Methoden voor het testen van endocriene verstoring in fruitvliegje melanogaster

Samenvatting

Endocriene verstorende chemicaliën (Edc's) vormen een ernstig probleem voor organismen en voor natuurlijke omgevingen. Fruit vliegje melanogaster is een ideaal model om EDC-effecten in vivo te bestuderen. Hier presenteren we methoden om endocriene verstoring in fruitvliegje te onderzoeken, het aanpakken van EDC effecten op Fecundity, vruchtbaarheid, ontwikkelingsstoornissen timing, en de levensduur van de vliegen.

Samenvatting

In de afgelopen jaren is er steeds meer bewijs dat alle organismen en het milieu worden blootgesteld aan hormoon-achtige chemicaliën, bekend als endocriene verstorende chemicaliën (Edc's). Deze chemische stoffen kunnen veranderen de normale balans van endocriene systemen en leiden tot negatieve effecten, evenals een toenemend aantal hormonale stoornissen in de menselijke populatie of verstoorde groei en verminderde voortplanting in de wild levende dieren. Voor sommige Edc's, zijn er gedocumenteerd gezondheidseffecten en beperkingen op het gebruik ervan. Nochtans, voor de meesten van hen, is er nog geen wetenschappelijk bewijsmateriaal in deze betekenis. Om de mogelijke endocriene effecten van een chemische stof in het volledige organisme te verifiëren, moeten we deze testen in geschikte modelsystemen, evenals in de fruitvlieg, melanogaster. Hier rapporteren wij gedetailleerde in vivo protocollen om endocriene verstoring in fruitvliegje te bestuderen, dat EDC gevolgen voor de Fecundity/de vruchtbaarheid, ontwikkelings timing, en levensduur van de vlieg aanpakt. In de afgelopen jaren, gebruikten we deze vlieg fruit levens trekken om de effecten van blootstelling aan 17-α-ethinylestradiol (EE2), Bisfenol A (BPA), en bisfenol AF (BPA F) te onderzoeken. In totaal behandelden deze analyses alle stadia van het fruitvliegje en maakten ze het mogelijk om de endocriene ontwrichting in alle hormoon gemedieerde processen te evalueren. Fecundity/vruchtbaarheid en ontwikkeling timing assays waren nuttig om de EDC impact op de Fly reproductieve prestaties en ontwikkelingsstadia te meten, respectievelijk. Ten slotte, de levensduur assay betrokken chronische EDC blootstelling aan volwassenen en gemeten hun overlevingspensioen. Deze levens eigenschappen kunnen echter ook worden beïnvloed door verschillende experimentele factoren die zorgvuldig gecontroleerd moesten worden. Dus, in dit werk, raden we een reeks van procedures die we hebben geoptimaliseerd voor de juiste uitkomst van deze tests. Deze methoden kunnen wetenschappers vast te stellen endocriene ontwrichting voor een EDC of voor een mengsel van verschillende Edc's in fruitvliegje, hoewel het endocriene mechanisme verantwoordelijk voor het effect te identificeren, verdere essays nodig zou kunnen zijn.

Inleiding

Menselijke activiteiten zijn het vrijgeven van in het milieu een enorme hoeveelheid chemicaliën, die een ernstig probleem voor organismen en voor natuurlijke ecosystemen vertegenwoordigen¹. Van deze verontreinigende stoffen wordt geschat dat ongeveer 1.000 verschillende chemicaliën het normale evenwicht van endocriene systemen kunnen veranderen; Volgens deze eigenschap, worden zij geclassificeerd als endocriene verstorende chemische producten (Edc's). Specifiek, op basis van een recente definitie van de endocriene samenleving, de Edc's zijn "een exogene chemische stof, of een mengsel van chemicaliën, die kunnen interfereren met elk aspect van h....

Protocol

1. voedselbereiding

1. Voor voorraad onderhoud en voor larvale groei, gebruik maken van een flappen medium met 3% poeder gist, 10% sacharose, 9% voorgekookt flappen, 0,4% agar, daarna genoemd flappen medium (CM).
   1. Zet 30 g gist in 100 mL van leidingwater, breng het aan de kook en laat het koken voor 15 minuten.
   2. Afzonderlijk, meng goed 90 g van voorgekookte flappen, 100 g suiker, en 4 g agar in 900 mL van leidingwater.
   3. Breng de oplossing aan de kook, lager het vuur en bak gedurende 5 minuten continu roeren.
   4. Na 5 minuten, voeg de hete gist oplossing en laat sudderen voor nog eens 15 minuten.
   5. Z....

Resultaten

In deze sectie worden de belangrijkste stappen van de bovenstaande protocollen gerapporteerd in de vorm van vereenvoudigde regelingen. Gezien het dat vliegen de neiging om onsmakelijke verbindingen te vermijden, het eerste ding om te doen is om de smaak van de geselecteerde EDC assay. Dit kan worden gedaan door het mengen van een levensmiddel kleuren (bijvoorbeeld rood voedsel kleurstof No. 40)³⁵ met het voedsel aangevuld met de geselecteerde EDC bij verschillende doses of met het oplosmiddel alle.......

Discussie

De fruitvlieg D. melanogaster is op grote schaal gebruikt als een in vivo modelsysteem om de mogelijke effecten van milieu EDC'S zoals DBP²⁸, BPA, 4-NP, 4-tert-op²⁹, MP³⁰, EP³¹te onderzoeken^{, 32}, DEHP³³, en EE2³⁴. Verschillende redenen hebben geleid tot het gebruik ervan als een model op dit gebied van onderzoek. Naast zijn onbetwiste .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Bisphenol A	Sigma	239658-50G
Bisphenol AF	Sigma	90477-100MG
Cornmeal	CA' BIANCA
Diethyl ether	Sigma
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Embryo collection cage	Crafts		Plexiglass cylinder (12,5 mm x 7 cm) met een open uiteinde en de andere kant gesloten door een rechthoekige basis waarin een sleuf de invoer van speciale bakjes voor het leggen mogelijk maakt
Ethanol	FLUKA	2860
Etherizer	Crafts		cilindrische glazen container met een katoenen plug
Glass Bottle			250 mL flessen
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy	Ariete		keukenmachine
Instant Success yeast	ESKA		poedergist
Laying tray	Crafts		plexiglas bakjes (11 cm x 2,6 cm) waarin medium voor het leggen gegoten kan worden
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Petri Dish	Falcon	351016	60x5
Red dye no. 40	SIGMA	16035
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Tomato sauce	Cirio