Monitoring van bacteriële kolonisatie en onderhoud op Arabidopsis thaliana wortels in een drijvend Hydroponisch systeem

Samenvatting

Hier beschrijven we een hydroponische plantengroei test om de aanwezigheid van soorten te kwantificeren en de ruimtelijke verdeling van bacteriën te visualiseren tijdens de initiële kolonisatie van planten wortels en na hun overdracht in verschillende groei omgevingen.

Samenvatting

Bacteriën vormen complexe rizosfeer microbioom gevormd door het interageren van microben, grotere organismen en de abiotische omgeving. Onder laboratoriumomstandigheden kan de kolonisatie van rizosfeer door plantengroeibevorderende bacteriën (pgpb) de gezondheid of de ontwikkeling van gastheerplanten ten opzichte van ongekoloniseerde planten verhogen. In de veldinstellingen bieden bacteriële behandelingen met PGPB echter vaak geen substantiële voordelen voor gewassen. Een verklaring is dat dit kan te wijten zijn aan verlies van de PGPB tijdens interacties met endogene grond microben over de levensduur van de plant. Deze mogelijkheid was moeilijk te bevestigen, omdat de meeste studies zich richten op de initiële kolonisatie in plaats van het onderhoud van pgpb binnen rizosfeer communities. Het is hier veronderstelde dat de assemblage, coëxistentie, en het onderhoud van bacteriële Gemeenschappen worden gevormd door deterministische kenmerken van de rizosfeer micro omgeving, en dat deze interacties kunnen invloed hebben op de overleving van pgpb in native Settings. Om dit gedrag te bestuderen, wordt een hydrocultuur plant-growth assay geoptimaliseerd met behulp van Arabidopsis thaliana om de ruimtelijke verdeling van bacteriën te kwantificeren en te visualiseren tijdens de initiële kolonisatie van planten wortels en na overdracht naar verschillende groei Omgevingen. De reproduceerbaarheid en het nut van dit systeem worden vervolgens gevalideerd met de goed bestudeerde PGPB Pseudomonas simiae. Om te onderzoeken hoe de aanwezigheid van meerdere bacteriesoorten de kolonisatie en de onderhouds dynamiek op de wortel van de plant kan beïnvloeden, een model Gemeenschap van drie bacteriële stammen (een Arthrobacter, Curtobacteriumen micro bacterie soorten) oorspronkelijk geïsoleerd uit de A. thaliana rizosfeer is geconstrueerd. Het is aangetoond dat de aanwezigheid van deze verschillende bacteriesoorten kan worden gemeten met behulp van deze hydrocultuur plant-maintanence Assay, die een alternatief biedt voor op sequentiëren gebaseerde bacteriële Gemeenschaps studies. Toekomstige studies met behulp van dit systeem kunnen het begrip van bacterieel gedrag in diepte plant microbioom na verloop van tijd en in veranderende omgevingsomstandigheden verbeteren.

Inleiding

Gewasvernietiging door bacteriële en schimmelziekten resulteert in een verlaagde voedselproductie en kan de mondiale stabiliteit ernstig verstoren¹. Op basis van de ontdekking dat microben in onderdrukkende bodems verantwoordelijk zijn voor het verhogen van de plantengezondheid², hebben wetenschappers gevraagd of de plant-microbiome kan worden ingezet om de plantengroei te ondersteunen door de aanwezigheid en overvloed van bepaalde bacteriesoorten³. Bacteriën gevonden om te helpen bij de groei van planten of ontwikkeling worden gezamenlijk genoemd plant groeibevorderende bacteriën (PGPB). Meer recentelijk zijn studies verschoven van het simpelweg identificeren van potentiële pgpb om te begrijpen hoe interkingdom-interacties in de bodem, rond wortels of in de rizosfeer (het gebied direct rond en inclusief het worteloppervlak) kunnen beïnvloeden pgpb activiteit⁴.

De kolonisatie van rhizosphere door PGPB kan de gezondheid of de ontwikkeling van gastheerplanten verhogen als reactie op diverse stressoren ten opzichte van ongekoloniseerde planten⁵. Echter, resultaten zijn vaak meer variabel in inheemse bodemomstandigheden in vergelijking met die waargenomen in de streng gecontroleerde kas en laboratorium instellingen⁶. Een hypothese voor dit verschil is dat de groei of het gedrag van pgpb kan worden geremd door inheemse bodembacteriën of schimmels in de velden^7,8. Gunstige effecten door rizosfeer bacteriën in het algemeen afhangen van het vermogen van de bacteriën 1) lokaliseren en verplaatsen naar de wortel, 2) koloniseren de wortel door middel van biofilm vorming, en 3) interactie met de gastheerplant of pathogenen via de productie van kleine molecule de metabolieten^7,9. Elk van deze kolonisatie gedrag kan worden beïnvloed door de aanwezigheid en de activiteit van naburige microben¹⁰.

We ontwierpen een systeem om deze verschillende bacteriële kolonisatie stadia van de rizosfeer te kwantificeren en te visualiseren (Figuur 1). Deze aanpak vergemakkelijkt studies die onderzoeken waarom het onderhoud op lange termijn van PGPB soms niet wordt waargenomen na de overdracht van planten in nieuwe omgevingen, zoals tijdens het planten van voorgeënt zaailingen. Arabidopsis thaliana as werden gekozen als een plant model als gevolg van het uitgebreide gebruik in laboratoriumonderzoek, evenals de ruime gegevens beschikbaar over de microbiële interacties¹¹. Er zijn drie fasen in het systeem: 1) A. thaliana groei, 2) bacteriële kolonisatie, en 3) bacteriële onderhoud (Zie Figuur 1). Omdat a. thaliana een terrestrische plant is, was het belangrijk om ervoor te zorgen dat het niet onnodig waterstress leed in het hydroponische systeem¹². Geïnspireerd door de methoden die Haney et al.¹³gebruikt, worden de zaailingen geteeld op kunststof gaas om de opname van het vloeistof groeimedium te scheiden. Dit systeem lijkt niet in gevaar te brengen de gezondheid en de ontwikkeling van de gastheer van de plant, en het verbetert A. thaliana groei in vloeistof¹¹. Naarmate de plant zweeft boven het oppervlak, worden de wortels volledig blootgesteld aan kolonisatie door bacteriën geïnocculeerd in het vloeibare bacteriegroei medium. Dit maakt het mogelijk bacteriën van belang te worden onderzocht voor kolonisatie in voedingsstoffen die het meest bevorderlijk zijn voor groei, terwijl vervolgens verschuiving voorwaarden zodat de plant te blijven groeien in een nutriënt medium ontworpen om de groei te ondersteunen. Beide stadia omvatten gestage schudden om Anoxie van de wortel¹³te voorkomen. Bacteriën kunnen worden gevisualiseerd of becijferd vanaf de wortels van de plant na overdracht van ofwel de kolonisatie medium of het onderhouds medium. Dit hydroponische systeem is zeer flexibel, waardoor experimentele omstandigheden en toegepaste spanningen gemakkelijk kunnen worden gewijzigd, afhankelijk van de interesses van de onderzoekers.

Deze beschreven methode is belangrijk in de context van de grotere hoeveelheid literatuur over Plant-microbe interacties omdat het een robuust systeem biedt voor het bestuderen van deze interacties op het worteloppervlak, terwijl het ook aanpasbaar is aan de groei voorkeuren van verschillende bacteriën. Plant biologie Labs voeren vaak plantaardige kolonisatie experimenten uit op massieve agar, waardoor alleen planaire beweging (als dat) van bacteriën mogelijk is, terwijl ook de mogelijk destructieve manipulatie van planten tijdens de daaropvolgende overdracht nodig is. Microbiologie Labs daarentegen hebben vaak de gezondheid van de bacteriën in hun experimenten geprioriteerde, ten koste van de planten^14,15. Deze verschillende prioriteiten van de plant-en microbiologie-gerichte laboratoria hebben het historisch moeilijk gemaakt om de resultaten tussen deze groepen te vergelijken, omdat elk de experimentele omstandigheden optimaliseert om hun organisme van belang¹⁵te optimaliseren. Het floating-mesh-plant-growth-systeem dat hier wordt beschreven, voorkomt volledige plant onderdompeling, een opmerkelijk voordeel van eerdere microbiologie georiënteerde studies, terwijl het ook tijdelijk de groei en overleving van bacteriën optimaliseert om de kolonisatie te vergemakkelijken. De test die we hier presenteren, kan dus betrekking hebben op de bezorgdheid van beide planten biologen (over overmatige hydratatie en tactiele manipulatie van de plant), terwijl ze voldoen aan de criteria van microbiologen (waardoor verschillende bacteriële groeiomstandigheden en meerdere interacties van soorten)⁷. Dit protocol is ontworpen om te worden aangepast voor gebruik met verschillende bacteriën, planten en omgevingscondities.

Protocol

Opmerking: de experimentele Setup wordt beschreven voor duidelijkheid en gebruikt voor het genereren van de representatieve resultaten die zijn opgenomen in dit rapport, maar de voorwaarden kunnen worden gewijzigd zoals gewenst. Alle stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van PBM en na institutionele en federale reccomendations voor de veiligheid, volgens de BSL status van de gebruikte bacteriën.

1. karakterisering van bacteriën

1. Bepaal de morfologie van bacteriën op het groeimedium agar plaat. Respendeer cellen bij een geschatte OD₆₀₀ = 0,5 en plaat een volume van 1 μL op een agar-medium naar keuze. Voeg X-gal toe aan agar-platen tot een uiteindelijke concentratie van 20 mg/mL om individuele leden van de specifieke bacteriële Gemeenschap beter te onderscheiden. Groei bij 24 °C of 30 °C tot kolonies vorm, neem dan foto's van en notities over de morfologie van de kolonie.
2. Definieer de correlatie tussen de optische dichtheid van elke bacteriestam en het aantal CFU (kolonie vormende eenheden) per mL¹⁶. Resuspendeer bacteriën in 1 mL water in een 24-put plaat tot een geschatte OD₆₀₀ = 5, Voer twee-voudige seriële verdunningen, monitor od₆₀₀ van alle verdunningen en plaat elk om de levensvatbare kve/ml in elk monster te bepalen op meerdere optische dichtheden.
3. Bepaal de maximale ultrasoonapparaattolerantie voor elke bacteriestam. Om dit te doen, aliquot cellen in een 24-put met vloeibare medium, het reserveren van sommige cellen als een niet-gesoniceerde controlemonster. Gebruik een ultrasonicator met een 24-Tip hoorn bevestiging, breng drie rondes van 12 s van sonicatie aan op 40 amp met 2 s pulsen.
   Opmerking: het gebruik van een 24-goed ultrasonicator wordt geadviseerd om de downstream multiplexing van de verwerking plant monsters te vergemakkelijken, maar als een niet beschikbaar is, gebruik een ultrasonicator uitgerust met een microtip en voer elke sample sonicatie onafhankelijk. Draag altijd oorkappen die zijn geclassificeerd als minimaal 25 NRR-bescherming.
4. Voer 10-voudige seriële verdunningen van de gesoniceerde en ongesoniceerde monsters uit en spot op agar-platen. Bepaal of er een afname van levensvatbare cellen na sonicatie is. Als dat zo is, gebruik dan een nieuw monster en herhaal sonicatie stap met een gereduceerde totale ultrasoonapparaattijd of amplitude totdat de behandeling geen effect heeft op de uiteindelijke CFU/mL¹⁷.

2. bereiding van Arabidopsis thaliana zaailingen op een kunststof gaas

1. Maak schijven van het plastic gaas met behulp van een standaard perforator.
   1. Verzamel de schijven in een glazen container met een losse afdekking van aluminiumfolie, en steriliseren met behulp van een autoclaaf ingesteld op een 20 min droge cyclus¹³.
   2. Gebruik vlamgesteriliseerde pincet en verdeel ongeveer 40 gesteriliseerde mesh-schijven in een enkele laag over het oppervlak van een plant-growth-medium agar-plaat. Gebruik 0,5 x Murashige en Skoog (MS) zouten, bevattende 500 mg/L MES buffer [2-(N-morpholino) ethanesulfoninezuur] en 1,5% Bacto agar, als plantengroei medium, met 50 μg/mL benomyl toegevoegd aan de limiet schimmel besmetting van de kiemplanten.
2. Bereid Axenische zaden van A. thaliana zoals eerder beschreven¹⁷.
   1. Plaats ongeveer 100 – 300 zaden elk in afzonderlijke centrifugebuizen in een rek en plaats in een hersluitbaar glas of zware plastic container ("JAR") in een rook afzuigkap.
   2. Gebruik voorzichtig een bekerglas van 100 mL bleekwater in de pot, voeg 3 mL geconcentreerde HCl toe aan het bleekwater en sluit de pot onmiddellijk af en laat de dampen de zaden steriliseren gedurende ten minste 4 uur.
   3. Verwijder voorzichtig de buisjes van gesteriliseerde zaden van onder de pot en de afdichting.
3. Plaats twee zaden in het midden van elk gaas. Afdichtings platen met chirurgische tape en incuberen gedurende 2 – 6 dagen bij 4 °C in de duisternis om zaden te vernaliseren.
4. Om kiemplanten te ontkiemen en te kweken, plaatst u de plaat agar-zijde naar beneden in een plantengroei kamer voor 8 – 10 dagen onder korte daginstellingen: 9 h licht bij 21 °C en 15 uur donker bij 18 °C (Figuur 1, stap 2).

3. kolonisatie van planten in vloeibare bacteriegroei medium

1. Voeg 1 mL bacteriegroei medium toe aan elk putje van een steriele 24-Wells plaat, met uitzondering van alleen media-controle putten. Gebruik Lennox Luria Bouillon (10 g Tryptone, 5 g gistextract, 5 g NaCl) als het bacteriegroei medium.
2. Breng de gekierde zaailingen in gaas van agar-platen naar de vloeistof over (Figuur 1, stap 3a).
   1. Pel het gaas met twee gekiende zaailingen voorzichtig van de agar plaat met behulp van een met vlam gesteriliseerde Tang. Kies mesh met even grote en onbeschadigde zaailingen.
   2. Als het verwijderen uit de agar niet glad is, gooi dat net en plant dan weg. Breng een vlotter naar elke put van bacteriële groei vloeistof, wortel zijde naar beneden.
3. Inoculeren bacteriën in putten met zwevende zaailingen.
   1. Respendeer bacteriën die 's nachts worden gekweekt op agar-platen tot een OD₆₀₀ overeenkomend met 10⁸ kve/ml in de bacteriegroei mediumvloeistof. Voeg 10 μL bacteriële suspensie toe aan elk goed voor een uiteindelijke concentratie van 10⁶ CFU-bacteriën per put.
   2. Als de bereiding van een mengsel van bacteriën, hervatten elk aan de OD₆₀₀ equivalent aan 10⁸ CFU/ml, Meng in gelijke verhoudingen, en voeg 10 μL van de laatste mix per put van vloeistof.
4. Verzegel de plaat voor steriele groei. Zonder de kleefzijde aan te raken, druk de gasdoorlatbare film voorzichtig over de plaat. Zorg ervoor dat elke put individueel is verzegeld door de druk rond elk van de ringen gemaakt door de putjes toe te passen. Vervang het plastic deksel van de plaat over de plaat en de gasdoorlatbare film (Figuur 1, stap 3b).
5. Inbroed de platen voor 18 h in een plantengroei kamer, onder dezelfde omstandigheden als de zaailingen oorspronkelijk ontkiemen, behalve op een orbitale plaat Shaker ingesteld op 220 rpm.

4. instandhouding van bacteriële kolonisatie

1. Om alle drijvers (planten op gaas) te spoelen, voeg 1 mL steriel water toe aan putjes van een nieuwe 24-Wells plaat. Verwijder gasdoorlatbare folie. Met behulp van steriele Tang, drijvers naar putten met water (Figuur 1, stap 4a). Afspoelen door 10 min. bij kamertemperatuur (RT) te rusten zonder roeren.
   Opmerking: om te bepalen bacteriële kolonisatie efficiëntie van wortels in plaats van hun vermogen om kolonisatie te handhaven na verloop van tijd, planten kunnen worden geofferd in deze stap door ze rechtstreeks naar stap 5,1.
2. Vul de putjes van een nieuwe 24-putplaat met 1 mL plantengroei medium. Breng een mesh over naar elke put. Afdekking met een gasdoorlatbare afdichting en incuberen voor 72 u op de orbitale plaat Shaker bij 220 rpm in de plantengroei kamer (Figuur 1, stap 4b).
3. Herhaal het spoelen zoals uitgevoerd in stap 4,1 met drijvers na de incubatieperiode van 72 uur.

5. inzameling van bacteriën voor levensvatbare celtellingen

Opmerking: het aantal bacteriën per kiem wortel kan worden bepaald op elk incubatietijd punt. De kolonisatie kan tussen 0 uur en 18 uur worden bewaakt, terwijl het onderhoud vanaf 18 uur kan worden bewaakt. Planten die bestemd zijn voorbeeld vorming kunnen rechtstreeks overgaan tot sectie 6.

1. Verwijder de zaailingen van het gaas (Figuur 1, stap 5). Plaats de vlam gesteriliseerde pincet voorzichtig onder de bladeren (maar aan de bladzijde van het gaas) en Knijp zachtjes in de steel. Beweeg de zaailingen omhoog en weg van het gaas om de wortel af te breken zonder deze te verbreken. Als de wortel breekt, schrag dan zachtjes de onderkant van het gaas om de volledige lengte te verzamelen.
2. Verwijder bacteriën uit planten wortels. Breng de bacteriën over in putjes van een 24-putplaat met 1 mL ddH₂0. Sonicate de monsters zoals beschreven in stap 1,3.
   Opmerking: Zoek met behulp van een Microscoop naar eventuele overgebleven bacteriën op het worteloppervlak op een gesoniceerd monster. Als bacteriën blijven, Verhoog de totale ultrasoonapparaattijd of intensiteit totdat er geen bacteriën gebonden blijven, tot het hoogste niveau van sonicatie die geen invloed heeft op levensvatbare celtellingen zoals bepaald in sectie 1.
3. Kwantificeer de bacteriën op wortels.
   1. Voer seriële 10-voudige verdunningen van de gesoniceerde monsters uit tot een 10^-6 verdunning in het bacteriële groeimedium. Voeg 50 μL van elke verdunning toe aan afzonderlijke agar-platen en verdeel met steriele glas parels (of bacteriële strooier). Incuberen de platen op de optimale temperatuur voor bacteriën totdat de afzonderlijke kolonies aftelbaar zijn.
   2. Eenmaal onderscheidbaar, Tel het aantal van elke kolonie morfologie (zoals bepaald in sectie 1), en bereken CFU van elke bacteriesoort per zaailing. Gooi eventuele monsters met verontreiniging weg, aangezien verontreiniging tijdens de kolonisatie of het onderhoud de aanwezigheid van bacteriën kan aantasten.

6. verzameling van intacte plantwortels voor microscopie

1. Met behulp van een tang, verwijder de zaailingen van mesh zoals in rubriek 5.
2. Breng elke plant over naar Microscoop-dia's.
   1. Plaats de punt van de wortel op de dia en sleep weg van de tip om de shoot down flush met de dia, zorgen voor een rechtgetrokken wortel voor de beste beeldvorming. Voeg een druppel water of steriel plantengroei medium toe aan de monsters om de interfaces tussen de afdekplaten en dia's te hydrateren.
   2. Plaats een glazen afdekplaat net boven de wortel kroon (bovenste boxed regio in Figuur 1) en onder de schiet bladeren om te voorkomen dat de dekslip scheert (om wortel kroon beeldvorming mogelijk te maken) en druk zachtjes op¹⁷.
3. Bij het gebruik van fluorescerende bacteriën, afbeelding met behulp van geschikte excitatie/emissie filters om te differentiëren bacteriën van elkaar en de plant wortel¹⁸.

Resultaten

De goed gekarakteriseerde PGPB P. simiae WCS417r staat erom bekend de wortels van A. thaliana te koloniseren in de hydroponische cultuur. Deze natuurlijk fluorescerende bacterie kan gemakkelijk worden gevisualiseerd met behulp van microscopie op de wortels van zaailingen na kolonisatie (Figuur 2). Hoewel het mogelijk is om de volledige lengte van deze A. thaliana zaailingen ' (4 – 6 mm lengte) wortels te maken, zou dit voor veel pla...

Discussie

Planten in alle omgevingen communiceren met duizenden tot miljoenen verschillende bacteriën en schimmels,^5,7. Deze interacties kunnen een negatieve en positieve invloed hebben op de gezondheid van de plant, met potentiële effecten op gewasopbrengst en voedselproductie. Recent werk suggereert ook dat een variabele kolonisatie van gewassen door PGPBs kan duiden op onvoorspelbare plantgrootte en gewasopbrengst in veldproeven²². Het begrijpen ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Vereiste materialen
1.5 mL eppendorf buisjes	elke	N/A
24-wel platen	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclaaf	elke	N/A
Bacteriën van belang	elke	N/A	Verkiest opgeslagen op -80?C in 40% glycerol
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	elke	N/A
Conviron	elke	N/A	Korte Dag Licht-Donker Cycli: 460-600 µmoles/m²/s ingesteld op 9/15 uur licht/donker bij 18/21?C, met innerlijk stopcontact
Dessicator Pot: glas of zwaar plastic	elke	N/A
Ethanol	elke	N/A
Vlam	elke	N/A
Pincet	elke	N/A
Incubator	elke	N/A	Bij optimale temperatuur voor groei van gespecificeerde bacteriën
Zoutzuur	elke	N/A
Lennox LB Bouillon	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	elke	N/A
Micropipetten	elke	N/A	Volumes 5 µL tot 1000 µL
Microscoop (bij voorkeur fluorescentie)	elke	N/A	Kan licht zijn als beste definitie niet belangrijk
MS Zout + MES	RPI	M70300-50.0
Orbitale Plate Shaker	elke	N/A	In staat om te draaien op 220 rpm voor minimaal 96 uur
Petri Schalen	elke	N/A	50 mL totaal volume
Reservoirs	elke	N/A
Spectrofotometer	elke	N/A
Standaard Gat Punch	elke	N/A	Ongeveer 7mm punch diameter
Steriele water	elke	N/A
Chirurgische Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasoonapparaat	elke	N/A
Vortex Mixer	elke	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	andere leveranciers beschikbaar
Aanbevolen Materialen
24-polige Ultrasoonapparaat bevestiging	elke	N/A	Voor het soniceren van meerdere monsters tegelijk. Kan individueel worden gedaan
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glaskralen	elke	N/A
Multipetter/Repetter	elke	N/A
Steriele 96-wel platen	elke	N/A	Voor seriële verdunningen. Kan worden vervangen door eppendorf buisjes
Biologische Materialen Gebruikt
Arabidopsis thaliana zaden	elke	N/A	We raden Arabidopsis Biologisch Resource Center aan voor zaadvoorraden
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Gepubliceerd in een soortgelijk systeem in Haney, et al. 2015. Gebruikte stam ontwikkeld in Cole, et al. 2017