Methodenartikel

Beoordeling van zebravis lens Nucleus lokalisatie en Sutural integriteit

DOI:

10.3791/59528

⸱

6 mei 2019

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze protocollen werden ontwikkeld om de corticale lens morfologie, structurele integriteit van de zebravis lens hechtingen in vaste en live lenzen te analyseren en om de positie van de zebravis lens Nucleus te meten langs de voorste-posterior as.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zebravis is uniek geschikt voor genetische manipulatie en in vivo beeldvorming, waardoor het een steeds populairder model voor omgekeerde genetische studies en voor de productie van transgenes voor in vivo Imaging. Deze unieke mogelijkheden maken de zebravis een ideaal platform om oculaire lens ontwikkeling en fysiologie te bestuderen. Onze recente bevindingen dat een aquaporine-0, Aqp0a, is vereist voor de stabiliteit van de voorste lens hechting, evenals voor de verschuiving van de lenskern naar de lens centrum met de leeftijd leidde ons om tools te ontwikkelen vooral geschikt voor het analyseren van de eigenschappen van zebravis lenzen. Hier schetsen we gedetailleerde methoden voor lens dissectie die kunnen worden toegepast op zowel larvale en volwassen lenzen, om hen voor te bereiden op histologische analyse, Immunohistochemistry en imaging. We richten ons op de analyse van de lens hechting integriteit en corticale cel morfologie en vergelijk de gegevens gegenereerd uit ontleed lenzen met gegevens verkregen uit in vivo beeldvorming van de lens morfologie mogelijk gemaakt door een nieuwe transgene zebravis lijn met een genetisch gecodeerde fluorescerende marker. Analyse van ontleed lenzen loodrecht op hun optische as maakt kwantificering van de relatieve positie van de lenskern langs de voorste-posterior as. Beweging van de lenskern van een eerste voorste positie naar het centrum is vereist voor de normale lensoptiek in volwassen zebravis. Aldus, correleert een kwantitatieve maatregel van lenskern positie direct met zijn optische eigenschappen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zebravis is een uitstekend model voor het bestuderen van lens ontwikkeling en fysiologie als gevolg van de anatomische gelijkenissen met zoogdieren lenzen, relatief gemak van genetische en farmacologische manipulatie, de snelheid van de embryonale ontwikkeling van het oog, kleine omvang en transparantie in een vroeg stadium waardoor in vivo beeldvorming. De hier beschreven methoden zijn ontwikkeld om zebravis lens morfologie te analyseren op embryonale en volwassen stadia met een focus op sutural integriteit, corticale membraan morfologie in vitro en in vivo, en locatie van de lens nucleaire positie langs de anterior-posterior as ex vivo. Deze methoden dienen als uitgangspunt voor functionele studies van de lens ontwikkeling en fysiologie, evenals omgekeerde genetische schermen voor lens fenotypes in zebravis.

Imaging zebravis lens morfologie

Aquaporine 0 (AQP0) is de meest voorkomende lens membraan eiwit en is van cruciaal belang voor beide, lens ontwikkeling en duidelijkheid, als gevolg van meerdere essentiële functies bij zoogdieren. Zebravis hebben twee Aqp0s (Aqp0a en Aqp0b) en we hebben methoden ontwikkeld om het verlies van hun functies te analyseren in zowel embryonale en volwassen lenzen. Onze studies tonen aan dataqp0a-/-mutanten voorste polaire opaciteit te ontwikkelen als gevolg van instabiliteit van de voorste hechtdraad, en aqp0a/b dubbele mutanten ontwikkelen nucleaire opaciteit1. AQP0 is aangetoond rollen te spelen in het water transport2, adhesie3,4, cytoskelet verankering5 en generatie van de brekingsindex gradiënt6, maar deze studies zijn grotendeels uitgevoerd in vitro. De zebravis biedt een unieke gelegenheid om te bestuderen hoe het verlies van functie, of verstoord functie van Aqp0a of Aqp0b zou de morfologie en de functie van invloed zijn in een levende lens. Om te beoordelen lens cel morfologie en sutural integriteit tijdens de ontwikkeling, we gewijzigd bestaande in vitro immunohistochemische methoden7 voor gebruik in embryonale en volwassen lenzen, en gegenereerde transgenen om dit proces te controleren in vivo .

Immunohistochemische analyse van de plasmamembraan structuur en sutural integriteit werd uitgevoerd in hele vaste embryo's en volwassen lenzen. Zebravis lenzen zijn extreem klein (lens diameter is ~ 100 µm in embryo's en tot 1 mm bij volwassenen) in vergelijking met hun tegenhangers van zoogdieren en hebben punt hechtingen8, die zelden worden gevangen in cryosecties. Zo, hele lenzen zijn essentieel voor het analyseren van sutural integriteit. Voor in vivo analyse van de voorste hechting vorming, en de beeldvorming van precieze lens Cell architectuur, genereerden we transgenes uiten Mapple specifiek etikettering lens membranen.

Voordelen van Live Imaging van de lens membraan transgenes zijn: 1) het vermijden van fixatie artefacten, 2) het bestuderen van dynamische morfologische veranderingen in time-lapse films, en 3) het mogelijk maken longitudinale studies waarin eerdere gebeurtenissen kunnen worden gecorreleerd met later Fenotypen. Pigmentatie van de Iris voorkomt normaalgesproken duidelijke beeldvorming van de lens periferie. Toevoeging van 1-fenyl 2-thioureum (PTE) voor de Primordia-5 (Prim-5) fase9 voorkomt melanogenesis en oog pigmentatie tot ongeveer 4 dagen postfertilization (DPF). Echter, na 4 DPF, is de lens periferie verduisterd in vivo, met name in oudere stadia. Bovendien, de dichtheid van de lens zelf verduistert beeldvorming van de achterste paal. Daarom, om de morfologie van de lens periferie te bestuderen, of de achterste hechting, na 4 DPF, lenzen moeten worden versneden en vastgesteld.

Transgene zebravis lijnen zijn gebruikt om embryonale lens membraanstructuur te analyseren in vivo10. De Q01 transgene drukt een cyaan fluorescerende eiwit gesmolten tot een membraan targeting sequentie, Gap43, gedreven door de EF1α promotor en een hexamer van de DF4 Pax6 Enhancer element ubiquitously in lens Fiber cellen11. Q01 heeft extra-lensvormige uitdrukking, met inbegrip van amacrine cellen in het netvlies, die achtergrond signaal toevoegt als de primaire rente is de lens. We ontwikkelden een nieuwe transgene lijn die een membraan-tethered mApple specifiek in de lens uitdrukt, met als doel het vermijden van een extra-lensvormig signaal.

Lens Nucleus lokalisatie

We ontdekten dat de lens Nucleus verhuist van een eerste voorste locatie in larvale zebravis naar een centrale locatie in de voorste-posterior as in volwassen lenzen. Deze verschuiving in de positie van de hoge brekingsindex lens Nucleus wordt gedacht dat een eis voor de normale ontwikkeling van zebravis lens optica1. Onze methoden laten kwantificering van de lens nucleaire centralisatie in relatie tot de lens straal. Met behulp van deze methode, toonden we aan dat Aqp0a is vereist voor de lens nucleaire centralisatie1, en deze eenvoudige methode kan worden toegepast op andere studies van de ontwikkeling en fysiologie van de lens en de optische eigenschappen in de zebravis model.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dierlijke protocollen gebruikt in deze studie voldoen aan de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundige en visie onderzoek en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite (DEC) van de Universiteit van Californië, Irvine.

1. zebravis veeteelt en euthanasie

  1. Raise en onderhoud zebravis (AB strain) onder standaard laboratorium condities12. Verhoog embryo's in embryo medium (EM)12. Voeg 0,003% Pte aan EM van 20-24 h postfertilization (vóór de Prim-5 fase) om pigment vorming te voorkomen in embryo's12 gebruikt voorbeeld vorming in embryonale stadia9. Verhoog de larven van 6-30 dagen postfertilization (DPF) op een dieet van Live raderdiertjes tot 14 DPF, en leef Artemia na 14 DPF12.
    Let op: PTE is zeer giftig
  2. Verdoven vis met behulp van tricaine tot niet-ontvankelijk te raken.
    1. Bereid tricaine voorraad door het combineren van 400 mg 3-amino benzeen acidethylester, met 2,1 mL van 1 M Tris (pH 9), in 100 mL ddH2O. pas aan pH 7,0 aan en bewaar bij-20 °c.
      Let op: Tricaine is giftig.
    2. Verdun 4,2 mL tricaine voorraad in 100 mL tank water tot verdoven larven/volwassenen of in EM tot verdoven embryo's (eindconcentratie van tricaine bij 0,0165% w/v).

2. fixatie van embryo's en larven

Opmerking: De protocollen van immunohistochemische werden aangepast van eerder gepubliceerde materialen7.

  1. Vast te stellen dechorionated embryo's of larven tot 2 weken postfertilization in 4% (v/v) Paraformaldehyde (de) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) overnachting bij 4 °C op een tuimelschakelaar.
    Let op: Het is een onbrandbaar en kankerverwekkend.
  2. Was embryo's drie keer voor 10 min in PBS, en permeabilize in PBS met 10% Triton en 1% DMSO (PBS-T) overnachten bij 4 °C.
    Let op: DMSO is giftig, is schadelijk door inslikken of huid absorptie, draagt gevaarlijke materialen door de huid, en is brandbaar. Triton is giftig, corrosief en is gevaarlijk voor aquatische omgevingen.

3. dissectie van larvale en volwassen zebravis lenzen

  1. Verdoven vis van 6 DPF larven naar volwassenheid met tricaine tot niet-ontvankelijk te raken, maar nog steeds met een sterke hartslag. Maatregel vissen standaard lengte per Schilling (2002) voor enscenering13.
  2. Onmiddellijk accijnzen ogen met behulp van micro-dissectie schaar en plaats in een dissectie schotel in PBS (Figuur 2 getoond voor volwassen ogen).
    1. Maak een aangepaste 35 mm schotel gevuld met siliconen voor lens dissecties. Zodra het silicone heeft geplaatst, accijns een Divot rond 2-3 mm in diameter en 0,5 mm diep voor het immobiliseren van volwassen ogen/lenzen tijdens dissectie.
  3. Dissectie van Adult zebravis lenzen
    1. Plaats een volwassen oog in de schotel Divot posterior kant omhoog gevuld met PBS. Immobiliseren het oog door het invoegen van een tang op < hoek van 45 ° door de optische schijf. Wees voorzichtig niet te Nick of de lens te comprimeren. Maak twee of drie radiale incisies door Retina en Sclera van de optische schijf naar de tril zone met dissectie schaar.
    2. Schil terug het netvlies en Sclera zoals bloemblaadjes en omkeren het oog, hoornvlies kant omhoog. Immobiliseren de lens indirect via manipulatie van de Sclera en het hoornvlies met de platte kant van de schaar, terwijl het trekken weg het netvlies en de bijgevoegde weefsels met een tang. Zorgvuldig trim overtollig weefsel van de lens.
      Opmerking: Het is van vitaal belang om ontleden zorgvuldig te verkrijgen consequent gezonde lenzen.
  4. Dissectie van larvale zebravis lenzen
    1. Plaats een larvale oog posterior kant omhoog op het vlakke deel van de siliconen schotel gevuld met PBS en gebruik een aangescherpte Tungsten naald te maken radiale bezuinigingen door het netvlies en Sclera, terwijl immobilisatie van het oog met een andere Tungsten naald of Tang.
      Opmerking: Zorg ervoor dat u de lens niet beschadigt.
      1. Verscherp het uiteinde van een 2 cm lengte van 0,1 mm wolfraam draad elektrolytisch door het opschorten van de draaduiteinde in 10% (w/v) NaOH en het toepassen van een laag voltage afwisselend-stroom14. Beveilig de naald in een Pasteur pipet door het glazen uiteinde te smelten met een broodjes brander.
        Opmerking: Alternatieve fijne dissectie tools kunnen ook worden gebruikt.
        Let op: NaOH is corrosief.
    2. Voorzichtig Scoop uit de lens van het gescheiden oog met een botte kant van de naald, en voorzichtig weg te trekken bevestigd weefsel.

4. fixatie van ontleden lenzen

  1. Onmiddellijk vast te stellen ontleed lenzen in 1,5% (v/v)-genieter in PBS voor 24 uur bij kamertemperatuur (RT). Was lenzen drie keer in PBS voor 10 min elk.
  2. Permeabilize lenzen voor hele Mount analyse of cryoprotect voor cryosectioning (zie paragraaf 8).
    1. Permeabilize lenzen in PBS-T overnachting bij 4 °C.

5. lens Immunohistochemistry

  1. Label membranen van vaste embryo/larvale of volwassen lenzen door incubatie in Phalloidin-Alexa Fluor 546 (1:200) en CELKERN met DAPI (1:1000 van 5 mg/ml voorraad) in PBS-T overnachting bij 4 °c.
    Let op: DAPI is een huid en oog irriterend.
  2. Was drie keer met PBS-T voor 10 min elk. Duidelijk weefsel door incubatie in 30%, 50% en 70% glycerol in PBS-T (v/v) voor minstens 1 h bij RT elk, of overnachten bij 4 °C.
  3. Mount vis in 70% glycerol in PBS-T (v/v) op glasbodem 35 mm microwell gerechten met ogen zo plat en recht tegen de cover slip mogelijk. Voor jongere vissen, kan een lichte anterior-laterale schuine stand helpen om de lens hechting te oriënteren parallel aan de dekglaasje te zijn.

6. analyse van zebravis voorste lens hechtingen met behulp van een transgene lijn in vivo

  1. Genereer TG (βB1cry: mAppleCAAX) lijnen met behulp van de Tol2 Kit15. De Tol2 transponerende element systeem15 maakt een stabiele integratie van de constructie waar Mapple wordt gedreven door 300 BP van de menselijke βB1-crystallin promotor16 vastgebonden aan het membraan door de CAAX sequentie resulteert in expressie specifiek in lens Fiber celmembranen.
    Opmerking: Deze constructie (ID: 122451) is beschikbaar voor aankoop.
    1. Op de ochtend van injectie, bereid het injectie mengsel en houden op ijs. Om een definitief volume van 10 µ L te bereiken van het bevatten van ASE-en DNase-vrij H2O, voeg toe: 1,5 µ l van HuΒB1Cry: mAppleCAAX DNA construct op 50 ng/µ l-[0.375-0.75 PG/final injectie], 1,5 µ l van Tol2 transposase mRNA op 300 ng/µ l (Tol2 kit)15 [15-30 PG/ laatste injectie], en 1 µ L van fenol rode indicator op 1% w/v [1 X10-5% (w/v)/Final injectie].
    2. Injecteren 50-100 pL van injectie mengsel in 1-Cell fase embryo's12.
  2. Maatregel Transgenesis efficiency in F0 ingespoten embryo's door het meten van de frequentie van embryo's met mApple positieve lenzen op 3 DPF.
    Opmerking: Verwacht te hebben > 80% Transgenesis efficiëntie met behulp van deze methode. F0 mozaïeken maken een gedetailleerde analyse mogelijk van membraan morfologie van individuele cellen. Verschillende niveaus van mosaicisme maakt het mogelijk om het imago van de morfologie van enkele of kleine groepen van cellen, terwijl meer globale lens expressie maakt de analyse van multicellulaire structuren zoals lens hechtingen in vivo.
  3. Outcross F0 mozaïek vis te genereren stabiele lijnen, die label alle vezels celmembranen. F0 oprichters met het transgene geïntegreerd in de germline zal voortbrengen nakomelingen met stabiele integraties die kunnen worden gehandhaafd als transgene lijnen.

7. analyse van zebravis voorste lens hechtingen met behulp van een transgene lijn in vivo

  1. Verdoven 3 DPF of volwassen mozaïek of stabiele transgene vissen en onderstel in 1% lage smelting agarose (LMA) met tricaine met het oog vlak tegen de dekkingsstrook van glasbodem microwell schotels.
    1. Los 1 g LMA op in 100 mL EM (zonder methyleenblauw) om 1% LMA te maken. Bewaar lange termijn als 15 mL voorraden bij 4 °C. Magnetron op te lossen voorraad en op te slaan op 42 ° c tot elke buis wordt gebruikt.
  2. Bedek vis tot 6 DPF met EM met tricaine, of met tank water met tricaine voor volwassenen wanneer LMA is ingesteld.
    1. Meng 5 mL EM zonder methyleenblauw of tank water met 250 µ L van tricaine voorraad en 7 µ L van Pte als Imaging Pte behandelde vis.

8. lens Cryosectioning en Immunohistochemistry

  1. Cryoprotect vaste embryo's of volwassen lenzen door het plaatsen in 10% sacharose in PBS (w/v), 20% sacharose voor 1 h bij RT elk (of overnachting bij 4 ° c) en overnachting in 30% sacharose bij 4 °C.
  2. Embed weefsel in oktober in base mallen, en vervolgens bevriezen op chucks met OCT. Cryosection op 12-14 µm en verzamelen op een SuperFrost/plus Microscoop dia's. Warme delen op dia voor 10 min op een dia warmer voorverwarmd tot ~ 35 ° c.
  3. Was secties drie keer met PBS voor 10 min elk. Label secties met Phalloidin-Alexa Flour 546 (1:200) met DAPI (1:1000) of WGA-Alexa Flour 594 (1:200), gevolgd door drie PBS wast. Mount met anti-fade montage medium, en Seal dekglaasje met nagellak.

9. Imaging

  1. Verwerf beelden met een confocale Microscoop. Verwerven z-stacks of optische segmenten met behulp van een 60x N/A 1,2 water-onderdompeling doelstelling, of iets dergelijks, op specifieke regio's van de voorste naar achterste lens Pole. Gebruik de volgende acquisitie-instellingen: 1,2 luchtige schijf met behulp van de 561 nm laser, Texas Red filter voor phalloidin-Alexa Flour 546 of mApple, of de 405 laser met de UV-filter voor DAPI.
  2. Juiste z-intensiteit laservermogen om signaalverlies tegen te gaan met diepte in de lens. Dit zorgt voor een sterk signaal op de achterste pool van vaste en Live 3 DPF embryo's, en een sterk signaal in equatoriale optische plakjes in volwassen vis lenzen.
  3. Compileer en Bekijk beelden met behulp van beeldverwerkingssoftware.

10. meting van de lens Nucleus lokalisatie in de voorste-posterior as

  1. Orient vers besneden lenzen axiaal in PBS in een 35 mm schotel met een coverglass bodem, met palen en hechtingen georiënteerd parallel aan het vlak van de focus. Kijk voor een verschil in de brekingsindex, die meestal optreedt op de interface van de lens cortex en de lens Nucleus om de lenskern te identificeren.
    Opmerking: Gezond wild type volwassen lenzen zijn uiterst transparant waardoor het moeilijk is om de lens hechtingen en kern te zien, of om de lens oriëntatie te bepalen. In dit geval, een lichte Nick met een tang om de lens capsule veroorzaakt kleine beschadigingen, waardoor de hechtingen en de lenskern zichtbaar in ongeveer 10 min helpen om de lens te oriënteren voor deze meting. Echter, de lenzen onbruikbaar geworden voor downstream-toepassingen zoals ze zijn nu beschadigd.
  2. Neem beelden van lenzen met de lens Nucleus in focus onder fel veld verlichting met of zonder DIC optiek met behulp van een dissectie Microscoop met een camera bevestigd. Afbeelding een micrometer onder dezelfde vergroting voor kalibratie.
    1. Klik op de Live View knop, aanpassen van de belichting instellingen om de lenskern en de lens periferie te visualiseren, en neem een afbeelding door te klikken op de Snapshot knop. Opslaan als een TIF-bestand.
    2. Gebruik image processing software om de verworven lens beelden te kalibreren. Selecteer de rechte lijn gereedschap en teken een lijn van bekende lengte op de micrometer afbeelding, klikt u op analyseren | Stel schaal in. Voer bekende afstand, eenheden en selecteer ' Global ' kalibratie, en klik op OK.
  3. Meet de afstand van het midden van de lenskern aan de voorste paal (a-r).
    1. Gebruik het rechte-lijn hulpmiddel in beeldverwerkingssoftware om een lijn over het gebeelde centrum van de lenskern in een axiale richtlijn te trekken. Neem het midden van deze lijn als het midden van de lenskern.
    2. Teken een andere lijn van dit punt naar de voorste paal van de lens en selecteer ' maat ' in het ' analyseren ' menu om de afstand (a-r), waar a is de straal van de lens en r is de afstand van het midden van de lens naar het midden van de Nucleus.
    3. Teken een andere lijn van de voorste naar de achterste palen en meet deze afstand als de lens diameter (2a). Kopieer deze lengtes uit het venster ' resultaten ' en breng deze over naar een spreadsheet-of Statistiekprogramma.
      Opmerking: Het is makkelijker om precies te meten vanuit het midden van de kern naar de voorste paal, dan meten van het midden van de lenskern naar het midden van de lens. Deze meting wordt omgezet door de formule in stap 10.3.5 om de afstand van het midden van de lenskern te rapporteren aan het midden van de lens. Gebruik altijd de volwassen Nucleus voor metingen, ook al is de embryonale kern evident.
    4. Verdeel de diameter door 2, om de lens RADIUS te berekenen, a.
    5. Bereken r/a, zoals figure-protocol-1 , dat is de genormaliseerde lokalisatie van de lenskern met betrekking tot de lens straal.
      Opmerking: voor een Nucleus dichter bij de voorste paal, r/a zal worden > 0.0, terwijl een centraal gelokaliseerde kern zal een r/a van 0,0.
  4. Grafiek de log van de genormaliseerde axiale Nucleus meting als een functie van de standaard lengte om veranderingen in de lens Nucleus lokalisatie te bepalen tijdens zebravis ontwikkeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adult zebravis Eye anatomie lijkt sterk op die van zoogdieren (Figuur 1a). Ondanks enkele verschillen tussen zebravis en zoogdier ogen, zoals het hebben van een tril gebied in plaats van een tril lichaam17, verschillen in optische eigenschappen18, en verschillen in morfogenese tijdens de embryonale ontwikkeling19, de zebravis Eye is een uitstekend model voor het bestuderen van ontwikkelin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse van de zebravis lens morfologie is de eerste stap in het begrijpen van fenotypen in mutanten, of de effecten van farmacologische interventies gericht op het bestuderen van de biologie van de oculaire lens. We schetsen methoden om lens hechtingen, corticale Fiber Cell morfologie en aspecten van de lens Nucleus te analyseren. Deze benaderingen zijn een combinatie van in vitro en in vivo (vergeleken in tabel 1). De in vitro methoden zorgen voor meer detail van de buitenste...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben geen onthullingen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen graag onze financiële bron te erkennen: NIH R01 EY05661 aan J. E. H, Ines Gehring voor het assisteren bij het genereren van de aqp0a/b dubbele mutanten en zebravis veeteelt, Dr Daniel Dranow voor discussies die leiden tot generatie van de transgenes, Dr Bruce Blumberg en Dr Ken Cho Labs voor het gebruik van hun ontleden microscopen, en Dr Megan Smith voor hulp bij statistische analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-fenyl-2-thioureum (PTU)SigmaP7629VOORZICHTIG – zeer giftig
4% Paraformaldehyde waterige oplossingElectron Microscopy SciencesRT 157-4VOORZICHTIG – gezondheidsrisico, ontvlambaar
Confocale microscoopNikonEclipse Ti-E
CryostatLeicaCM3050SObjectief en kamertemperatuur ingesteld op -21 °C
DAPIInvitrogenD1306VOORZICHTIG – irriterend voor ogen en huid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificD128VOORZICHTIG – ontvlambaar, dringt door de huid
Beker met afneembare basisVWR Scientific15154-631
Weggeef Pasteur glazen pipettenFisherbrand13-678-20A
Dumont #5 pincetDumont & FilsPincet scherp houden
Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout (Tricaine)Sigma-AldrichA5040VOORZICHTIG - giftig
Glazen bodem microwell schotel (35mm petrischaal, 14 mm microwell, #1.5 dekglas)MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
GlycerolSigmaG2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA constructAddgeneID:122451
ImageJWayne Rasband, NIHv1.51n
Low Melt Agarose (LMA)Apex902-36-6
NIS-ElementsNikonV 4.5
NIS-Elements AR softwareNikon
Olympus  met een model 2.1.1.183 controllerOlympus CorpDP70
Olympus microscoop Olympus CorpSZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546Thermo FisherA22283
Fenol Rood indicator (1% w/v)Ricca Chemical Company5725-16
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Fisher ScientificBP399
PhotoshopAdobeCS5 v12.0
Photoshop softwareAdobeCS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objectiefNikon
StroombronWild HeerbruggMTr 22Of gelijkwaardige stroombron 
Diapositiva warmer model nr. 26020FSFisher Scientific12-594
Natriumhydroxide kralenFisher ScientificS612-3VOORZICHTIG - corrosief/irriterend voor ogen en huid, doelorgaan - ademhalingssysteem, corrosief voor metalen
Superfrost/Plus microscoopglasFisher Scientific12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow CorningWorld Prevision InstrumentsSYLG184
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek4583
Triton X-100 BioXtraSigmaT9284VOORZICHTIG – Giftig, gevaarlijk voor aquatisch milieu, corrosief
Vannas micro-dissectiescharenTed Pella Inc1346Scherp/scherpe rechte punten
Vectashield antifade montagemediumVector laboratoriesH-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594Life TechnologiesW11262

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
  13. Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12(2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68(2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lenshechtinglensdissectiehistologische analyseimmunohistochemiein vivo imagingfluorescentiemarkeroptische aslensdiameter

Gerelateerde artikelen