Visualisering van proteïne kinase een activiteit in hoofd-vaste muizen die in vivo twee-fotonen fluorescentie levensduur beeld microscopie gebruiken

Summary

Een procedure wordt gepresenteerd om te visualiseren van proteïne kinase een activiteiten in hoofd-vaste, gedragen muizen. Een verbeterde A-kinase activiteit Reporter, tAKARα, wordt uitgedrukt in corticale neuronen en toegankelijk gemaakt voorbeeld vorming door middel van een craniaal venster. Two-photon fluorescentie Lifetime Imaging microscopie wordt gebruikt om PKA-activiteiten in vivo te visualiseren tijdens gedwongen motoriek.

Abstract

Neuromodulatie oefent een krachtige controle over de hersenfunctie uit. Dysfunctie van neuromodulatoire systemen resulteert in neurologische en psychiatrische stoornissen. Ondanks hun belang, zijn technologieën voor het bijhouden van neuromodulatoire gebeurtenissen met cellulaire resolutie net begonnen te ontstaan. Neuro modulatoren, zoals dopamine, noradrenaline, acetylcholine, en serotonine, trigger intracellulaire signalering gebeurtenissen via hun respectieve G eiwit-gekoppelde receptoren te moduleren neuronale prikkelbaarheid, synaptische communicatie, en andere neuronale functies, waardoor de informatieverwerking in het neuronale netwerk wordt gereguleerd. De bovengenoemde neuro modulatoren convergeren op het kamp/proteïne kinase A (PKA) traject. Daarom werd in vivo PKA-beeldvorming met eencellige resolutie ontwikkeld als een uitlezen voor neuromodulatoire gebeurtenissen op een manier die analoog is aan calcium beeldvorming voor neuronale elektrische activiteiten. Hierin wordt een methode gepresenteerd om de PKA-activiteit te visualiseren op het niveau van individuele neuronen in de cortex van hoofd-gefixeerde muizen. Om dit te doen, wordt een verbeterde A-kinase activiteit Reporter (AKAR), genaamd tAKARα, gebruikt, die is gebaseerd op Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Deze genetisch gecodeerde PKA-sensor wordt in de motorische cortex geïntroduceerd via in utero-elektroporation (IUE) van DNA-plasmiden, of stereotaxic injectie van Adeno-associated virus (AAV). FRET changes worden afgebeeld met behulp van Two-photon fluorescentie Lifetime Imaging microscopie (2pFLIM), dat voordelen biedt ten opzichte van ratiometrische FRET metingen voor het kwantificeren van het FRET signaal in lichtverstrooiing hersenweefsel. Om PKA-activiteiten te bestuderen tijdens gedwongen motoriek, wordt tAKARα afgebeeld via een chronisch craniale venster boven de cortex van wakker, hoofd-vaste muizen, die rennen of rusten op een gemotoriseerde loopband met snelheidscontrole. Deze beeldvormings benadering zal van toepassing zijn op vele andere hersengebieden om overeenkomstige door gedrag geïnduceerde PKA-activiteiten en andere op FLIM gebaseerde sensoren voor in vivo-beeldvorming te bestuderen.

Introduction

Neuromodulatie, ook bekend als langzame synaptische transmissie, legt sterke controle over de hersenfunctie tijdens verschillende gedrags toestanden, zoals stress, opwinding, aandacht, en motoriek^{1,2,3, 4}. ondanks het belang ervan, is de studie van wanneer en waar neuromodulatory gebeurtenissen plaatsvinden nog in de kinderschoenen. Neuro modulatoren, met inbegrip van acetylcholine, dopamine, noradrenaline, serotonine, en vele neuropeptides, activeren G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs), die op zijn beurt trigger intracellulaire tweede Messenger trajecten met een breed venster van tijdschema's variërend van seconden tot uren. Terwijl elke neuromodulator activeert een aparte set van signalering van gebeurtenissen, de Camp/proteïne kinase a (PKA) traject is een gemeenschappelijk stroomafwaarts traject voor vele neuro modulatoren^1,5. De Camp/pKa traject regelt neuronale prikkelbaarheid, synaptische transmissie, en plasticiteit^6,7,8,9, en daarom, stemt de neuronale netwerk dynamiek. Omdat verschillende neuronen of neuronale typen Express verschillende soorten of niveaus van neuromodulator receptoren¹⁰, de intracellulaire effecten van de dezelfde extracellulaire neuromodulator kunnen heterogenen over verschillende neuronen, en dus, moeten worden bestudeerd met cellulaire resolutie. Tot nu toe, het blijft uitdagend om te controleren van neuromodulatory gebeurtenissen in individuele neuronen in vivo tijdens gedrag.

Om de spatiotemporele dynamiek van neuromodulatie te bestuderen, is een geschikte opname modaliteit vereist. Microdialyse en Fast-scan cyclische voltammetrie worden vaak gebruikt voor het bestuderen van de release van neuro modulatoren, maar ze missen de ruimtelijke resolutie voor het bewaken van cellulaire gebeurtenissen^11,12. Analoog aan calcium dynamica wordt gebruikt als een proxy voor neuronale elektrische activiteit in de populatie Imaging¹³, pKa Imaging kan worden gebruikt om te lezen neuromodulatory gebeurtenissen over een neuronale populatie bij cellulaire resolutie. Het huidige protocol beschrijft het gebruik van een verbeterde A-kinase activity Reporter (AKAR) om PKA-activiteiten in vivo te monitoren tijdens het gedrag van dieren. De hier beschreven methode zorgt voor gelijktijdige beeldvorming van neuronale populaties op subcellulaire resolutie met een tijdelijke resolutie die fysiologische neuromodulatoire gebeurtenissen bijhoudt.

Akars zijn samengesteld uit een donor en een acceptor fluorescerende eiwitten gekoppeld door een pKa fosforylatie substraat peptide en een Forkhead geassocieerde (FHA) domein dat bindt aan de fosforylated serine of Threonine van de ondergrond^14,15. Na activering van het PKA-traject is de substraat Peptide van AKAR gefosforyleerd. Dientengevolge, het FHA domein bindt aan de fosforylated substraat peptide, waardoor de twee fluor Foren in de nabijheid, aangeduid als de gesloten staat van AKAR. De gesloten toestand van een gefosforyleerd AKAR resulteert in verhoogde Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen de donor en acceptor fluophores. Aangezien het aandeel fosforylated akars gerelateerd is aan het niveau van PKA-activiteit¹⁶, kan de hoeveelheid fret in een biologisch monster worden gebruikt om het niveau van PKA-activiteit^16,17,18te kwantificeren^{, 19,20}.

Vroege versies van AKARs werden voornamelijk ontworpen voor tweekleurige ratiometrische beeldvorming¹⁴. Bij beeldvorming dieper in hersenweefsel lijdt de ratiometrische methode aan signaalvervorming als gevolg van golflengte afhankelijke lichtverstrooiing^17,18,21. Zoals hieronder besproken, elimineert fluorescentie Lifetime Imaging microscopie (flim) dit probleem omdat flim alleen fotonen meet die worden uitgezonden door de donor de^18,21. Hierdoor wordt de FLIM kwantificering van FRET niet beïnvloed door de weefsel diepte¹⁷. Daarnaast kan een "donkere" (d.w.z. lage kwantum opbrengst [QY]) variant van de acceptor de worden gebruikt. Dit bevrijdt een kleurkanaal om Multiplexed meting van orthogonale neuronale eigenschappen mogelijk te maken via gelijktijdige beeldvorming van een tweede sensor of een morfologische marker^17,19,20.

Flim Imaging kwantificeert de tijd dat een de in de opgewonden toestand doorbrengt, d.w.z. de fluorescentie levensduur¹⁸. De terugkeer van een de naar de grond staat, dus het einde van de opgewonden toestand, vaak gelijktijdig met de uitstoot van een foon. Hoewel de emissie van een foon voor een individueel opgewonden molecuul stochastisch is, is de gemiddelde fluorescentie levensduur een kenmerk van die specifieke fluorophore. Wanneer een zuivere populatie fluoroforen tegelijkertijd opgewonden is, zal de resulterende fluorescentie één exponentieel verval volgen. De tijds constante van dit exponentiële verval komt overeen met de gemiddelde fluorescentie levensduur, die meestal varieert van één tot vier nanoseconden voor fluorescerende eiwitten. De terugkeer van een opgewonden donor de naar de grond staat kan ook voorkomen door fret. In aanwezigheid van fret wordt de fluorescentie levensduur van de donor de verlaagd. De ongefosforyleerde AKARs vertonen een relatief langere levensduur van de donor fluorescentie. Na fosforylering door PKA vertoont de sensor een kortere levensduur omdat de donor-en acceptor-fluoroforen in de buurt van elkaar worden gebracht en de FRET toeneemt. De kwantificering van de fluorescentie levensduur in een populatie van AKARs vertegenwoordigt daarom het niveau van PKA activiteit.

Vroege versies van AKARs zijn niet met succes gebruikt voor in vivo beeldvorming bij eencellige resolutie. Dit is voornamelijk te wijten aan de lage signaalamplitude van de AKAR-sensoren voor fysiologische activaties¹⁷. Onlangs, door het systematisch vergelijken van beschikbare AKAR-sensoren voor twee-Fobe fluorescentie levensduur beeldvormings microscopie (2pFLIM), werd een sensor genaamd FLIM-AKAR gevonden om beter te presteren dan alternatieve sensoren. Bovendien werden een reeks FLIM-AKAR varianten genaamd targeted AKARs (tAKARs) ontwikkeld om de PKA activiteit te visualiseren op specifieke subcellulaire locaties: microtubuli (tAKARα), cytosol (tAKARβ), actine (takarδ), filamenteuze actine (takarε), membraan (tAKARγ), en postsynaptische dichtheid (Takari). Onder tAKARs, tAKARα verhoogde de amplitude van het signaal opgewekt door noradrenaline door 2,7-fold. Dit is in overeenstemming met de kennis dat de meerderheid van pKa in neuronen zijn verankerd aan microtubuli in rusttoestand^22,23. tAKARα was de beste performer onder bestaande AKARs voor 2pFLIM. Bovendien, tAKARα gedetecteerd fysiologisch relevante PKA activiteit opgewekt door meerdere neuro modulatoren, en de uitdrukking van tAKARα veranderd neuronale functies¹⁷.

Onlangs werd tAKARα met succes gebruikt om PKA-activiteiten te visualiseren in Head-Fixed met muizen¹⁷. Er werd aangetoond dat gedwongen motoriek de PKA-activiteit veroorzaakte in het SOMA van de oppervlakkige laag neuronen (laag 1 tot en met 3, tot een diepte van ~ 300 μm van Pia) in de motor, het vat en de visuele cortices. De motoriek-geactiveerde PKA activiteit was deels afhankelijk van signalering via β-adrenerge receptoren en D1 dopamine receptoren, maar werd niet beïnvloed door een D2 dopamine receptor antagonist. Dit werk illustreert het vermogen van tAKARs om neuromodulatie-gebeurtenissen in vivo te volgen met behulp van 2pFLIM.

In het huidige protocol wordt de gehele methode voor PKA-activiteit beeldvorming in in het hoofd vaste wakker muizen tijdens een afgedwongen bewegings paradigma beschreven in zes stappen. Ten eerste, de toevoeging van 2pFLIM-capaciteiten aan een conventionele twee-Fobe Microscoop (Figuur 1). Ten tweede, de aanleg van een gemotoriseerde loopband (Figuur 2). Ten derde, de uitdrukking van de tAKARα-sensor in de cortex van de muis door in utero-elektroporation (IUE) van DNA-plasmiden, of stereotaxus injectie van Adeno-associated virus (AAV). Uitstekende protocollen voor operaties voor iue^24,25 en stereotaxic injectie van virale deeltjes²⁶ zijn eerder gepubliceerd. De belangrijkste parameters die we gebruikten, worden hieronder beschreven. De installatie van een craniaal venster. Uitstekende protocollen zijn eerder gepubliceerd voor craniale Window chirurgie^27,28. Verschillende stappen die zijn gewijzigd van de standaardprotocollen worden beschreven. Ten vijfde, presteren in vivo 2pFLIM. Zesde, de analyses van 2pFLIM beelden (Figuur 3 en Figuur 4). Deze aanpak moet gemakkelijk toepasbaar zijn op vele andere hoofd-vaste gedrags paradigma's en hersengebieden.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Oregon Health and Science University.

1.2pFLIM Microscoop Setup

1. Installeer een foton timing tellings module (ptcm, tabel met materialen) en maak verbinding met de computer (Figuur 1) volgens de handleiding van de fabrikant.
   Opmerking: De ptcm is meestal een computer bord dat een "Sync" input ontvangt voor de laser Pulse timing en een foton input van de fotomultiplicator Tube (PMT). Het ontvangt ook Klok timing voor pixels, lijnen en kaders, van twee-Photon Imaging Control software. De PTCM gebruikt de klok signalen om afzonderlijke fotonen in verschillende pixels en kaders te scheiden.
2. Voeg een fotodiode toe met > 200 MHz bandbreedte om de laser timing te meten. Plaats een standaard glazen dekglaasje in het lichtpad om een kleine fractie van het laserlicht weer te geven in de fotodiode die loodrecht op het lichtpad is geplaatst (Figuur 1). Sluit de uitgang van de fotodiode aan op de "Sync" ingang van de PTCM.
   Opmerking: Veel moderne lasers uitvoeren ook de laser timing. Voor deze lasers, de fotodiode is niet nodig, en men kan direct de laser timing uitgang aansluiten op de Sync ingang van de PTCM.
3. Wissel de bet, in het geval van de tAKARα, de groene kanaal PMT, met een lage ruis, Fast GaAsP PMT (Figuur 1). Sluit de PMT-uitgang aan op de signaal ingang van de PTCM.
   1. Voeg een optionele signaalsplitter toe (Figuur 1) als gelijktijdige verwerving van de intensiteit door het conventionele Two-photon Imaging Channel gewenst is. Sluit de PMT-uitgang aan op de signaalsplitter en verbind de splitter uitgang met de PTCM en de conventionele twee-Photon Imaging module.
      Opmerking: Gaasp pmts geven snellere single-foton signalen dan conventionele bialkali pmts en zorgen voor een preciezere bepaling van de foton timing. Bepaalde modellen van GaAsP PMTs kunnen worden gekoeld tot 10 − 35 °C onder de omgevingstemperatuur, waardoor de onderdrukking van donkere graven tot een niveau onder een paar honderd per seconde (meestal ≤ 200 tellingen/s). Dit lage geluidsniveau is belangrijk voor het nauwkeurig meten van fluorescentie levensduur, omdat Noise foton niet gemakkelijk kan worden onderscheiden of afgetrokken van de fluorescentie Lifetime curve.
4. Voeg een band-pass fluorescentie-emissie filter toe dat de spectrale contaminatie, indien van de enige, minimaliseert van de acceptor fluorophore. Voor takarα wordt bijvoorbeeld een barrière filter van 500 nm ± 20 Nm voor het groene kanaal gebruikt om de verontreiniging van het sreach te verminderen, wat een donker (QY ~ 0,07) geel fluorescerend eiwit (yfp)^29,30is. Verbind timing signalen, zoals de klokken voor individuele beeldpixels, lijnen en kaders, afhankelijk van de besturingssoftware en beschreven in de gebruikershandleiding van PTCM. Installeer de juiste software voor gegevensbeheer en acquisitie.
   Opmerking: Sommige PTCM-fabrikanten (tabel met materialen) leveren hun software voor 2pFLIM Imaging. Hier wordt aangepaste software genaamd FLIMimage gebruikt, die werd ontwikkeld door het Yasuda Lab (Max Planck Florida, via persoonlijke communicatie). Deze software functioneert als een add-on gebruikersfunctie voor bepaalde twee-photon acquisitie software (tabel van materialen). Het controleert en communiceert met de PTCM op de juiste timing tijdens Two-photon Imaging om 2pFLIM-afbeeldingen te verkrijgen.

2. bouw van een gemotoriseerde loopband

Opmerking: Het ontwerp van de op maat gebouwde gemotoriseerde loopband wordt weergegeven in Figuur 2.

1. Snijd een Foam roller (Ø = 200 mm) tot 150 mm in lengte met een fijne ijzerzaag. Als alternatief, lijm de twee helften van een schuim bal samen en plaats tape over de naad. Lijm eventueel een rubberen mat met profiel op de roller om de tractie op de roller te vergroten.
2. Boor een 1/4 inch diameter gat door het midden van de roller aan de platte kant van de roller of boor een 1/4 inch diameter gat door het midden van elke helft van de bal als de Foam Ball wordt gebruikt.
3. Installeer een 1/4 inch diameter stalen as door het gat. Lijm de Foam roller/Ball op de as met Foam-compatibele lijm. Wijzig desgewenst twee flexibele askoppelingen (1/4 inch binnendiameter) om de koppeling van de as aan de Foam roller/Ball te versterken.
   Opmerking: Houd er rekening mee dat veel voorkomende lijmen schuim kunnen ontbinden.
   1. Plaats voor elke askoppeling de askoppeling op de platte zijde en in het midden van de rechthoekige metalen plaat (0,7 mm x 15 mm x 76 mm). Las de plaat op de askoppeling. Boor een 1/4 inch gat in het midden van de plaat om toe te staan voor de installatie van de gemodificeerde askoppeling op de as en twee schroefgaten in de metalen plaat laterale van het centrum.
   2. Installeer de askoppeling op de as tegen de Foam roller/Ball. Als u de laatste gebruikt, buigt u de plaat enigszins om de kromming van de bal te passen. Plaats de schroeven in de laterale gaten om de roller/bal op de as vast te zetten.
4. Boor en tik op een 3/8-32-schroefdraad in het midden van een kooi plaat en installeer de roterende encoder. Boor een schroefgat in de basis van de haakse motor beugel om de bevestiging van de motor op de post houder mogelijk te maken. Bevestig zowel de roterende encoder als de motor aan het uiteinde van de as met behulp van een flexibele askoppeling.
5. Installeer de gemonteerde loopband op een aluminium brood bord met behulp van palen voor de motor en de roterende encoder (Figuur 2). Sluit de motor ingangen aan op de snelheidsregelaar en de roterende encoder uitgang naar een analoge ingang van de computer Data Acquisition (DAQ) Board.
   Opmerking: De rotatiehoek snelheid wordt gecodeerd door de roterende encoder als voltage en wordt gedigitaliseerd met behulp van aangepaste software genaamd AnimalTracker geschreven in MATLAB.
6. Installeer de houder die compatibel is met de Hoofdplaat op een rechte hoek beugel. Installeer een solide paal op de brood plaat voor de loopband en installeer de gemonteerde kopplaat houder met de haakse beugel op de paal (Figuur 2). Zorg ervoor dat de kopplaat houder staven zijn uitgelijnd met de as, zodat de muis een adequate en comfortabele loop positie op de loopband kan nemen (figuur 2c).

3. expressie van tAKARα-sensor in de muis cortex

1. In utero elektroporation
   1. Bereid een DNA-oplossing voor iue door toevoeging van 0,2% eindconcentratie van snelle groene kleurstof (voor visualisatie tijdens injectie) aan een plasmide DNA (3 − 4 μg/μL; de sensor constructies met een CAG-promotor, sensor sequentie en een Groundhog Hepatitis-virus post-transcriptionele respons element [wpre] translationeel Enhancer) opgelost/verdund in water of tris-EDTA.
   2. Maak een getimede zwangere vrouwelijke muis (bijv. C57BL/6) voor IUE op e16²⁴. Anesthetiseer de muis met Isofluraan (4% voor inductie en 1,5% voor onderhoud, op 95% O2 met 5% Co₂) en breng subcutane injectie van peri-operatieve analgetica aan met 5 mg/kg Meloxicam en 4 mg/kg bupivacaine. Snijd de buikholte open met een scalpel en een schaar en stel de baarmoeder hoorns zorgvuldig bloot.
   3. Injecteer 1 μL DNA-oplossing per embryo in de laterale ventrikel van een halve bol, zoals eerder beschreven²⁴.
   4. Voer regelmatig IUE²⁴ voor corticale neuronen door het plaatsen van de positieve elektrode eind voet bij de cortex en met behulp van 5 100-MS vierkante pulsen (38 V) bij 1 Hz met een elektro porator.
      Opmerking: verschillende corticale regio's kunnen worden gericht op elektroporation door het wijzigen van de positie van de eind voet van de elektrode ten opzichte van de laterale ventrikel.
2. Stereotaxic injectie
   1. Bereid een muis op postnatale dag 30 voor stereotaxic chirurgie²⁶. Anesthetiseer de muis zoals beschreven in stap 3.1.2., en breng subcutane injectie toe van peri-operatieve analgetica die 5 mg/kg carprofen bevatten.
   2. Verdund AAV-serotype 2/1 (AAV2/1) dat hSyn-tAKARα-WPRE uitdrukt op een empirisch bepaalde titer (~ 1 x 10⁹− 1 x 10¹⁰ Genomes/μL) in spuit gefilterd (0,2 μm cellulose acetaat membraan) fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
   3. Boor een ~ 500 μm diameter gat met behulp van een handheld boor onder een stereomicroscoop op de volgende coördinaten voor de motorische cortex: 0,5 mm voorste naar bregma, 1,2 mm laterale naar middellijn.
   4. Monteer een injector (bijv. olie hydraulische manipulator, met op maat gemaakte plunjer/glazen pipet houder) aan een gemotoriseerde manipulator. Plaats de injectienaald in een hoek van 15 ° ten opzichte van het bregma-Lambda-vlak. Program meer een diagonale beweging over de x-en z-assen die equivalent zijn aan een progressie van 700 μm en 200 μm langs respectievelijk de anterieure-posterieure en de dorsale-ventrale assen.
      Opmerking: Om beschadiging van het weefsel direct boven het beoogde beeldvormings veld te voorkomen, worden AAV-deeltjes geïnjecteerd onder een hoek ten opzichte van het bregma-Lambda-vlak.
   5. Plaats de punt van de injectienaald bij de PIA in het midden van het boorgat en voer langzaam de diagonale beweging (~ 25 μm/s) uit die hierboven wordt beschreven. Deze procedure zal het centrum van de injectie positioneren op 1,2 mm voorste naar bregma, 1,2 mm laterale tot middelgrote lijn, 0,2 mm onder de PIA.
   6. Injecteer 20 nL verdunde virale deeltjes (~ 10 nL/min). Wacht ten minste 10 minuten en trek langzaam de injectienaald in (~ 12,5 μm/s).
   7. Voltooi de stereotaxic injectieprocedure en lijm/hecht de huid²⁶.

4. installatie van het Cranial venster

1. Voer de plaatsing van het schedel venster uit op muizen die tAKARα via IUE uitdrukken (punt 3,1) of stereotaxic injectie van virale deeltjes (punt 3,2), tussen postnatale dagen 30 en 60. Voor muizen die geïnfecteerd zijn met virale deeltjes, implementeert u het craniale venster ten minste twee weken na de virus injectie. Installeer het craniale venster zoals eerder beschreven^27,28, met de volgende details. Anesthetiseer de muis zoals beschreven in stap 3.1.2., en toepassen van subcutane injectie van peri-operatieve analgetica 0,075 mg/kg Buprenex en ontstekingsremmende middel dexamethason bij 4 mg/kg.
2. Verwijder het periosteum en trek de nekspier weg. Lijm de rand van de huid aan de schedel met weefsellijm om blootstelling van de nekspieren na de operatie te voorkomen.
3. Droog en verwijder het periosteum van de schedel door zachtjes te schrapen met een scalpel. Plaats de Imaging Head Plate (binnendiameter van 8 mm) om het beoogde beeldvormings veld te omringen. Lijm de Hoofdplaat aan de schedel met behulp van op cyanoacrylaat gebaseerde lijm, gevolgd door tandheelkundige acryl cement. Voor een optimale hechting zorgt u ervoor dat de Hoofdplaat op de blootgestelde en gedroogde schedel rust. Lijm versneller kan worden gebruikt om de verharding te versnellen.
4. Teken een cirkel van 5 mm in diameter boven het beoogde beeldveld (coördinaten zoals gespecificeerd in stap 3.2.3) met behulp van een tandheelkundige boor en stel de dura mater bloot.
5. Breng een dun laagje transparant polymeer, ook wel kunstmatige Dura genoemd, aan op het Dura-oppervlak om het hele schedel venster te bedekken. Het polymeer zal de dura mater beschermen en stabiliseren. Plaats een steriele ronde afdek (5 mm diameter) op de dura mater. Bevestig de dekslip met Cyanoacrylaatlijm aangebracht rond de randen van het venster, gevolgd door tandheelkundige acryl cement.

5. in vivo Two-photon fluorescentie Lifetime beeld microscopie

1. Start 2pFLIM Imaging op of na 2 weken na de installatie van het craniale venster (rubriek 4). Minimaliseer experimentele interferentie als gevolg van stress door frequente handling en scruffing van de muis voorafgaand aan het begin van het beeldvormings onderzoek om de muis aan te wennen.
2. Stel de twee-foonexcitatie Laser golflengte in op 960 nm met behulp van de software die de Two-photon Laser bestuurt.
3. Verdoving de muis met 4% isoflurane. Bevestig de juiste anesthetisering door de staart te knijpen en de Ademhalings frequenties te observeren. Dat wil doen, er mag geen reactie op de staart-knijpen en de ademhaling moet worden teruggebracht tot ~ 1 adem per seconde. Om onnodige procedurele tijd te minimaliseren en omdat de anesthesie duurt slechts twee tot drie minuten, Eye smeermiddelen worden niet gebruikt.
4. Breng de verdovings muis over naar de gemotoriseerde loopband (figuur 2c) en monteer de Hoofdplaat van de muis op de kopplaat houder van de Setup van de loopband (Zie afbeelding 2 voor meer informatie). Reinig het oppervlak van de craniale Window afdek op de muis met 70% ethanol.
5. Plaats de gemotoriseerde loopband met de gemonteerde muis onder de 2pFLIM-doelstelling. Breng een druppel gedistilleerd water aan tussen de craniale Window afdek en de doelstelling.
6. Laat de gemonteerde muis wakker van anesthesie en worden geacclimeerd aan de loopband en de Microscoop-omgeving voor ten minste 10 min. monitor respiratie snelheid van de muis terwijl de gemonteerde muis wakker wordt van de anesthesie.
7. Navigeer naar de injectieplaats onder epi-verlichting. Documenteer fiducial-functies (d.w.z. bloedvaten) onder brightfield om Imaging van hetzelfde interessegebied (ROI) te helpen tijdens volgende beeldvormings sessies.
8. Elimineer elk binnenkomend licht anders dan het uitgezonden licht uit het hersenweefsel. Schakel de epi-verlichtings lichtbron uit en sluit de behuizing van de 2pFLIM rig. Activeer de 2pFLIM PMT door het inschakelen van de hardware commando voltage controle.
9. Verkrijg een z-stack 2pFLIM image met behulp van de 2pFLIM acquisitie software FLIMimage met de volgende aanbevolen instellingen voorbeeld vorming tAKARα-positieve somata in wakker muizen. Stel kader gemiddelden in op 3 frames, scansnelheid naar 2 MS/lijn, Afbeeldingsgrootte tot 128 x 128 pixels en gezichtsveld tot 90 − 100 μm. Pas de beeldvormings instellingen aan op basis van de voorbereidings-en hardwareconfiguratie.
10. Inspecteer de verworven afbeelding in FLIMview (in eigen huis ontwikkelde aangepaste software; zie rubriek 6). Pas de beeldvormings instellingen aan na stap 5,9 om het aantal foton te optimaliseren en fotobleaching te minimaliseren.
    Opmerking: Een werkbaar geïntegreerd foton-aantal in een ROI voor levenslange beeldvorming van een tAKARα-positief Soma in vivo is ~ 1000 − 10000 fotonen, afhankelijk van de amplitude van het signaal die voortvloeit uit een bepaalde stimulus (Zie discussie).
    1. Gebruik waar nodig een verlaagd gezichtsveld, een lagere scansnelheid, een groter Laser vermogen en een groter aantal frames om de geïntegreerde foton-tellingen te verhogen en de levensduur schattings fout te verminderen. Zorg er tegelijkertijd voor dat u de minimale essentiële Laser voeding, frame middeling en scansnelheid gebruikt om fotobleaching te minimaliseren.
11. Een regelmatig tijdsinterval (bijv. elke 30 − 60 s) door de overname van de z-stack te herhalen met behulp van de instellingen die zijn bepaald in stap 5,10. Verkrijg basislijn 2pFLIM afbeeldingen voor ten minste 15 min bij Zero loopband snelheid.
12. Stel de rotatiesnelheid van de loopband in op ca. 15 cm/s gedurende 15 minuten tijdens het verkrijgen van 2pFLIM-beelden. Doorgaan met Imaging voor ≥ 20 min na het uitschakelen van de loopband rotatie, om te beoordelen van de duur van de PKA activiteit na beëindiging van geforceerde motoriek.

6. analyse van 2pFLIM beelden

1. Open de overgenomen afbeeldingen in FLIMview en stel de volgende parameters in de FLIMview in.
   Opmerking: parameter Details worden in discussie beschreven.
   1. Klik op de minimale en maximale bereik velden van de enkelvoudige foton Counting (SPC) in flimview. Voer de juiste minimale en maximale ABC-bereikwaarde in, meestal variërend tussen 1,2 − 2 en 10 − 12 NS.
   2. Klik op het veld t₀ waarde in FLIMview en voer de waarde t₀ in (meestal ~ 2 NS). Klik op het veld Lifetime luminantie minimumdrempel waarde in FLIMview en voer de gewenste drempelwaarde in op 5 − 30 fotonen.
2. Klik op de knop nieuwe groep (N) en wijs de naam van een experimentgroep toe. Hiermee genereert u een groep die gegevens van elke toegevoegde FLIM-afbeelding combineert.
3. Klik op de ROI -knop in de ROI Controls -module van flimview en teken een ROI rond een takarα-positief Soma. Verminder de z-stack bereik, door het verplaatsen van de onderste en bovenste z-limiet in de z-stack Control schuifregelaars in FLIMview, om te minimaliseren van signaal besmetting afkomstig van achtergrond fotonen in andere z diepten.
4. Klik op de knop + om de flim-afbeelding toe te voegen aan de groep (stap 6,2). Klik op de calc -knop om de gemiddelde levensduur te berekenen (lt, ook wel gemiddelde foton-emissie tijd [mpet] genoemd), voor de ROI en de levensduur schattings fout (δτ).
5. Open het volgende bestand in de chronische 2pflim Imaging Series. Herhaal stap 6,4. Zorg ervoor dat u de positie van het ROI en z-stack-bereik aanpast om hetzelfde tAKARα-positieve Soma na verloop van tijd te meten, omdat er in de loop van de tijd weefsel drift kan zijn.
6. Selecteer de Deltampet/MPET₀ in het vervolgkeuzemenu van de module groeps controles . Klik op het veld basislijn # en voer de index (ES) in (bijvoorbeeld 1 2 3 4 5 voor de eerste vijf afbeeldingen in de groep die in stap 6,3 is gemaakt). Hiermee definieert u de afbeelding (en) die wordt gebruikt om de levensduur van de basislijn te berekenen (LT₀).
7. Klik op plot om een grafiek met de flim Response (δlt/lt₀) van takarα te genereren tijdens het experiment in de gedefinieerde Rois. Genormaliseerde veranderingen in levensduur (ΔLT) van individuele ROIs door de corresponderende levensduur van de basislijn (LT₀) zorgen voor vergelijking van PKA-activiteit tijdens het motoriek over verschillende Rois.

Results

FRET-FLIM-sensoren zorgen voor de visualisatie van vele verschillende signalerings trajecten, waaronder het cAMP/PKA-traject dat betrokken is bij neuromodulatie. Het huidige protocol maakt gebruik van de recent ontwikkelde tAKARα-sensor in combinatie met 2pFLIM om PKA-activiteiten te visualiseren in hoofd-gefixeerde muizen. De meeste bestaande twee-photon-microscopen kunnen worden geüpgraded met 2pFLIM-mogelijkheden door drie tot vier componenten toe te voegen, zoals geïllustreerd in

Discussion

Dit protocol demonstreert het gebruik van FRET-FLIM-sensor tAKARα om neuromodulatie-geactiveerde PKA-activiteit in hoofd-vaste muizen te visualiseren. Deze toepassing is gebaseerd op uitgebreide tests en karakterisaties van tAKARα in vitro en in vivo om aan te tonen dat het verkregen FLIM-signaal relevant is voor fysiologische neuromodulatoire gebeurtenissen¹⁷. Hier wordt een in vivo toepassing, motorische geïnduceerde PKA-activiteit in de motorische cortex, gebruikt om de procedures te beschrijve...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm cellulose acetate spuitfilter	Nalgene	190-2520	Stap 3.2.2.
16x 0.8 NA water-immersielentief	Nikon	MRP07220	Stap 5.5.
3-pin kabel	US digital	CA-MIC3-SH-NC	Stap 2.5. Om de rotatiesensor aan te sluiten op de DAQ-input van de microscoop
Aluminium broodplank	Thorlabs	MB1012	Stap 2.5.
AnimalTracker MATLAB software	N/A	N/A	Stap 2.5 en secties 5 - 6. Wordt op verzoek verstrekt aan de hoofdauteur
Band-pass barrièrefilter	Chroma	ET500-40m	Stap 1.4.
Kooiplaat	Thorlabs	CP01	Stap 2.4. Gebruikt als montage voor rotatiesensor
Koolstofstalen mesjes voor microboormachine, 0,5 mm snedediamter	FST	19007-05	Stappen 3.2.3. en 4.4.
Circulaire dekglas (5 mm diameter)	VWR	101413-528	Stap 4.5.
Op maat gemaakte injectienaaldenhouder	N/A	N/A	Stap 3.2.4. Technische details worden verstrekt op verzoek aan de hoofdauteur
Tandheelkundig acryl	Yates Motloid	44114	Stappen 4.3. en 4.5.
Tandheelkundig boortje; Microtorque ii	Ram products	66699	Stappen 3.2.3. en 4.4.
Dowsil transparant polymeer	The Dow Chemical Company	3-4680	Stap 4.5. Kunstmatige duur
Elektroporatie-elektrode	Bex	LF650P5	Stap 3.1.4.
Elektroporator	Bex	CUY21	Stap 3.1.4.
Fast green FCF	Sigma-aldrich	F7258-25G	Stap 3.1.1.
FLIMimage MATLAB software	N/A	N/A	Sectie 5. Vriendelijk verstrekt door Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida
FLIMview MATLAB software	N/A	N/A	Secties 5. en 6. Wordt op verzoek verstrekt aan de hoofdauteur
Schuim-compatibele lijm (Gorilla White Glue)	Gorilla	5201204	Stap 2.3.
Kopbeugel	N/A	N/A	Stap 4.3. Technische details worden verstrekt op verzoek aan de hoofdauteur
Kopbeugelhouder	N/A	N/A	Stap 2.6. Technische details worden verstrekt op verzoek aan de hoofdauteur, gebruikt in combinatie met montagepootbeugel en rechte hoekbeugel
Hydraulische micromanipulator	Narishige	MO-10	Stap 3.2.4.
Krazy lijm	Krazy glue	KG82648R	Stap 4.3. Cyanoacrylaatgebaseerde lijm
Laag-ruissnel fotovermenigvuldigerbuis	Hamamatsu	H7422PA-40 of H10769PA-40	Stap 1.3.
MATLAB 2012b	Mathworks	N/A	Stappen 2.6, en secties 5, en 6. Gebruikt om microscoopverwerving en data-analysesoftware te runnen
Motor	Zhengke	ZGA37RG	Stap 2.4.
Motorsnelheidsregelaar	Elenker	EK-G00015A1-1	Stap 2.5.
Gemotoriseerde micromanipulator	Sutter	MP-285	Stap 3.2.4.
Montagebasis	Thorlabs	BA1S	Stap 2.5. Gebruikt voor poten voor motor en sensor in combinatie met PH4 en TR2
Montagepoot	Thorlabs	P14	Stap 2.6. Gebruikt voor de kopbeugelhouderpoot in combinatie met PB2
Montagepootbasis	Thorlabs	PB2	Stap 2.6. Gebruikt voor de kopbeugelhouderpoot in combinatie met P14
Montagepootbeugel	Thorlabs	C1515	Stap 2.6. Gebruikt in combinatie met rechte hoekbeugel en kopbeugelhouder
Optische poot	Thorlabs	TR2	Stap 2.5. Gebruikt voor poten voor motor en sensor in combinatie met BA1S en PH4
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing	Ν/Α	Ν/Α	Stap 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
Fotodiode	Thorlabs	FDS010	Stap 1.2.
Foton timing telmodule	Becker and Hickl	SPC-150	Stap 1.1.
Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE)	Addgene	119913	Stap 3.1.3.
Poothouder	Thorlabs	PH4	Stap 2.5. Gebruikt voor poten voor motor en sensor in combinatie met BA1S en TR2
Rechte hoekbeugel	Thorlabs	AB90	Stap 2.6 Gebruikt in combinatie met montagepootbeugel en kopbeugelhouder
Rotatieencoder	US digital	MA3-A10-250-N	Stap 2.4.
Rubberen mat	Rubber-Cal	B01DCR5LUG	Stap 2.1.
Askoppeling (1/4 inch x 1/4 inch)	McMaster	6208K433	Stappen 2.3. en 2.4.
ScanImage 3.6	Svoboda Lab/Vidrio Technology	N/A	Stappen 5.9. en 6.1.
Signaalsplitter	Becker and Hickl	HPM-CON-02	Stap 1.3.1.
Roestvrijstalen as (diameter 1/4 inch, L = 12 inch)	McMaster	1327K66	Stap 2.3.
Stereotactische uitlijningssysteem	David kopf	1900	Stappen 3.2. en 4.1. gewijzigd; Sutter micromanipulator, op maat gemaakte injectien