet-sjabloon biotinyleerd DNA oligo. Plaats de buis op een nutator en inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Wash geïmmobiliseerde non-template DNA oligo 3 keer met 200 μL van 5 mM tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, en vervolgens 3 keer met 200 μL 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL boviene serumalbumine.
    6. Laat de buis 's nachts bij 4 °C staan om kralen met BSA af te sluiten.
    7. De volgende dag, plaats de buis in het magnetische rek, verwijder en gooi de vloeistof, en respenderen kralen in 200 μL van 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL boviene serumalbumine en overdracht naar een nieuwe buis. Voor dit DNA-template is de uiteindelijke concentratie ongeveer 5 μM.
      Opmerking: Incubatietijd en oligo-concentratie moeten voor elke biotinyleerd DNA-oligo empirisch worden bepaald. Deze sjabloon moet voldoende zijn voor 200-reacties en ten minste 6 maanden duren bij opslag bij 4 °C.
  2. Anneal RNA en DNA sjabloon strand oligonucleotide oligos in een 2:1 molaire verhouding (20 en 10 pmol, respectievelijk) om het DNA te verkrijgen: RNA duplex.
    1. Stel een gloeien mengsel van 10 μL in zoals beschreven in tabel 2.
      NB: 10 μL gloeien mengsel is voldoende voor 10 reacties. De gloeien mix kan zo nodig worden opgeschaald als er meer assays moeten worden uitgevoerd.
    2. Voer de gloeien reacties uit in een thermische cycler met behulp van het volgende programma: 5 min bij 45 °C, gevolgd door 12 cycli van elk 2 min, beginnend bij 43 °C en een verlaging van de temperatuur 2 °C per cyclus. Stationair draaien bij 4 °C.
      Opmerking: Dit is een flexibel tijdpunt. Gloeien is binnen ~ 30 min afgewerkt, maar kan gedurende een langere periode bij 4 °C worden achtergelaten. In het laboratorium zijn gloeien mengsels tot 4 uur achter gelaten zonder enige afname van de reactie-efficiëntie te observeren.
    3. Terwijl het gloeien van RNA naar het template-strand DNA, buffers voorbereiden voor latere stappen van het protocol. De ingrediënten die nodig zijn om elke buffer voor een enkele reactie met elke buffer te bereiden, staan in de tabellen 2 tot en met 8. Schaal recepten op met een factor [Y (X + 1) + 1] voor Wash en (X + 1) voor alle andere buffers. X = aantal te bereiden reacties; Y = aantal benodigde wasstappen (minimaal 3).
      Opmerking: bereid alle buffers vers op de dag van het experiment. Plaats geen buizen op ijs nadat PVA aan buffers is toegevoegd. Voeg Pol II of nucleotiden toe aan buffers vlak voor gebruik.
  3. Laad gezuiverde RNA polymerase II op het DNA: RNA Hybrid.
    1. Meng 1 pmol (1 μL) DNA: RNA-duplex met 13 μL Pol II-buffer (uit tabel 3).
    2. Voeg ~ 0,02 eenheden gezuiverde RNA Pol II (1 μL) toe aan het mengsel van stap 1.3.1 en meng door zachtjes te pipetteren op en neer en roeren met pipetpunt, zonder bubbels te introduceren. Inincuberen gedurende 10 min bij 30 °C.
      Opmerking: De volumes die hier worden gegeven, zijn voor een enkele reactie; schaal omhoog naar behoefte voor het aantal reacties in het experiment. RNA Pol II gezuiverd van rat lever zoals beschreven10 wordt gebruikt in dit voorbeeld; echter, RNA Pol II gezuiverd uit andere bronnen, met inbegrip van gekweekte zoogdieren cellen of gist kan ook worden gebruikt3,4,5,11,12,13.
  4. Voltooi het rekcomplex door toevoeging van biotinyated niet-template DNA.
    1. Voeg 5 pmol (1 μL) geïmmobiliseerde non-template DNA-oligo toe aan 14 μL van een niet-template-DNA-buffer (uit tabel 4), voeg toe aan de buis uit stap 1.3.2 en incuberen gedurende 10 minuten bij 37 °c.
    2. Plaats het monster in magnetische rek voor 2 min. was 1x met 30 μL wasbuffer (uit tabel 7) om de plaats Pol II en oligos te verwijderen.
  5. Genereer rek complexen met van RNA 23mers.
    1. Doe alle verdere incubaties op 30 °C. Voeg 1 μL van 15 μM ATP en 10 μCi (1 μL) van [α-32P] UTP (3.000 CI/mmol) toe aan 23 μL pulsbuffer en gebruik dit om gewassen magnetische kralen te hervatten.
      Let op: Radioactief materiaal is gevaarlijk. Zorg ervoor dat u de juiste beschermende uitrusting draagt en alle labrichtlijnen volgt voor veilig gebruik en verwijdering van radioactief materiaal.
      Opmerking: Vervang radioolabeled UTP met 15 μM UTP wanneer van RNA niet nodig is, bijvoorbeeld voor westerse Blot-experimenten.
    2. Incuberen de reactie gedurende 10 min om de synthese van van 23mers mogelijk te maken.
    3. Voeg 1,5 μL oplossing met 100 μM ATP en een UTP-mix van 100 μM toe aan 3,5 μL Chase buffer, voeg toe aan buis met voorgemonteerde rek complexen en inbroed gedurende 5 minuten om alle ontluikende transcripten in 23mers te achtervolgen.
    4. Plaats het monster gedurende 2 minuten in een magnetisch rek, verwijder het supernatant, was één keer met 30 μL wasbuffer om de nucleotiden uit het gebied te verwijderen en breng in 30 μL van de reinigings buffer aan.
    5. Voeg 94 μL stop mengsel toe met proteïnase K en glycogeen (tabel 9) om reacties te beëindigen of ga verder naar sectie 1,6 om rek complexen met langere transcripties of sectie 2 te genereren om aftop testen uit te voeren.
  6. Optionele Walk Pol II om 23, 25 en 29 nucleotide transcripten te maken
    1. Volg de procedure beschreven in stap 1.2.1 tot en met 1.5.4 om rekcomplexen voor te bereiden met van 23mers. Opschalen 4-voudige voor het genereren van 120 μL van gewassen rek complexen, dat is genoeg complexen voor 4 reacties.
    2. Label 3 nieuwe tubes "23mer", "25mer" en "29mer". Breng 30 μl gewassen rek complexen over in de "23mer" buis en voeg 94 μL stop mengsel toe met proteïnase K en glycogeen.
    3. Plaats de buis met de resterende 90 μL van de gewassen rek complexen in het magnetische rek gedurende 2 minuten, verwijder het supernatant en hervat de kralen in 90 μL BTB, aangevuld met 1,2 μL elk van 1,5 mM ATP en 1,5 mM CTP. Inincuberen gedurende 10 min bij 30 °C.
    4. Na één keer wassen met 90 μL wasbuffer en resuspenderen in 90 μL wasbuffer zoals beschreven in stap 1.5.4, breng 30 μL rek complexen over naar de "25mer"-buis en voeg 94 μL stopmix toe met proteïinase K en glycogeen.
    5. Plaats de buis met de resterende 60 μL rekcomplexen in het magnetische rek gedurende 2 minuten, verwijder het supernatant en resteert kralen in 60 μL BTB aangevuld met 0,8 μL elk van 1,5 mM ATP en 1,5 mM CTP.
    6. Inbroeden gedurende 10 minuten bij 30 °C, één keer wassen met 60 μL wasbuffer zoals in punt 1.5.5, en respenderen in 60 μL wasbuffer.
    7. Breng 30 μl van 2x monster naar "29mer" buis en voeg 94 μL stop mengsel toe met proteïnase K en glycogeen of ga verder naar sectie 2 om capping testen uit te voeren.
    8. Ga verder naar RNA zuivering en analyse (rubriek 3).

2. gebruik van kunstmatige rek complexen om Cotranscriptionele capping te testen

  1. Genereer gewassen rek complexen met 23mers door de procedure zoals beschreven in stap 1.2.1 tot en met 1.5.5 13-voudig op te schalen. Dit is genoeg voor 12 Reacties + 1 extra.
  2. Pol II CTD fosforylering
    1. Plaats de buis met gewassen rek complexen in het magnetische rek voor 2 min, verwijder de supernatant, en respendeer kralen in 377 μL BTB aangevuld met 13 μL 1,5 mM ATP.
    2. Bereid twee nieuwe buizen, met het label + H en-H, respectievelijk. Voeg aan de buis met het label + H 3 μL ~ 300 ng/μL TFIIH toe en aan de buis met het label-H 9 μL van 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL boviene serumalbumine.
      Opmerking: We gebruiken meestal TFIIH gezuiverd van rat lever, maar we hebben vergelijkbare resultaten verkregen met behulp van ~ 0,6 μg/reactie van commercieel verkrijgbare recombinant Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK, de kinase module van TFIIH). Zie tabel met materialen voor meer informatie.
    3. Voeg 87 μL van de gewassen rek complexen toe van stap 2.2.1 tot de buis met het label + H en 270 μL van gewassen rek-complexen aan de buis met het label-H. inbroed 10 min bij 30 °C.
    4. Plaats monster in magnetische rek voor 2 min. Om overtollige nucleotiden en ongebonden eiwitten te verwijderen, was de verlenging van de rek in + H-en-H-reacties met respectievelijk 90 μL of 270 μL van de reinigings buffer.
  3. RNA-capping
    1. Respendeer de rek-complexen in de buis met het label + H in 87 μL capping mix (BTB aangevuld met 50 μM GTP (tabel 10). Respendeer de rek-complexen in de buis met het label-H in 261 μL capping mix.
    2. Maak 4 nieuwe tubes met label 5 ng CE + H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Verdund capping enzym (CE) in 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL boviene serumalbumine om oplossingen te bereiden die 5 ng CE/μL, 15 ng/μL of 45 ng CE/μL bevatten en doseer 3 μL van de passende oplossing in elk van de 4 buisjes.
    3. Bereid 12 nieuwe buisjes met 94 μL stop buffer (2.1.1) aan elk.
    4. Begin elke capping reactie door toevoeging van 87 μL rek complex met TFIIH of niet met gelabelde buisjes met capping enzym. Inincuberen bij 30 °C in een warmte blok.
    5. Na 1, 2 of 4 minuten stop reacties door het overbrengen van 30 μL van elk reactiemengsel naar buisjes met 94 μL stop buffer. Reinig en analyseer reactieproducten zoals beschreven in rubriek 3.

3. RNA zuivering en analyse

  1. Zuivert RNA
    1. Incubate reactieproducten in stop buffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Het pauze punt. Monsters in deze buffer zijn tot 4 uur bewaard zonder verlies of afbraak van RNA.
    2. Eenmaal uitpakken met 124 μL fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) en eenmaal met chloroform: Isoamylalcohol (24:1).
      Let op: Fenol is zeer giftig en wordt snel geabsorbeerd door de huid. Draag geschikte beschermende uitrusting.
      Opmerking: Om het herstel van RNA tijdens de extractie te maximaliseren, gebruikt u in de handel verkrijgbare buizen met een gel met hoge dichtheid, die een stabiele barrière vormt tussen waterige en organische fasen. Zie discussie en tabel met materialen.
    3. Breng de waterige fase (bovenste laag) over naar nieuwe buisjes met 12,4 μL van 3 M Natriumacetaat pH 5,2.
  2. Ethanol precipitatie
    1. Voeg 350 μL 100% ethanol toe en meng grondig door inversie.
    2. Inincuberen gedurende ten minste 10 min op droogijs.
      Opmerking: Het pauze punt. Voor het gemak kan men hier stoppen en de procedure op de volgende dag afronden; het is echter mogelijk om direct door te gaan naar stap 3,3 en de gel op dezelfde dag uit te voeren. RNA kan gedurende een paar dagen vóór de verdere verwerking bij-80 °C worden bewaard, maar laat geen langere tijd achter.
  3. Voorbereiding van RNA monsters voor gel elektroforese
    1. Laat monsters ontdooien, Meng door 2-3 keer om te keren en centrifugeer 15 min bij 21.000 x g, 4 °c, in een tafel centrifuge. Ondertussen, het opzetten van denaturering gel mix (paragraaf 3.4.1).
    2. Verwijder voorzichtig ethanol uit monsters zonder storende pellet.
    3. Voeg 500 μL 70% ethanol toe, Inverteer de buis een paar keer om pellets te wassen en centrifugeer vervolgens opnieuw bij 21.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur of 4 °c.
    4. Verwijder zo veel mogelijk ethanol en doe een snelle spin (5-10 s) van de buisjes in een tafelblad centrifuge. Verwijder vervolgens met een gel-loading tip het laatst overgebleven volume ethanol.
    5. Lucht-droge pellet voor 3 min bij kamertemperatuur.
    6. Los RNA op door 4 μL H2O toe te voegen aan de bovenkant van elke pellet. Inincuberen 5 min bij kamertemperatuur.
    7. Voeg 4 μL van 2x RNA Dye (Zie tabel van de materialen) toe aan de mix en draai vervolgens een paar seconden door elke buis om RNA volledig te hervatten.
      Opmerking: RNA-kleurstof die formamide bevat in plaats van ureum wordt aanbevolen, omdat de laatste precipiteert bij lage temperaturen.
    8. Snel-spin de buizen, en vervolgens inbroed ze op 70 °C gedurende 10 minuten in een warmte blok.
    9. Bewaar tubes op droogijs tot ze klaar zijn om te worden geladen op gel.
      Opmerking:       het houden van RNA op droogijs maakt de flexibiliteit mogelijk om aan andere experimenten te werken terwijl de gel polymerisatie is. Monsters hoeven na ontdooien niet opnieuw te worden verwarmd. RNA kan echter direct na het verwarmen worden geladen als de gel klaar is om te worden uitgevoerd.
  4. Voorbereiding van ureum-pagina gel
    1. Voor 40 mL gel mix, combineer in een conische buis van 50 mL: 16,7 g ureum, 15 mL 40% bis: acrylamide oplossing (19:1 ratio), 4 mL 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M natriumboraat, 20 mM EDTA) en 8 mL H2O. Dit volume is voldoende voor een standaard maat gel (18 cm hoog x 16 cm breed) met 1,0 mm spacers.
      Let op: Acrylamide is uiterst giftig. Hoewel er geen inhalatie risico is wanneer het in oplossing is, moet u altijd een Labcoat, handschoenen en veiligheidsbril dragen tijdens het hanteren.
      Opmerking: Dit mengsel is voor het gieten van een denaturerende 15% polyacrylamidegel, die gemakkelijk herstelt RNA tussen 15-50 NT. Verander de concentratie van bis/acrylamide naar behoefte om verschillende RNA transcripten van verschillende lengtes op te lossen.
    2. Plaats de gesloten buis met gelmix op een nutator totdat ureum volledig is opgelost.
    3. Set-up gel-Casting station met glazen platen, 1 mm spacers en een 15-well kam.
    4. Werk snel, voeg 40 μL TEMED en 400 μL van 10% ammonium persulfate oplossing toe aan de geloplossing en meng goed. Met behulp van een 25 mL Pipet, giet gel oplossing tussen platen, invoegen kam, en laat de gel polymeriseren voor ten minste 2 h.
      Opmerking: Als de gel wordt gegoten meer dan 2 h voor gebruik, zodra het heeft gepolymeriseerde bedekken met vochtige papieren handdoek (het verlaten van de kam op zijn plaats) en wikkel met plastic folie om te voorkomen dat het uitdrogen.
  5. Denaturing gel RNA elektroforese
    1. Na polymerisatie, overdracht gel naar Running tank en pre-run het op 20 mA in 1x TBE voor 15-30 min.
    2. Ondertussen ontdooien de monsters (indien bevroren), Vortex en draaien ze 4 min bij 2.000 x g, 4 °c.
    3. Wanneer u klaar bent, schakelt u de voeding uit en spoelt u voorzichtig elk goed met 1x TBE met een spuit.
    4. Gebruik gel-loading tips om samples op de gel te laden.
    5. Run gel op een constante 20-30 mA gedurende ongeveer 2 uur of tot de lagere kleurstof (xyleen cyanol FF) de bodem van de gel bereikt.
  6. Verwijder de gel, plaats deze op een stuk absorberend papier en wikkel met plastic folie.
  7. Stel de van gel bloot aan een fosforscreen.
  8. Scan phosphorscreen met behulp van een foshorimager en analyseer de afbeelding.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuren 2 en 3 vertonen representatieve resultaat reacties die worden gebruikt om kunstmatige rek complexen te genereren met transcripties van verschillende lengtes door uitbreiding of Pol II uit verschillende bronnen. Figuur 4 toont hoe deze rek-complexen kunnen worden gebruikt om co-transcriptionele CTD-fosforylering-afhankelijke RNA-capping te testen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Studies die zijn gericht op het ontleden van gebeurtenissen gekoppeld aan het Pol II rekcomplex zoals RNA verwerking en regulatie van de transcriptie verlenging zelf kunnen sterk worden vergemakkelijkt door het gebruik van een zeer gezuiverd enzymsysteem. Het opzetten van dergelijke enzym systemen kan een uitdaging zijn. Door de organisator afhankelijke transcriptie van Pol II zijn ten minste vijf algemene transcriptiefactoren vereist. Voorbereiding en inventarisatie van deze factoren kan maanden duren; Vandaar dat de sn...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We bedanken S. Shuman voor het leveren van het zoogdier capping enzym cDNA. Dit werk werd deels gesteund door een subsidie aan het Stowers Institute for Medical Research van het Helen Nelson Medical Research Fund bij de Greater Kansas City Community Foundation.  Originele gegevens die aan dit manuscript zijn gelinkt, kunnen worden geraadpleegd vanuit de Stowers Original data repository op http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCiPerkin ElmerNEG007H001MCVoor radiolabeling van RNA
2x RNA loading dyeNew England BiolabsB0363SZeer aanbevolen. Voor het voorbereiden van RNA tijdens het laden van gel
40% Bis:Acrylamide-oplossingBiorad1610144
Bovine Serum Albumine (20 mg/mL)New England BiolabsB9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK-complex)-eiwit, actief, 10 µgMillipore Sigma14-476Gebruikt om Pol II CTD te fosforyleren
DNA-oligonucleotidenIDTZie Tabel 8 voor zuiverheidsspecificaties
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies Invitrogen65001We hebben ook Dynabeads M-280 streptavidin gebruikt zonder probleem, maar geven de voorkeur aan MyOne Streptavidin-kralen omdat ze langzamer sedimenteren
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)Life Technologies InvitrogenAM9516Zeer aanbevolen. Verft nucleïnezuurpellet blauw waardoor reacties veel gemakkelijker te hanteren zijn
Hoefer SE600 standaard dubbel gekoeld verticaal elektroforesesysteem met 1 mm ruimtes en 15 welschepHoeferSE600-15-1.5
MaXtract hoge dichtheid buizen (1,5 mL)Qiagen129046Zeer aanbevolen. Bevat een hoge dichtheidsgel die een stabiele barrière vormt tussen waterige en organische fasen; verbetert RNA-opbrengsten tijdens extracties
Proteinase K-oplossing (20 mg/mL)Life Technologies Invitrogen25530049
RNA-oligonucleotidenTrilinkZie Tabel 8 voor meer details
Gist Anorganische Pyrofosfatase (100 eenheden/mL)New England BiolabsNEBM2403SAlleen vereist tijdens afkapreacties

Referenties

  1. Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
  2. Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
  3. Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
  4. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
  5. Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392(2018).
  6. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
  7. Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
  8. Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
  9. Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
  10. Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
  11. Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
  12. Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
  13. Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
  14. Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
  15. Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
  16. Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
  17. Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
  18. Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
  19. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Elongatiecomplexco-transcriptionele cappingkunstmatige transcriptiebubbelsimmobilisatie met magnetische beadsDNA-RNA-duplexTFIIH-fosforyleringcapping-enzymassaydenaturerende polyacrylamidegelanalyse van radiogemarkeerd
Kunstmatige RNA polymerase II-rek complexen voor het ontleden van co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.