Beoordeling van de cellulaire immuunrespons van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, met behulp van een In Vivo fagocytose Assay

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een in vivo fagocytose assay in volwassen Drosophila melanogaster te kwantificeren fagocytensysteem erkenning en goedkeuring van de microbiële infecties.

Samenvatting

Bij alle dieren biedt aangeboren immuniteit een onmiddellijke en robuuste verdediging tegen een breed spectrum aan pathogenen. Humorale en cellulaire immuunresponsen zijn de belangrijkste takken van aangeboren immuniteit, en veel van de regulering van deze reacties factoren evolutionair tussen ongewervelden en zoogdieren zijn bewaard. Fagocytose, de centrale component van cellulaire aangeboren immuniteit, wordt uitgevoerd door gespecialiseerde bloed cellen van het immuunsysteem. De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, heeft ontpopt als een krachtige genetisch model om de moleculaire mechanismen en de fysiologische effecten van fagocytose in hele dieren te onderzoeken. Hier laten we zien een in vivo fagocytose injectie gebaseerde bepaling om te kwantificeren van de particle opname en vernietiging door de cellen van het bloed van de Drosophila , hemocytes. De procedure kan onderzoekers te regelen het deeltje concentratie en dosis, waardoor het kan zeer reproduceerbare resultaten te verkrijgen in een korte hoeveelheid tijd precies. Het experiment is kwantitatieve, gemakkelijk uit te voeren, en kunnen worden toegepast om te screenen op gastheer factoren die invloed pathogen erkenning, opname en goedkeuring.

Inleiding

Aangeboren immuun afweer vormen de eerste lijn van verdediging tegen pathogene microben. Deze reacties kunnen functioneel worden onderverdeeld in humorale en cellulaire aangeboren immuniteit, die beide worden gemedieerd door germline-gecodeerde patroon erkenning receptoren (PRRs) die zin pathogen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs)¹. Veel van de signaalroutes en effector mechanismen van aangeboren immuniteit zijn bewaard in zoogdieren en ongewervelden, zoals de nematode, Caenorhabditis elegans, en de fruitvlieg, Drosophila melanogaster². De fruitvlieg heeft ontpopt als een krachtig systeem te bes....

Protocol

1. Prepareer fluoresceïne deeltjes injectie

1. Reconstrueren van 10 mg van verkrijgbare, warmte-gedood bacteriën deeltjes aangeduid met fluoresceïne (Zie Tabel van materialen) tot een voorraad concentratie van 10 mg/mL door 990 µL steriele 1 x PBS en 10 µL 50 mM natriumazide toe te voegen. Vortex te mengen.
   1. Verdelen in eenmalig gebruik 8 µL aliquots in 0,2 mL buizen en bewaar in een donkere kast bij 4 ° C tot het minimaliseren van de bijbehorende lichtgevoeligheid.
      Opmerking: Natriumazide conserveermiddel is optioneel en kan worden weggelaten als 10 mg/mL voorraden zijn gemaakt met 1 mL steriele 1 x PBS, aliquoted, en opgeslagen bij-....

Resultaten

Een schematische voorstelling van de bepaling van de in vivo fagocytose met behulp van fluoresce¨ une-geëtiketteerden deeltjes wordt weergegeven in figuur 1A. Vliegen zijn gemonteerd ventrale zijde naar beneden op een stuk van elektrische tape en de eerste twee segmenten van de buik, waar het dorsale schip zich bevindt, is duidelijk zichtbaar (figuur 1B). Belangrijke bronnen van experimentele fout ontstaan op de injectie en de be.......

Discussie

Verkrijgbare, fluorescently geëtiketteerde deeltjes worden gebruikt voor het beoordelen van fagocytose in het algemeen (0,2 µm carboxylaat gemodificeerde microbolletjes) of fagocytose van microben (fluorescently-geëtiketteerden warmte - of chemisch gedode bacteriën of gist). Om te beoordelen phagosome rijping, kunnen onderzoekers selecteren deeltjes aangeduid met een pH-gevoelige kleurstof die fluoresceert als pH van neutrale tot zure, zoals in de phagolysosome afneemt. U kunt ook te onderzoeken van de eerst.......

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescent gelabelde latexkralen om de algemene fagocytische capaciteit van fagocyten te testen. (~580/~605 nm) Injecteer een 1:20 verdunning in PBS met 5% kleurstof.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Houder voor 1,0 mm pipet
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Gedode E. coli gelabeld met Alexa Fluor 488. Gebruik om de herkenning en opname van gram-negatieve bacteriën door fagocyten te testen. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Gedode E. coli gelabeld met Alexa Fluor 594. Gebruik om de herkenning en opname van gram-negatieve bacteriën door fagocyten te testen. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Gedode E. coli gelabeld met FITC (Fluoresceïne). Gebruik om de herkenning en opname van gram-negatieve bacteriën door fagocyten te testen. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Gedode E. coli gelabeld met Texas Red. Gebruik om de herkenning en opname van gram-negatieve bacteriën door fagocyten te testen. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Gedode E. coli gelabeld met Texas Red. Gebruik om de herkenning en opname van gram-negatieve bacteriën door fagocyten te testen. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Gedode E. coli gelabeld met pHrodo Red. Gebruik om de herkenning, opname en fagosoombeschikking van gram-negatieve bacteriën door fagocyten te testen. (~560/~585 nm). Het is niet nodig om te doven met Trypan Blauw.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Gedode S. aureus gelabeld met pHrodo Red. Gebruik om de herkenning, opname en fagosoombeschikking van gram-positieve bacteriën door fagocyten te testen. (~560/~585 nm). Het is niet nodig om te doven met Trypan Blauw.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	De World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 gebruikt differentiële druk om vloeistof in de glazen naald tussen injecties vast te houden. De gebruiker bedient handmatig korte gasdrukpulsen om de vloeistof uit te drijven – waardoor levering van sub-nanoliter volumes mogelijk is. De hoeveelheid geleverde vloeistof hangt af van twee hoofdvariabelen – de grootte van de opening van de glazen naald en de tijd dat injectiedruk wordt toegepast. stel het instrument in op 100 ms “TIMED” modus.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Gedode S. aureus gelabeld met Alexa Fluor 488. Gebruik om de herkenning en opname van gram-positieve bacteriën door fagocyten te testen. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Gedode S. aureus gelabeld met Alexa Fluor 594. Gebruik om de herkenning en opname van gram-positieve bacteriën door fagocyten te testen. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Gedode S. aureus gelabeld met FITC (Fluoresceïne). Gebruik om de herkenning en opname van gram-positieve bacteriën door fagocyten te testen. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Naalden voor injectie. OD = 1,0 mm
Trypan Blue Solution (0,4%)	Sigma	T8154	Gebruikt om extracellulaire fluorescentie van Fluorescein, Alexa Fluor of Texas Red gelabelde deeltjes te doven.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Omgekeerde fluorescentiemicroscoop voor het beeldvormen van vliegen. Gebruik een digitale camera (bijv.: AxioCam HC camera) en de bijbehorende software (bijv.: AxioVision 4.7 software) om foto's te maken.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Gedode gelabeld met Alexa Fluor 488. Gebruik om de herkenning en opname van gist door fagocyten te testen. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Gedode gelabeld met Alexa Fluor 594. Gebruik om de herkenning en opname van gist door fagocyten te testen. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Gedode gelabeld met FITC (Fluoresceïne). Gebruik om de herkenning en opname van gist door fagocyten te testen. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Gedode gelabeld met Texas Red. Gebru