Methodenartikel

Gebruik van een lineaire versneller voor het uitvoeren van in vitro radiobiologie experimenten

DOI:

10.3791/59514

⸱

26 mei 2019

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Cleveland Clinic, 2Department of Radiation Oncology, Cleveland Clinic

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinische lineaire versnellers kunnen worden gebruikt om de biologische effecten van een breed scala aan doserings percentages op kankercellen te bepalen. We bespreken hoe het opzetten van een lineaire Accelerator voor cel gebaseerde testen en testen voor kanker stam-achtige cellen gekweekt als tumorspheres in suspensie en cellijnen gekweekt als aanhandende culturen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radiotherapie blijft een van de hoekstenen van het kanker management. Voor de meeste kankers, het is de meest effectieve, nonchirurgische therapie om te debulk tumoren. Hier beschrijven we een methode om kankercellen te bestreren met een lineaire versneller. De vooruitgang van lineaire Accelerator technologie heeft de precisie en efficiëntie van bestralingstherapie verbeterd. De biologische effecten van een breed scala aan stralingsdoses en doserings percentages blijven een intens onderzoeksgebied. Het gebruik van lineaire versnellers kan deze studies vergemakkelijken met behulp van klinisch relevante doses en doserings percentages.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radiotherapie is een effectieve behandeling voor vele soorten kanker1,2,3,4. Een extra hoge dosis bestraling is relatief nieuw in bestralingstherapie en wordt mogelijk gemaakt door recente technologische ontwikkelingen in lineaire versnellers5. De klinische voordelen van een extra hoog doserings percentage over de standaard bestraling omvatten een verkorte behandelingstijd en een verbeterde patiëntervaring. Lineaire versnellers bieden ook een klinische instelling voor cel cultuur gebaseerde straling biologie studies. De biologische en therapeutische implicaties van stralingsdosis en doserings percentages zijn een aandachtspunt geweest van stralings oncologen en biologen gedurende decennia6,7,8. Maar, de radiobiologie van extra hoge dosis snelheid bestraling en flits bestraling-een extreem hoge dosis straling-moet nog grondig worden onderzocht.

Gamma straal bestraling wordt veel gebruikt in celcultuurgebaseerde stralings biologie9,10,11. Straling wordt bereikt door gammastralen uit rottende radioactieve isotopen bronnen, typisch cesium-137. Het gebruik van radioactieve bronnen is sterk gereguleerd en vaak beperkt. Met brongebaseerde bestraling is het lastig om een breed scala aan doserings percentages te testen, waardoor het nut ervan wordt beperkt in de analyse van de biologische effecten van klinische haalbare dosis snelheden12.

Er zijn verschillende studies die zowel dosis en dosis rate effecten illustreren12,13,14,15,16,17. In deze studies, beide gamma-bestraling gegenereerd uit radioactieve isotopen of röntgenstralen gegenereerd uit lineaire versnellers werden gebruikt. Er werden verschillende cellijnen gebruikt die longkanker, baarmoederhalskanker, glioblastomen en melanoom vertegenwoordigen. Stralingseffecten op de overleving van cellen, arrestatie van celcyclus, apoptosis en DNA-beschadiging werden geëvalueerd als uitlezingen12,13,14,15,16,17 . Hier beschrijven we een methode om de biologische effecten van klinisch relevante stralingsdosis en dosis snelheden te definiëren door röntgenstraling te leveren met behulp van een lineaire versneller. Deze studies moeten worden uitgevoerd met nauwe samenwerking tussen de bioloog, stralings oncoloog en medische fysicus.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. celvoorbereiding voor suspensie celkweek

  1. Cultuur glioom stam-achtige cellen in stamcel kweekmedia op ongeveer 5 x 106 cel/10 cm platen in een cel kweek incubator met 5% Co2, 95% relatieve vochtigheid bij 37 °c.
    Opmerking: de celkweek voorwaarde is in alle procedures hetzelfde. De media die in het protocol worden gebruikt, zijn volledige media.
  2. Verzamel twee dagen voor de geplande bestraling glioom stam-achtige cellen uit de kweek plaat met een steriele 5 ml pipet in een centrifugebuis van 15 ml in een kweek kapje.
  3. Centrifugeer de verzamelde cellen gedurende 3 minuten bij 200 x g in een aanwerk blad centrifuge.
  4. Gooi de supernatant weg en verteren de celpellet (ongeveer 1 x 107 cellen) met 1 ml trypsine-EDTA bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten om een enkelvoudige celsuspensie in trypsine-EDTA te maken. Schud de onderkant van de centrifugebuis zachtjes om de 2 minuten tijdens de spijsvertering om ervoor te zorgen dat de cellen grondig worden verteerd.
  5. Voeg 3 mL stamcel kweekmedia toe (Zie de tabel met materialen) om trypsine te bluchken. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 200 x g gedurende 3 minuten in een tegentopcentrifuge. Gooi het supernatant weg en bewaar de celpellet.
  6. Respendeer de cellen met 5 mL celkweek media en Tel de cellen met een hemocytometer.
  7. Plaat 5 x 106 cellen in 2 10 cm platen met 10 ml celkweek media.
  8. Vlak voor de geplande bestraling, verzamel de cellen en gooi het supernatant na centrifugeren zoals beschreven in stap 1,3. Resuspendeer de celpellet met 5 mL celkweek media. Breng 1 mL celsuspensie over in een 35 mm plaat met 2 mL celkweek media.
    Opmerking: het totale volume van de media is 3 mL in de 35 mm plaat om de vloeistof 1 cm hoog in de plaat te maken.
  9. Breng de vergulde cellen in een secundaire container, zoals een plastic of schuim doos, om het risico van verontreiniging te verminderen en breng de cellen in de container naar de bestralings faciliteit op de Utility Cart.
  10. Bestraleren de cellen zoals beschreven in stap 4.

2. celvoorbereiding voor de bijgevoegde celcultuur

  1. Een dag voor de bestraling, in de cel cultuur kap, verwijder de DMEM media uit de celkweek plaat van de bijgevoegde cellijn, zoals HEK-293 cellen. De media kunnen worden gezogen met behulp van een Pasteur-pipet die is aangesloten op een vacuüm.
  2. Spoel cellen met 5 mL steriele PBS naar de kweek schaal om rest media af te spoelen.
  3. Pipetteer 1 mL trypsine-EDTA in de kweek schaal en kantel de kweek plaat zachtjes om ervoor te zorgen dat het hele gerecht bedekt is met trypsine-EDTA.
  4. Trypsinoseer cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Quench de trypsine-EDTA-reactie met 3 mL DMEM-media en verzamel cellen met een pipet van 5 mL in een centrifugebuis van 15 mL in de kweek afzuigkap.
  5. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 200 x g gedurende 3 minuten in een tegentopcentrifuge. Gooi het supernatant weg en bewaar de celpellet.
  6. Respendeer de cellen met 5 mL DMEM media en Tel de cellen met een hemocytometer.
  7. Plaat 2 x 105 cellen in een 35 mm plaat met 3 ml celkweek media tot een hoogte van 1 cm van de media.
  8. Na 24 uur celkweek in de incubator bij 37 °C, de vergulde cellen in een secundaire container (d.w.z. een geïsoleerde schuim doos) overbrengen naar de bestralings faciliteit op een Utility Cart.
  9. Bestraleren cellen zoals beschreven in stap 4.

3. celvoorbereiding voor immunokleuring na bestraling

  1. Commerciële extracellulaire eiwit matrix ontdooien op ijs bij 4 °C 's nachts. Pre-chill 200 μL pipetpunten en 1,5 mL centrifugebuizen bij 4 °C 's nachts.
  2. Aliquot extracellulaire eiwit matrix met voorgekoelde pipetpunten en 1,5 mL centrifugebuizen bij 200 μL per buis.
  3. Verdun 200 μL extracellulaire eiwit matrix in voorgekoelde 20 mL celkweek media om 1% extracellulaire eiwit matrix media te maken.
  4. Plaats een gesteriliseerde dekslip (22 mm x 22 mm) in een 35 mm plaat. Plaats 400 μL van 1% extracellulaire eiwit matrix media op de dekslip.
  5. Plaats de 35 mm-plaat in de celkweek incubator bij 37 °C gedurende 1 uur, zodat de extracellulaire eiwit matrix op de dekslip kan worden gepolymeriseert.
  6. Wanneer u de suspensie celcultuur gebruikt, moet u een enkele celsuspensie maken zoals beschreven in de stappen 1,1 tot en met 1,5.
  7. Plaat 5 x 104 cellen op een extracellulaire eiwit matrix-gecoate afdek geplaatst in een 35 mm plaat. Retourneer de cellen van de celcultuur 's nachts om ervoor te zorgen dat cellen worden ondersteund door de eiwit matrix. Het totale volume van de media in de plaat moet 3 mL zijn om de hoogte van de media 1 cm te laten bereiken in de kweek schaal.
  8. Observeer de cellen onder een heldere veld microscoop met een 10x vergroting objectief lens. De cellen moeten zich op de dekslip verspreiden in plaats van drijven. Breng de kweek schaal met vergulde cellen over in een secundaire container, zoals een schuimbak naar de bestralings faciliteit op een Utility-kar, en laat de cellen bestreren zoals beschreven in stap 4.
  9. Bij het gebruik van bijgevoegde celculturen (bijvoorbeeld HEK-293 cellen), Digest cellen zoals beschreven in stap 2,1 naar 2,6. Plaats 5 x 104 cellen op een steriele afdekkap in een 35 mm plaat één dag vóór de bestraling om ervoor te zorgen dat de cellen volledig op het afdek oppervlak zijn bevestigd door ze onder een microscoop te observeren zoals in stap 3,9. Gebruik 3 mL DMEM media om de vloeistof 1 cm hoog te maken in de plaat.
  10. Na het kweken van cellen op dekstroken 's nachts of tot één dag, breng de kweek schotel met vergulde cellen in een secundaire container over naar de bestralings faciliteit. Een Utility cart kan worden gebruikt om het risico op morsen te verminderen. Bestraleren cellen zoals beschreven in stap 4.

4. bestraling met een lineaire versneller (LINAC)

  1. Gebruik de CONSOLESOFTWARE van de Linac, stel de Accelerator portaal en collimator in op 0 °, open de X-en Y-Jaws naar een symmetrische veld grootte van 20 X 20 cm2 en trek de meerbladige collimatoren (mlc's) in als deze aanwezig zijn.
    Opmerking: LINACs kan een afvlakkings filter vrije (FFF) modus hebben, waardoor zeer hoge doserings snelheden mogelijk zijn. Zoals de naam al suggereert, deze straling is niet uniform (plat), en de hoge dosis snelheid wordt alleen bereikt in het midden van de straal. In dit geval wordt een 7 x 7 cm2 veld gebruikt.
  2. Plaats ten minste 5 cm water-equivalent materiaal op de behandel Bank. Plaats de celschotel om te worden bestraald bij 400 MU/min (standaard dosis snelheid) op het water equivalente materiaal en zet het op het LINAC-dradenkruis.
  3. Plaats de cellen om te worden bestraald op een diepte van de maximale dosis in een 6 MV X-Ray Beam, rond 1,5 cm. plaats een extra 1 cm water equivalent materiaal bovenop het schaaltje. In combinatie met de 1 cm van het medium waar de cellen worden opgehangen, plaatst dit de cellen op een gemiddelde diepte van 1,5 cm.
  4. Bevestig de voorste aanwijzer op de kop van de LINAC. Strek de voorste aanwijzer uit tot het contact maakt met het oppervlak van het opbouw materiaal en noteer de afstand. Pas de tafel hoogte aan tot de afstand van de bron tot het opbouw oppervlak 100 cm is.
    Opmerking: de afstand kan worden bevestigd met de optische afstandsaanduiding. Als alternatief kan de optische afstandsaanduiding worden gebruikt in plaats van de voor aanwijzer om de bron in te stellen op een opbouw oppervlak van 100 cm.
  5. Bereken het juiste aantal monitor eenheden (MU) om de gewenste dosis straling aan de cellen te leveren en het gaspedaal te programmeren om 400 MU/min te leveren.
    Opmerking: voor de bron naar de Surface distance (SSD) Setup op een LINAC gekalibreerd om 1 cGy/MU te leveren op de diepte van de maximale dosis, wordt het vereiste aantal monitor eenheden berekend met behulp van MU = dosis (cGy)/(1 cGy/MU)/van (20x20), waar van stands voor output factor. Deze berekening moet worden gewijzigd voor LINACs met behulp van alternatieve kalibratie-instellingen.
  6. Verlaat de behandelingkluis en controleer of alle andere personen zijn verlaten. Vrify dat er geen andere cellen in de kamer, of ze zullen lage doses straling ontvangen. Sluit de kluis deur.
  7. Bevestig de veld grootte, MU en MU/min op de console en schakel vervolgens de straal in.
  8. Herhaal stap 4.3-4.8 voor de cellen die moeten worden bestraald bij hogere of lagere dosis snelheden.
    1. Om hogere dosis snelheden (bijv. 2100 MU/min of hoger) met het gaspedaal te bereiken, verlaagt u de SSD om de effectieve dosis snelheid naar de cellen te verhogen volgens de inverse Square wet: DoseRateEffective = Doserate * (100 cm/SSD_New)2.
    2. Voor lage dosis snelheden (bijv. 20 MU/min), Verhoog de bron tot de oppervlakte afstand (SSD_New) om het doserings percentage te verlagen. De celkweek schotel kan bijvoorbeeld op de vloer van de behandelkamer worden geplaatst.
    3. Bereken de instelling van de monitor eenheid op het gaspedaal als deze instelling nodig is, met behulp van MU = dosis (cGy)/(1 cGy/MU)/van (20x20)/(100 cm/SSD_New)2. Raadpleeg voor meer informatie over MU-berekeningen de verwijzing door McDermott en Orton18.
  9. Bepaal de dosis snelheid in Gy/minuut door DoseRate (Gy/min) = dosis (Gy) * (MU/min)/MU. bijvoorbeeld, 4 GY geleverd op 400 MU/min vereist 380 MU, dus 4 * 400/380 = 4,2 Gy/min. Zie tabel 1.

figure-protocol-1
Figuur 1 : Opstelling van de celkweek schotel op lineaire versneller. A) een klinische lineaire versneller wordt getoond. B) 5 cm water-equivalent materiaal wordt op de behandel Bank geplaatst. C) er wordt een celkweek schotel op het oppervlak van het materiaal geplaatst. D) de schaal wordt gecentreerd met behulp van de versnellings draden in het behandelings veld dat wordt weergegeven door het veld vierkant licht. E) 1 cm water-equivalent materiaal wordt bovenop de celkweek schotel geplaatst. De bron naar de Surface distance (SSD) wordt gecontroleerd met behulp van een optische afstandsaanduiding (F, G) of een voor aanwijzer (H, I). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

5. biologische assays na bestraling

  1. Na bestraling, de cellen op dezelfde manier als hierboven beschreven (stap 1,9, 2,8 en 3,10) terugbrengen naar de celkweek incubator.
  2. Indien nodig, op maat van een verscheidenheid van biologische assays te passen in het onderzoeksproject.
    Opmerking: hier tonen we een representatieve celcyclus analyse16 als een voorbeeld van een biologische assay na bestraling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het celcyclus effect van het standaard doserings tarief en de extra hoge dosis straling door een lineaire versneller te onderzoeken, werden drie monsters van glioom stam achtige cellen bereid met behulp van dit protocol en verzamelde 24 h na bestraling17: één controlemonster dat niet bestraald is (Figuur 2A), één monster BESTRAALD met 400 mu/min (monitor eenheid, 4,2 Gy/min standaard dosis snelheid, Figuur 2B

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radiotherapie is een integraal onderdeel van kanker management. Voortdurende inspanningen trachten de werkzaamheid en efficiëntie van de stralings behandeling te verbeteren. Verbeteringen in lineaire Accelerator technologie hebben de mogelijkheid geboden om patiënten met ongekende nauwkeurigheid en veiligheid te behandelen. Omdat de meeste patiënten worden behandeld met hoge energie X-stralen van lineaire versnellers, kunnen onderzoeken naar de biologische effecten van een groot aantal dosis snelheden die worden uitgevoe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken het departement Cleveland Clinic van stralings Oncologie voor het gebruik van de lineaire versnellers. We danken Dr. Jeremy Rich voor zijn gulle gave van glioom stam-achtige cellen. Dit onderzoek werd gesteund door de Cleveland Clinic.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal
glioma stamcel-achtige cel 387geschenk van Dr. Jeremy Rich
293 cellenATCCCRL-1573
neuron stamcel kweekmediumThermo Fisher Scientific21103049NeurobasalTM medium
DMEMThermo Fisher Scientific10569044
Foetaal RunderserumThermo Fisher Scientific16000044
Penicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific15140-122
Recombinant Humaan EGF-eiwitR&D Systems236-EG-01M
Recombinant Humaan FGF basisR&D Systems4114-TC-01M
B-27™ SupplementThermo Fisher Scientific17504044
Natrium PyruvaatThermo Fisher Scientific11360070
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030164
Trypsine-EDTAThermo Fisher25200056
extracellulaire proteïne matrixCorning354277MatrigelTM
EthanolFisher chemicalA4094
Apparatuur
10 cm celkweekschaalDenvilleT1110
3.5 cm celkweekschaalUSA Scientific Inc.CC7682-3340
22x22mm glazen dekselelectron microscopy sciences72210-10
15 ml centrifugebuisThomas Scientific1159M36
50 ml centrifugebuisThomas Scientific1158R10
5 ml PipetFisher Scientific14-955-233
pipet hulpmiddelFisher Scientific13-681-06
VortexmixerFisher Scientific02-215-414
CentrifugeEppendorf5810R
Lineaire AcceleratorVariann/a
waterequivalent materiaalSun Nuclear corporation557Solid waterTM
Reagensvoorbereiding
DMEM medium10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 eenheden/mL penicilline G, 100 µg/mL streptomycine in 500 ml DMEM medium
stamcel kweekmedium10 ml B27 supplement, 20 µg hFGF, 20 µg hEGF, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden/mL penicilline G, 100 µg/mL streptomycine in 500 ml Neurobasal medium

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Stupp, R., et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. The Lancet Oncology. 10 (5), 459-466 (2009).
  3. Tao, R., et al. Hypoxia imaging in upper gastrointestinal tumors and application to radiation therapy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1044-1053 (2018).
  4. Gajiwala, S., Torgeson, A., Garrido-Laguna, I., Kinsey, C., Lloyd, S. Combination immunotherapy and radiation therapy strategies for pancreatic cancer-targeting multiple steps in the cancer immunity cycle. Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1014-1026 (2018).
  5. Liney, G. P., Whelan, B., Oborn, B., Barton, M., Keall, P. MRI-Linear accelerator raiotherapy systems. Clinical Oncology Journal | The Royal College of Radiologists. 30 (11), 686-691 (2018).
  6. Hall, E. J. Radiation dose-rate: a factor of importance in radiobiology and radiotherapy. The British Journal of Radiology. 45 (530), 81-97 (1972).
  7. Steel, G. G., et al. The dose-rate effect in human tumour cells. Radiotherapy & Oncology. 9 (4), 299-310 (1987).
  8. Ling, C. C., Gerweck, L. E., Zaider, M., Yorke, E. Dose-rate effects in external beam radiotherapy redux. Radiotherapy & Oncology. 95 (3), 261-268 (2010).
  9. Castro, G., et al. Amotosalen/UVA treatment inactivates T cells more effectively than the recommended gammadose for prevention of transfusion-associated graft-versus-host disease. Transfusion. 58 (6), 1506-1515 (2018).
  10. Gaddini, L., et al. Exposing primary rat retina cell cultures to γ-rays: An in vitro model for evaluating radiation responses. Experimental Eye Research. 166, 21-28 (2018).
  11. Simara, P., et al. DNA double-strand breaks in human induced pluripotent stem cell reprogramming and long-term in vitro culturing. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 73(2017).
  12. Wang, Z., et al. A comparison of the biological effects of 125I seeds continuous low-dose-rate radiation and 60Co high-dose-rate gamma radiation on non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 10 (8), 0133728(2015).
  13. Lasio, G., Guerrero, M., Goetz, W., Lima, F., Baulch, J. E. Effect of varying dose-per-pulse and average dose rate in X-ray beam irradiation on cultured cell survival. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (4), 671-676 (2014).
  14. Karan, T., et al. Radiobiological effects of altering dose rate in filter-free photon beams. Physics in Medicine and Biology. 58 (4), 1075-1082 (2013).
  15. Sarojini, S., et al. A combination of high dose rate (10X FFF/2400 MU/min/10 MV X-rays) and total low dose (0.5 Gy) induces a higher rate of apoptosis in melanoma cells in vitro and superior preservation of normal melanocytes. Melanoma Research. 25 (5), 376-389 (2015).
  16. Hao, J., et al. The effects of extra high on glioma stem-like cells. PLoS One. 13 (8), 0202533(2018).
  17. Liu, J., et al. Radiation-induced G2/M arrest rarely occurred in glioblastoma stem-like cells. International Journal of Radiation Biology. 94 (4), 394-402 (2018).
  18. Mcdermott, P., et al. The Physics and Technology of Radiation Therapy. , Medical Physics Pub Corp. Madison WI. (2010).
  19. Lohse, I., et al. Effect of high dose per pulse flattening filter-free beams on cancer cell survival. Radiotherapy & Oncology. 101 (1), 226-232 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RadiotherapieCelbestralingDosisdebietanalyseVoorbereiding van CelculturenGlioomstamcellenCelcyclusanalyseDosimetrische BerekeningenInrichting van de BehandelruimteWaterequivalent Materiaal

Gerelateerde artikelen