Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een in vivo oestrogeen deficiëntie muis model voor het screenen van exogene oestrogeen behandelingen van cardiovasculaire disfunctie na de menopauze

12K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59536

⸱

13 augustus 2019

 ,  , 
1Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Shandong University of Traditional Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Klinisch, oestrogeen deficiëntie bij menopauzale vrouwen kunnen verergeren de incidentie van lipide verstoring en atherosclerose. We vestigden een in vivo oestrogeen deficiëntie model door bilaterale ovariëctomie via een dubbele Dorsale-laterale incisie in apoE-/- muizen. Het muismodel is van toepassing voor het screenen van exogene oestrogeen behandelingen van cardiovasculaire disfunctie na de menopauze.

Samenvatting

Postmenopauzale vrouwen lopen een groter risico op het ontwikkelen van cardiovasculaire aandoeningen dan premenopauzale vrouwen. Vrouwelijke muizen ovariectomized (OVX) bij spening display verhoogde atherosclerotische laesies in de aorta in vergelijking met vrouwelijke muizen met intact ovariële functie. Echter, laboratorium modellen waarbij oestrogeen-deficiënte muizen met atherosclerose-gevoelige status ontbreken. Dit tekort is van cruciaal belang omdat klinische oestrogeen deficiëntie bij menopauzale vrouwen de incidentie van reeds bestaande of voortdurende lipide verstoring en atherosclerose kan verergeren. In deze studie, we vestigen een in vivo oestrogeen-deficiënte muismodel door bilaterale ovariëctomie via een dubbele Dorsale-laterale incisie in apolipoproteïne E (ApoE)-/- muizen. Vervolgens vergelijken we de effecten van 17β-estradiol en pseudoprotodioscin (PPD) (een fyto-oestrogeen), oraal toegediend via hazelnoot verspreiding. We vinden dat hoewel PPD enige invloed uitoefent op het verminderen van het eindgewicht en plasma TG in OVX apoE-/- muizen, het anti-atherosclerotische en cardiale beschermende capaciteiten heeft die vergelijkbaar zijn met zijn tegenhanger van 17β-estradiol. PPD is een fyto-oestrogenen die is gemeld dat anti-tumor eigenschappen uit te oefenen. De voorgestelde methode is dus van toepassing op het screenen van fyto-oestrogenen via perorale toediening ter vervanging van traditionele hormonale substitutietherapie bij postmenopauzale vrouwen, waarvan is gemeld dat zij potentieel schadelijke tumorigenetische Capaciteit. Perorale toediening via hazelnootpasta is niet-invasief, waardoor het algemeen toepasbaar is op veel patiënten. Dit artikel bevat stapsgewijze demonstraties van bilaterale ovariëctomie via de dubbele Dorsale-laterale incisie in apoE-/- muizen en peroral 17β-estradiol of fyto-oestrogeen hormoon vervanging via hazelnoot verspreiding. Plasma lipide en cardiovasculaire functie analyses met behulp van echocardiografie volgen.

Inleiding

Epidemiologische en klinische studies hebben aangetoond dat postmenopauzale vrouwen een aanzienlijk groter risico op hart-en vaatziekten hebben dan premenopauzale vrouwen1,2. Hormonale substitutietherapie (HRT) kan het relatieve risico van hart-en vaatziekten te verminderen 0,37-0.793. Onder andere complicaties, atherosclerose veroorzaakt door hart-en vaatziekten is de belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd4. Echter, laboratorium modellen waarbij oestrogeen deficiënte muizen presenteren atherosclerose gevoelige status ontbreken. Dit protocol biedt een in vivo oestrogeen deficiëntie muismodel voor het screenen van exogene oestrogeen behandelingen van cardiovasculaire disfunctie na de menopauze.

Eerdere studies tonen aan dat de toepassing van ovx in atherosclerotische knaagdieren gevoed met een hoog-cholesterol dieet postmenopauzale vrouwen die lijden aan atherosclerose5,6,7,8kan nabootsen. Een reproduceerbare en handige diermodel lijkt op de atherosclerotische toestand bij menopauzale vrouwen is de basis van exogene oestrogeen onderzoek. Hier werd een dubbele Dorsale-laterale incisie van bilaterale ovariëctomie toegepast bij atherosclerose-gevoelige apolipoproteïne E Knockout (ApoE-/-) muizen9,10. Vergeleken met middelste buik-of dorsale incisie, is dubbele Dorsale-laterale incisie een eenvoudigere, minder tijdrovende methode die ernstige hechting en ontsteking van de buikholte kan voorkomen. Perorale toediening via hazelnoot verspreiding (Zie tabel van de materialen) is niet-invasief en handig, waardoor het algemeen toepasbaar als een lange termijn administratie modus11. Slow-release pellet implantatie is ook populair6. Implantaten verergeren echter de incidentie van infectie, vooral bij muizen die onderworpen zijn aan OVX. Andere niet-invasieve toedieningswijzen, zoals mond sonde en waterbeheer, hebben ook veel nadelen. Orale maagsonde stress meestal muizen en kan veroorzaken oesofageale letsel. Het hormoon toedienen via drinkwater is zeer gunstig; echter, de toevoeging van DMSO als een emulgator is onvermijdelijk als exogene oestrogenen zijn onoplosbaar in water. Hier kozen we voor peroral 17β-estradiol of fyto-oestrogenen hormoon vervanging via hazelnoot verspreiding voor langdurige toediening.

Onlangs is het gunstige effect van HRT op het cardiovasculaire systeem van postmenopauzale vrouwen betwist in het vrouwen gezondheidinitiatief (WHI) Trials12. Aan de ene kant, exogene oestrogeen alleen oefent een gunstig effect op het cardiovasculaire systeem; aan de andere kant, het kan combineren met metohydroxyprogesteron acetaat te verhogen het risico van cardiovasculaire gebeurtenissen. Serieuzer, HRT kan leiden tot borst-en baarmoeder tumorprogressie, en dit effect heeft aanzienlijk beperkt het gebruik13,14. Meer belangstelling is gericht op de cardiovasculaire-beschermende effecten van exogene oestrogenen ontbreekt mitotische activiteit in tumorcellen15,16,17. Meerdere studies bij mens en dier suggereren dat fyto-oestrogenen met structuren die vergelijkbaar zijn met die van oestrogeen een gunstige rol in cardiovasculaire bescherming kunnen spelen15,18.

Dus, de doelstellingen van het huidige werk zijn (i) om een in vivo oestrogeen deficiëntie muismodel te bouwen door bilaterale ovariëctomie via een dubbele Dorsale-laterale incisie in apoE-/- muizen en (II) om de cardiovasculaire beschermende effecten van peroraal te vergelijken toegediend 17β-estradiol en pseudoprotodioscin (PPD), via hazelnoot verspreiding. 17β-estradiol is een soort exogene oestrogeen dat behoort tot vrouwelijke seksuele hormonen6,11,19. PPD, een steroïde saponine en fyto-oestrogenen van Dioscorea planten, is eerder gemeld om uit te oefenen anti-tumor eigenschappen20.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle Dierenzorg-en experimentele protocollen werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Chinese Academie voor medische wetenschappen en Peking Union Medical College (machtigings nummer: SYXK (Peking) 2013-0023). De oorsprong van ApoE-/- muizen is C57BL/6j9,10.

1. bilaterale Ovariëctomie via een dubbele Dorsale-laterale incisie in apoE-/- muizen

  1. Bij het spenen (leeftijd 28 dagen), verdoven vrouwelijke ApoE-/- C57BL/6j muizen met Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneally).
    Opmerking: 32 ApoE-/- muizen werden willekeurig verdeeld in 4 groepen: Sham, ovx, ovx/E2, en ovx/PPD groep (n = 8 per groep).
  2. Plaats het dier in de liggende positie op een verwarmingskussen. Breng oogsmeer middel voor oogbescherming tijdens de anesthesie.
  3. Behoud de lichaamstemperatuur binnen 36 ± 0,5 °C. Dien 5 mg/kg lichaamsgewicht van de analgetische carprofen subcutaan toe aan het laterale aspect van de nek van de muis.
  4. Scheer een 3 x 5 cm2 muis gebied kopborststuk van de iliacale Crest. Voorafgaand aan het bedekken van het dier met een 3 x 5 cm2 diafragma chirurgische plaat, reinig het geschoren gebied grondig met jodium en vervolgens 70% ethanol. Gebruik tijdens het experiment steriele instrumenten en handschoenen.
  5. Gebruik een schaar en een tang om een incisie van 1 cm lateraal aan de middenlijn en 1 cm laterale aan de ribben te maken.
  6. Ontleden het onderhuidse weefsel met behulp van een tang.
  7. Gebruik ontleed bril (Zie tabel met materialen) om het witte vetweefsel in de buikholte te identificeren.
  8. Gebruik micro schaar en microforceps om een insnijding van 0,5-1 cm door de fascia te maken tot de buikholte is bereikt.
    Opmerking: Voor de Sham-bediende groep, sluit de wonden direct. Hechting van de spierlaag en de huid afzonderlijk met behulp van een monofilament hechtmiddel.
  9. Wanneer het witte vetweefsel in de buikholte kan worden gezien, pak het vetweefsel met behulp van microforceps en trek het voorzichtig uit. Een roze moerbei vormige eierstok gewikkeld door vetweefsel in de buikholte kan worden gezien.
  10. Ligate het 0,5-1 cm proximale vat en de baarmoeder hoorn met behulp van een monofilament hechtmiddel. Verwijder de eierstok met behulp van een micro schaar en plaats het resterende weefsel terug in de buikholte.
    Opmerking: De belangrijkste nadelige symptomen voor de OVX-operatie is ureterale ligatie die leidt tot hoge sterfte in OVX-bediende muizen. Dit kan worden vermeden door het identificeren van de weefsels met behulp van een ontleed Goggle.
  11. Sluit de wonden. Hechting van de spierlaag en de huid afzonderlijk met behulp van een monofilament hechtmiddel.
  12. Gebruik een schaar en een tang om een andere incisie van 1 cm laterale naar de middenlijn en 1 cm laterale aan de ribben aan de andere kant te maken. Herhaal de bovenstaande procedure (1,5 tot 1,11).
  13. Laat het dier ontwaken uit de anesthesie. Houd de muis apart op de eerste dag na de operatie.
  14. Reinig of vervang de kooi regelmatig tijdens de herstelfase.
  15. Ongeveer 24 h na de operatie, toedienen van een ander 5 mg/kg lichaamsgewicht van de analgetische carprofen subcutaan.

2. perorale toediening van 17β-estradiol of PPD via hazelnoot verspreiding

  1. Los 17β-estradiol of PPD in sesamolie grondig op en meng vervolgens de sesamolie met hazelnootpasta (Zie tabel met materialen). Een dagelijkse portie voor elke 30 g muis bevat 3 μg 17β-estradiol of 15 μg PPD, 4 μL sesamolie en 60 mg hazelnootpasta. Bereid een placebo voor elke 30 g muis bevat 4 μL sesamolie en 60 mg hazelnootpasta.
    Opmerking: Het dagelijkse toedienings gedeelte van 17β-estradiol of PPD was gebaseerd op eerdere onderzoeken6,11 en voorbereidende experimenten.
  2. Een week na OVX, voeden de muizen met een hoog-cholesterol dieet (1,25% cholesterol, 0% cholate) voor 12 weken. Een typische experimentele behandelings regeling, zoals gebruikt in deze studie, wordt geïllustreerd in Figuur 1.
  3. 5 dagen voor de perorale toediening van hazelnoot verspreid in week 4, Train de muizen om de placebo te eten met ongeveer 30 mg hazelnoot spreiding voor 2-5 muizen gedurende 5 dagen. Train de muizen in groepen in hun huis kooien tijdens de eerste 3 dagen. Plaats de muizen in afzonderlijke kooien op de vierde en vijfde dagen van de training en serveer de dagelijkse portie om de experimentele situatie te lijken.
  4. In de laatste 9 weken, plaats de muizen in aparte kooien en serveer vervolgens dagelijks een portie hazelnoot spreiding voor elke voeder gelegenheid.
    Opmerking: Serveer een dagelijkse portie met 17β-estradiol (0,1 mg · kg-1) of PPD (0,5 mg · kg-1) via hazelnoot verspreiding in respectievelijk ovx/E2 en ovx/PPD-groep; Serveer een dagelijkse portie met hormoon vrije hazelnoot verspreiding in SHAM en OVX groep.

3. bepaling van de Intima-media dikte en cardiale disfunctie met behulp van een Microultrasoon systeem

  1. Ultrasonografische biomicroscopie
    1. Een dag voor de beëindiging, onderzoeken Intima-media dikte en cardiale disfunctie met behulp van een microecho grafie systeem (Zie tabel van de materialen) zoals eerder beschreven21.
    2. Vóór het onderzoek, geef elke muis een 200 mg/kg intraperitoneale injectie van Avertin (tribromoethanol) als anesthesie (n = 8 muizen per groep).
    3. Scheer het nekhaar van elke muis voorzichtig. Breng warme ultrasone transmissie gel royaal aan om een optimale beeldkwaliteit te garanderen.
    4. Verkrijg Baseline ultrasonografische beelden van de aorta wortel en oplopende aorta met de 30 MHz scan Head op een 12,7 mm focus en een resolutie van 40 μm.
    5. Gebruik elektrocardiografie met een lead II configuratie voor monitoring.
    6. Leg de juiste parasternale lange-assige beelden vast van de stijgende aorta, aortische boog en brachiocephalische arterietak in één vliegtuig in systool (Figuur 3).
  2. Metingen van Intima-media en maximale plaque dikte
    1. Pas de afstand tussen de transducer en de arteriële plaats gemakkelijk aan om duidelijke beelden te verkrijgen.
    2. Bewaar een 10 s Cine loop digitaal voor offline onderzoek op een beeldanalyse systeem.
    3. Kies voor verdere metingen handmatig een optimaal Freeze-frame ultrasonografisch beeld. Controleer de beelden in de kleine kromming van de oplopende aorta. Als plaque in de oplopende aorta kan worden gezien, meet de maximale plaque dikte. Als plaque in de opgaande aorta niet kan worden gezien, meet de maximale IMT.
    4. Meet de IMT (afstand tussen de vasculaire luminal-intimale interface en de mediale-adventitiële Interface). Meet de maximale plaque dikte (de dikste afstand tussen de rand van het vasculaire lumen en de adventitiële laag).
    5. Gemiddelde gegevens van drie laesie sites (Figuur 3).
  3. Bepaling van cardiale disfunctie met behulp van echocardiografie
    Opmerking:     onderzoek de cardiale functie via echocardiografie met behulp van een microultrasone systeem, zoals eerder beschreven22.
    1. Direct een ultrasone straal naar het hart, in de buurt van de papillaire spieren.
    2. Bereik twee-dimensionale elektrocardiogram gebaseerde kilohertz visualisatie.
    3. Voer in vivo transthoracische echocardiografie van de linker ventrikel met behulp van een 30 MHz scan hoofd.
    4. Meet parameters gekoppeld aan cardiale functie digitaal van M-modus tracings.
    5. Gemiddelde van de gegevens van drie tot vijf cardiale cycli (tabel 1).
  4. Intra-en interobserver variabiliteit
    1. Voor validatie van intraobserver variabiliteit, analyseren van de gegevens door één operator op twee verschillende gelegenheden.
    2. Voor evaluatie van interobserver variabiliteit, analyseren van de gegevens door een andere operator.

4. wekelijkse meting van het lichaamsgewicht en bepaling van het plasma totaal cholesterol (TC) en triglyceride (TG)

  1. Wekelijkse lichaamsgewicht meting
    1. Meet lichaamsgewichten eenmaal per week van week-1 tot week 12.
      NB: n = 8 muizen per groep.
  2. Plasma preparaat
    1. Voordat u bloedmonsters verzamelt via intracardiale punctie, bereidt u spuiten en buizen voor. Gebruik EDTA als antistollingsmiddel. Voeg 10 μL van 0,5 M EDTA toe aan elke 2 mL spuit en voeg 8 μL 0,5 M EDTA toe aan elke tube van 1,5 mL.
    2. In week 12, na een nacht vasten, anesthetiseren de muizen met Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneaal).
      Opmerking: n = 3 muizen per groep.
    3. Bereid het ventrale borst oppervlak voor met 70% ethanol.
    4. Gebruik een schaar en een tang om de thoracische holte te openen en snijd de ribben tot het kloppend hart wordt blootgesteld.
    5. Steek de 25 G naald in de rechter ventrikel. Aspireren langzaam totdat het bloed begint te stromen in de spuit.
      Opmerking: We gebruiken wegwerpspuiten in steriele toestand met 25 G naalden (Zie tabel met materialen).
    6. Blijven aspireren met constante, gelijkmatige druk. Als er geen bloed wordt gezien, plaats de naald dan opnieuw en herhaal aspiratie.
    7. Houd muizen diep verdoeiliseerd voordat het vereiste bloed volume wordt verzameld. Normaalgesproken kan maximaal 1 mL bloed worden verzameld. Euthaniseer de muizen door cervicale dislocatie onder deze diepe verdoving aandoening.
    8. Pipetteer bloedmonsters in buizen van 1,5 mL en keer het bloed om in het bloed om ervoor te zorgen dat EDTA wordt gemengd. Plaats dan onmiddellijk bloedmonsters op ijs.
    9. Centrifugeer monsters gedurende 20 minuten bij 400 x g bij 4 °c binnen 30 minuten na afname.
    10. Vang het supernatant zorgvuldig op. Aliquot en bewaar plasma monsters bij-80 °C.
  3. Construct standaard curves voor TC of TG content meting
    1. Voor de TC-standaard curve bereidt u verschillende concentraties van cholesterol normen voor: 0 mmol/L, 0,52 mmol/L, 1,03 mmol/L, 2,07 mmol/L, 4,14 mmol/L, 6,20 mmol/L, 8,27 mmol/L en 10,34 mmol/L. meet O.D. voor elke cholesterol norm. Stel gemiddelde O.D. voor elke cholesterol norm. Stel als de waarde van de verticale as (Y) de concentratie in als de waarde voor de horizontale as (X). Maak een standaard curve met behulp van een statistische software.
    2. Voor de TG standaard curve, bereiden verschillende concentraties van TG-normen: 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/L, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L en 9,04 mmol/L. meet O.D. voor elke TG-norm. Stel gemiddelde O.D. voor elke TG-standaard in als de verticale (Y) Aswaarde; Stel de concentratie in als de waarde voor de horizontale as (X). Maak een standaard curve met behulp van een statistische software.
      Opmerking: Een vier-parameter logistieke curve fitting (4-PL) werd gebruikt voor de standaard curve constructie in de huidige studie. Controleer de standaard curve voordat u de plasma monsters meet en zorg ervoor dat r2 groter is dan 0,995.
  4. Meting van TC-inhoud
    1. Label de fles kleur reagens (25 mL) van de TC assay kit als "TC Working Solution".
    2. Vortex de gekoelde exemplaren kort. Verdunningen voorbereiden: 20 μL plasma in 80 μL gedistilleerd water. Kort Vortex verdunningen.
    3. Voeg 2,5 μL cholesterol normen (5,17 mmol/L) of 2,5 μL verdund plasma of 2,5 μL gedestilleerd water (blanco) toe aan de juiste putjes van een 96-well plaat. Triplication wordt aanbevolen.
    4. Voeg aan alle putjes 250 μL van het kleur reagens toe.
    5. Incuberen bij 37 °C gedurende 10 min.
    6. Draai de microplaat Reader aan en laat 10 minuten opwarmen.
    7. Verwijder de plaat (en) uit de incubator en lees de microplaat Reader op 510 Nm. Zorg ervoor dat er geen bellen of stof aanwezig zijn in de micro titer putten of aan de onderkant van de plaat, respectievelijk.
    8. Bereken de TC-concentratie als volgt:
      TC cont. = cholesterol normen cont. × (plasma monster O.D.-Blanco O. D)/(cholesterol normen O.D.-Blanco O. D)
  5. TG-inhoud meten
    1. Label de fles kleur reagens (25 mL) uit TG-assay kit als "TG-werkoplossing".
    2. Vortex de gekoelde exemplaren kort.
    3. Voeg 2,5 μL TG-normen (2,26 mmol/L) of 2,5 μL verdund plasma of 2,5 μL gedestilleerd water (blanco) toe aan de juiste putjes van een 96-wells plaat. Triplication wordt aanbevolen.
    4. Voeg aan alle putjes 250 μL van het kleur reagens toe.
    5. Incuberen bij 37 °C gedurende 10 min.
    6. Draai de microplaat Reader aan en laat 10 minuten opwarmen.
    7. Verwijder de plaat (en) uit de incubator en lees de microplaat Reader op 510 Nm.
      Opmerking: Zorg ervoor dat er geen bellen of stof aanwezig zijn in de micro titer putten of op de bodem van de plaat.
    8. Bereken de TG-concentratie als volgt:
      TG vervolg = TG-normen cont. × (plasma monster O.D.-Blanco O. D)/(TG-normen O.D.-Blanco O. D)

5. en Gezichtsanalyse van aorta atherosclerotische laesies

  1. Aorta isolatie en excisie
    1. In week 12, na een nacht vasten, anesthetiseren de muizen met Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneaal). Euthaniseer de muizen door cervicale dislocatie onder deze diepe verdoving aandoening.
      Opmerking: We gebruikten 3 muizen per groep.
    2. Bereid het ventrale borst oppervlak voor met 70% ethanol. Gebruik een schaar en een tang om de thoracische holte te openen en snijd de ribben tot het kloppend hart wordt blootgesteld.
    3. Vul een 50 mL spuit met fosfaatgebufferde zoutoplossing bij pH 7,4 (Zie tabel van de materialen). Steek een 25 G naald in de linker ventrikel en snijd het rechter Atrium om hoge druk van perfusie te voorkomen.
    4. Voer in situ perfusie uit met een debiet van 0,05-0.08 mL/min. Absorbeer perfusievloeistof met weefsels.
    5. Verwijder ribben en longen in de thoracische holte met een schaar en een tang. Open vervolgens de buikholte en verwijder de organen naar binnen voor een beter zicht op de aorta.
    6. Verwijder de aorta door het hart met de microforceps te houden en de aorta te scheiden van rugdorsaal met microscisssors tot de iliacale bifurcatie.
      Opmerking: Bij het ontleden in de buurt van de nieratriale takken, snijd diep met behulp van micro schaar om te voorkomen dat aorta schade.
    7. Bevestig het hart en aorta voor 48 h in 4% Paraformaldehyde. Bewaar de aortas in zoutoplossing bij kamertemperatuur of bij 2-8 °C gedurende een paar uur.
      Opmerking: Deze procedure vergemakkelijkt de reiniging.
  2. Voorbereiding van aorta
    1. Verwijder het hart. Verwijder voorzichtig de adventitiële weefsels uit de aorta's met behulp van microforceps en microscisssors onder een stereomicroscoop. Gebruik zoutoplossing om het weefsel vochtig te houden tijdens het reinigen.
      Opmerking: Wees voorzichtig om niet scheuren of Nick de aorta en enkele belangrijke takken, zoals de anoniem slagader, links gemeenschappelijke carotis slagader, en linker subclavia slagader.
    2. Laat 1 mm van de anoniem en links gemeenschappelijke carotis slagaders en afgesneden van de gehele linker subclavia slagader.
    3. Snijd Open de buitenste kromming door de anoniem slagader, dan naar de linker gemeenschappelijke halsslagader, en vervolgens naar de linker subclavia slagader.
    4. Snijd open langs de binnenste kromming van het oplopende gedeelte naar de onderkant van het buik gedeelte.
    5. Speld de aorta plat op een zwarte plastic plaat en breng een zoutoplossing aan om aorta's te laten drogen.
  3. Afbeelding van de intimale regio van aorta
    1. Maak foto's van en gezicht aortas met een stereomicroscoop. Neem een millimeter schaal liniaal op in de afbeeldingen om metingen te kalibreren.
    2. Neem de boog en thoracale gebieden in hetzelfde beeld en de abdominale regio in een ander. Afbeeldingen opslaan als JPEG of TIFF.
      Opmerking: De boog regio is van de kruising van het myocardium tot 3 mm distale van de linker subclavia slagader, de thoracale regio is 3 mm distale naar de linker subclavia slagader naar de laatste intercostale slagader, en de abdominale regio is de laatste intercostale slagader naar de iliacale Bifurcatie.
  4. Kwantificering van atherosclerotische laesie-en gezichts methode
    1. Kalibratie
      1. Open de afbeelding met beeldanalyse software (Zie tabel met materialen), ga naar ruimtelijke kalibratie en volg de instructies.
      2. Wijzig de referentie-eenheden in mm door de liniaal over de lijn te plaatsen.
    2. Meting
      1. Stel de juiste kalibratie in voor elke afbeelding.
      2. Meet 3 mm op de liniaal.
      3. Meting van de boog en de thoracale regio: schets het gebied van de boog van de kruising van het myocardium tot 3 mm distale van de linker subclavia slagader en het thoracale gebied van 3 mm distale naar de linker subclavia slagader naar de laatste intercostale slagader. Traceer laesies in de boog en de thoracische regio en kijk naar de aorta door de Microscoop.
      4. Abdominale regio meting: omtrek van de abdominale regio van het einde van de thoracale regio naar de iliacale bifurcation. Trace laesies in de abdominale regio en kijk naar de aorta door de Microscoop.
      5. Bereken het laesie gebied ten opzichte van het binnenste oppervlak van aorta.
      6. Controleer de kwantificering door een tweede waarnemer die blind is voor de studiegroepen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een typische experimentele behandelings regeling, zoals gebruikt in deze studie, wordt geïllustreerd in Figuur 1. Bij het spenen (leeftijd 28 dagen), vrouwelijke apoE-/- C57BL/6j muizen werden verdoeiliseerd withavertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneally). Muizen waren bilateraal OVX of Sham bediend door middel van een 1 cm dorsale incisie. Een week na bilaterale OVX, de muizen werden gevoed een hoog-cholesterol dieet (1,25% cholesterol...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven methodologie is een muismodel dat lijkt op lipide verstoring en atherosclerose gezien bij menopauzale vrouwen. Het is goed gedocumenteerd dat oestrogeen deficiëntie bij postmenopauzale vrouwen kan verergeren de incidentie van reeds bestaande of lopende hypercholesterolemie met progressief complexe en wijdverbreide atherosclerostic laesies1. Om na te bootsen de atherosclerose-gevoelige status in kliniek, ApoE-deficiënte muizen, een reproduceerbare en handige bron van dieren waarm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81202526 tot J.X.), de National Natural Science Foundation of China (81302769 tot B.S.), de Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 tot B.S.), de Chinese postdoctorale Science Foundation (20110490325 tot J.X.), en de Ph.D. Programma's Stichting van het ministerie van onderwijs van China (20121106120031 tot B.S.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
17β-estradiol, >98%Sigma-AldrichE8875-250MGOestrogeen
Disposable syringes (with 25 G needles)Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd0.5*19TWLBHartbloeden
High-cholesterol mouse dietHuafukang Bio-TechnologyN/A1,25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging SystemVisualSonicsVevo®770Metingen van de intima-media dikte en hartfunctiestoornissen
2-Methyl-2-butanolSigma-Aldrich152463-250MLBereiding van avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mmKanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische gereedschappen
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische gereedschappen
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische gereedschappen
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische gereedschappen
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mmShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LtdR413Suture en ligatie van de weefsels
Nut cream (Nutella)FerreroN/AMedium voor perorale 17β-estradiol of PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifierDohegan Optical Company Inc.N/AAssistent bij het identificeren van weefsels tijdens ovariëctomie
Phosphate-buffered saline at pH 7.4SIGMAP3813Bereiding van 1 L zoutoplossing
Pro MultiLabel Microplate ReaderTecanInfinite M1000Bepaling van plasma TC en TG
PseudoprotodioscinShanghai Winherb Medical S & T DevelopmentW-0427CAS registernummer 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mLPfizer Pharma GmbH462986Postoperatieve analgesie na ovariëctomie
Sesame oilSigma-AldrichS3547-1LOplossen van 17β-estradiol of PPD
Solcoseryl Eye-GelMenarini, Solco Basle Ltd.Oogbescherming tijdens anesthesie
Stereo microscopeMCALONMCL-6STVAfbeelding van de intimale regio van de aorta
Table model high speed centrifugeSIGMA1-14KBereiding van plasma
Scissors, slight Curve (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische gereedschappen
Scissors, straight Flat (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische gereedschappen
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische gereedschappen
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische gereedschappen
TribromoethanolSigma-AldrichT48402-5GBereiding van avertin
Triglycerides (TG) assay kitInstitute of Nanjing Jiancheng Biology EngineeringA110-1Bepaling van plasma TG
Total cholesterols (TC) assay kitInstitute of Nanjing Jiancheng Biology EngineeringA111-1Bepaling van plasma TC

Referenties

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  2. Packard, B. L. Cardiovascular health and disease in women. The New England Journal of Medicine. 329 (4), 247-256 (1993).
  3. Samaan, S. A., Crawford, M. H. Estrogen and cardiovascular function after menopause. Journal of the American College of Cardiology. 26 (6), 1403-1410 (1995).
  4. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420 (6917), 868-874 (2002).
  5. Tremollieres, F. A., et al. Effect of hormone replacement therapy on age-related increase in carotid artery intima-media thickness in postmenopausal women. Atherosclerosis. 153 (1), 81-88 (2000).
  6. Bourassa, P. A., Milos, P. M., Gaynor, B. J., Breslow, J. L., Aiello, R. J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (3), 10022-10027 (1996).
  7. Squadrito, F., et al. Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovascular Research. 45 (2), 454-462 (2000).
  8. Wang, D., et al. Endothelial dysfunction and enhanced contractility in microvessels from ovariectomized rats: roles of oxidative stress and perivascular adipose tissue. Hypertension. 63 (5), 1063-1069 (2014).
  9. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous Hypercholesterolemia and Arterial Lesions in Mice Lacking Apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  10. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-Deficient Mice Develop Lesions of All Phases of Atherosclerosis Throughout the Arterial Tree. Arteriosclerosis and Thrombosis. 14 (1), 133-140 (1994).
  11. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. 64 (e4013), 1-4 (2012).
  12. Rossouw, J. E., et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women's Health Initiative randomized controlled trial. The Journal of the American Medical Association. 288 (3), 321-333 (2002).
  13. Kumle, M. Declining breast cancer incidence and decreased HRT use. Lancet. 372 (9639), 608-610 (2008).
  14. Jager, W., et al. A randomized comparison of triptorelin and tamoxifen as treatment of progressive ovarian cancer. Anticancer Research. 15 (6B), 2639-2642 (1995).
  15. Bhathena, S. J., Velasquez, M. T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 76 (6), 1191-1201 (2002).
  16. Wang, L., Qiu, X. M., Hao, Q., Li, D. J. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptor beta mediating nitric oxide production and NF-kappaB suppression in endothelial cells. Cell Death and Disease. 4 (e551), 1-13 (2013).
  17. Xiao, J., Wang, N. L., Sun, B., Cai, G. P. Estrogen receptor mediates the effects of pseudoprotodiocsin on adipogenesis in 3T3-L1 cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (1), C128-C138 (2010).
  18. Guivarc'h, E., et al. Predominant Role of Nuclear Versus Membrane Estrogen Receptor alpha in Arterial Protection: Implications for Estrogen Receptor alpha Modulation in Cardiovascular Prevention/Safety. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-17 (2018).
  19. Osako, M. K., et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification. Circulation Research. 107 (4), 466-475 (2010).
  20. Ivanova, A., et al. Screening of some saponins and phenolic components of Tribulus terrestris and Smilax excelsa as MDR modulators. In vivo. 23 (4), 545-550 (2009).
  21. Xiao, J., Zhu, T., Yin, Y. Z., Sun, B. Notoginsenoside R1, a unique constituent of Panax notoginseng, blinds proinflammatory monocytes to protect against cardiac hypertrophy in ApoE(-/-) mice. European Journal of Pharmacology. 833 (15), 441-450 (2018).
  22. Sun, B., Xiao, J., Sun, X. B., Wu, Y. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1758-1770 (2013).
  23. Adams, M. R., et al. Inhibition of coronary artery atherosclerosis by 17-beta estradiol in ovariectomized monkeys. Lack of an effect of added progesterone. Arteriosclerosis. 10 (6), 1051-1057 (1990).
  24. Keaney, J. F. Jr, et al. 17 beta-estradiol preserves endothelial vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic swine. Circulation. 89 (5), 2251-2259 (1994).
  25. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 14 (1), 133-140 (1994).
  26. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (5), R1531-R1539 (2001).
  27. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (3), 414-420 (2005).
  28. Pignoli, P., Tremoli, E., Poli, A., Oreste, P., Paoletti, R. Intimal plus medial thickness of the arterial wall: a direct measurement with ultrasound imaging. Circulation. 74 (6), 1399-1406 (1986).
  29. Hodgin, J. B., Maeda, N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 143 (12), 4495-4501 (2002).
  30. Bush, T. L., et al. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up Study. Circulation. 75 (6), 1102-1109 (1987).
  31. Marsh, M. M., Walker, V. R., Curtiss, L. K., Banka, C. L. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. Journal of Lipid Research. 40 (5), 893-900 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Bilaterale ovariectomieApoE knockoutmuizenperorale toedieninghazelnootpastaplasma lipidenanalyseechocardiografiebeoordeling van atherosclerotische laesiesfytoestroseenscreening
Een in vivo oestrogeen deficiëntie muis model voor het screenen van exogene oestrogeen behandelingen van cardiovasculaire disfunctie na de menopauze
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.