Deze methode biedt een kader voor het bestuderen van de opname van exogene vetzuren uit complexe gastheer bronnen in bacteriële membranen, met name Staphylococcus aureus. Om dit te bereiken, protocollen voor de verrijking van lipoproteïne deeltjes uit kip eierdooier en daaropvolgende vetzuur profilering van bacteriële fosfolipiden met behulp van massaspectrometrie worden beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Staphylococcus aureus en andere gram-positieve pathogenen bevatten vetzuren uit het milieu in membraan fosfolipiden. Tijdens infectie, de meerderheid van exogene vetzuren aanwezig zijn binnen gastheer lipoproteïne deeltjes. Onzekerheid blijft over de reservoirs van gastheer vetzuren en de mechanismen waarmee bacteriën vetzuren uit de lipoproteïne deeltjes halen. In dit werk beschrijven we protocollen voor de verrijking van low-density lipoproteïne (LDL) deeltjes uit kippen eierdooier en bepalen of ldls dienen als vetzuur reservoirs voor S. aureus. Deze methode exploiteert onbevooroordeelde lipidomische analyse en kip LDLs, een effectief en economisch model voor het onderzoek van interacties tussen LDLs en bacteriën. De analyse van S. aureus integratie van exogene vetzuren uit ldls wordt uitgevoerd met behulp van hoge-resolutie/nauwkeurige massaspectrometrie en tandem massaspectrometrie, waardoor de karakterisering van de vetzuur samenstelling van de bacteriële membraan en onbevooroordeelde identificatie van nieuwe combinaties van vetzuren die ontstaan in bacteriële membraan lipiden bij blootstelling aan LDLs. Deze geavanceerde massaspectrometrie technieken bieden een ongeëvenaard perspectief op de opname van vetzuren door het onthullen van de specifieke exogene vetzuren die in de fosfolipiden zijn opgenomen. De hier beschreven methoden zijn aanpasbaar aan de studie van andere bacteriële pathogenen en alternatieve bronnen van complexe vetzuren.
Inleiding
Methicillaire-resistente S. aureus (MRSA) is de belangrijkste oorzaak van de gezondheidszorg-geassocieerde infectie en de bijbehorende antibioticaresistentie is een aanzienlijke klinische uitdaging1,2,3. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën een hoge prioriteit. Een veelbelovende behandelingsstrategie voor gram-positieve pathogenen is remming van de vetzuur synthese, een vereiste voor membraan fosfolipide productie die, in S. aureus, omvat dunlaag GLYCEROL (PG), lysyl-PG, en cardiolipine4. Bij bacteriën, vetz....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: het volgende protocol voor de verrijking van LDL-deeltjes uit kippen eierdooier is afgeleid van Moussa et al. 200233.
1. bereiding van kippenei dooier voor verrijking van LDL-deeltjes
- Sanitize twee grote kippeneieren door de schelpen te wassen met 70% ethanol oplossing en laat drogen.
- Ontsmettings de Eier separator met behulp van 70% ethanol oplossing en laat de lucht drogen. Bevestig de Eier separator op de lip van een middelgroot bekerglas.
- Scheur elk ei afzonderlijk in de Eier separator en laat de albumine in het bekerglas stromen. De intacte eierdooier wordt door de separa....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het protocol voor de verrijking van LDL van kippenei dooier wordt geïllustreerd in Figuur 1. Dit proces begint met het verdunen van hele eidooier met een zoutoplossing en het scheiden van de eierdooiers die korrels worden genoemd uit de oplosbare of plasma fractie die de Ldl's bevat (Figuur 1)33. Het LDL-gehalte van de plasma fractie wordt verder verrijkt door precipitatie van de ~ 30-40 kDa β-livetinen (<.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
S. aureus bevat exogene vetzuren in zijn membraan fosfolipiden27,32,43. Fosfolipide synthese met behulp van exogene vetzuren omzeilt fasii remming, maar verandert ook de biofysische eigenschappen van het membraan27,32,44. Hoewel de opname van exogene vetzuren in fosfolipiden van gram-positieve pathogenen goed gedocumenteerd is,.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen informatie.
Dankbetuigingen
We danken de leden van het Hammer Laboratory voor hun kritische evaluatie van het manuscript en de ondersteuning van dit werk. Dr. Alex Horswill van de Universiteit van Colorado school of Medicine vriendelijk voorzien AH1263. Dr. Chris Waters Laboratory aan de Michigan State University verstrekt reagentia. Dit werk werd gesteund door de Amerikaanse hart vereniging Grant 16SDG30170026 en start-up fondsen voorzien door Michigan State University.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Ammonium sulfate | Fisher | BP212R-1 | ≥99.5% zuiver |
| Celkweekincubator | Thermo | MaxQ 6000 | |
| Centrifuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE |
| Costar-testplaat | Corning | 3788 | 96 putjes |
| Filterpapier | Schleicher & Schuell | 597 | |
| Groot kippenei | N/A | N/A | Gangbare winkelei |
| Microplate spectrofotometer | BioTek | Epoch 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus stam AH1263 | N/A | N/A | Verstrekt door Alex Horswill van de Universiteit van Colorado |
| Dialysebuis | Pierce | 68700 | 7.000 MWCO |
| Trypton | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| 0,5 mm zirkoniumoxide-kralen | Next Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24B | |
| Methanol (LC-MS kwaliteit) | Fisher | A4561 | |
| Chloroform (reagenskwaliteit) | Fisher | MCX10559 | |
| Isopropanol (LC-MS kwaliteit) | Fisher | A4611 | |
| Dimyristoyl fosfatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850345C-25mg | |
| Ammoniumbicarbonaat | Sigma | 9830 | ≥99,5% zuiver |
| Ammoniumformiaat | Sigma | 70221-25G-F | |
| Xcalibur-software | Thermo Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Velos-massaspectrometer | Thermo Scientific | hoge resolutie/nauwkeurige massa MS | |
| Agilent 1260 capillaire HPLC | Agilent | ||
| SpeedVac Vacuum Concentrators | Thermo Scientific |
Referenties
- Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
- Noskin, G. A., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
