Kwantificering van prolifererende humane antigeen-specifieke CD4+ T-cellen met behulp van Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Summary

Gepresenteerd hier is een protocol voor het meten van prolifererende CD4⁺ T cellen in reactie op antigene eiwitten of peptiden met behulp van kleurstof verdunning. Deze bepaling is bijzonder gevoelig voor zeldzame antigeen-specifieke T-cellen en kan worden gewijzigd om het klonen van antigeen-specifieke cellen te vergemakkelijken.

Abstract

Beschreven is een eenvoudige, in vitro, kleurstof verdunnings methode voor het meten van antigeen-specifieke CD4⁺ T celproliferatie in menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs). De ontwikkeling van stabiele, niet-toxische, fluorescerende kleurstoffen zoals carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE) maakt het mogelijk zeldzame, antigeen-specifieke T-cellen te onderscheiden van omstanders door vermindering in fluorescerende kleuring, zoals gedetecteerd door flow cytometrie. Deze methode heeft de volgende voordelen ten opzichte van alternatieve benaderingen: (i) het is zeer gevoelig voor laagfrequente T-cellen, (II) geen kennis van het antigeen of epitoop is vereist, III) het fenotype van de reagerende cellen kan worden geanalyseerd en (IV) levensvatbaar, cellen kunnen worden gesorteerd en gebruikt voor verdere analyse, zoals T-cellen klonen.

Introduction

De mogelijkheid om antigeen-specifieke T-cellen te detecteren en te bestuderen is belangrijk in onderzoeken naar door cellen gemedieerde immuniteit. Echter, dit is vooral een uitdaging voor autoantigen-specifieke CD4⁺ T-cel reacties, die zeer zwak en moeilijk te detecteren zijn. Een veelgebruikte methode voor de detectie van antigeen-specifieke lymfocyten proliferatie is [3H]-thymidine, een van nucleotide dat is opgenomen in het DNA van prolifererende cellen. Hoewel de [3H]-thymidine-test DNA-synthese kan detecteren, is deze methode een indirecte maatstaf voor celdeling, omdat DNA-synthese onafhankelijk van mitose kan starten (d.w.z. tijdens genduplicatie en apoptosis¹). Dit probleem wordt verergerd door het feit dat antigeen-specifieke proliferatie van cellen kan resulteren in aanzienlijke apoptosis², wat leidt tot een mogelijke overschatting van antigeen-specifieke proliferatie. Bovendien levert de methode [3H]-thymidine geen fenotypische informatie voor prolifererende lymfocyten, zoals CD4⁺ of CD8⁺ Lineage proliferatie in PBMCs, gestimuleerd met antigene peptiden.

In 2003 publiceerden we de eerste kleurstof verdunnings test met behulp van CFSE, genaamd de op CFSE gebaseerde proliferatie test^3,4. CFSE is een fluorescerende kleurstof die stabiel bindt aan intracellulaire eiwitten door een covalente binding te vormen aan intracellulaire lysine residuen. Aangezien CFSE-gelabelde eiwitten gelijkelijk worden verdeeld onder dochtercellen³, kunnen cellen die zijn onderverdeeld worden onderscheiden van onverdeelde cellen door Flowcytometrie, wat ook de kwantitatieve fenotypering van lymfocyten populaties mogelijk maakt. Het aantal divisies dat een cel heeft ondergaan vanaf de tijd van de CFSE-kleuring kan worden gemeten tot op zekere hoogte⁵. Meer recentelijk zijn veel vergelijkbare kleurstoffen ontwikkeld, zoals CellTrace Violet proliferatie Dye (VPD) en CytoTrack Dye, die op dezelfde manier werken⁶. Dit protocol richt zich op CFSE, maar de principes gelden evenzeer voor andere verwante kleurstoffen.

Peptide-MHC tetrameer kleuring is een veelgebruikte methode voor het opsporen en klonen van antigeen-specifieke CD8⁺ T-cellen. Dit is een goed opgezette methode^7,8,9,10; het klonen op basis van tetrameer vereist echter bestaande kennis van de epitoop/MHC-beperking en elke epitoop vereist zijn eigen tetrameer¹¹, die de reikwijdte van ontdekking en klonen van nieuwe epitoop-specifieke T-cellen beperkt. De op CFSE gebaseerde proliferatie kan worden gebruikt met peptiden, eiwitten of cellysaten. Het hier beschreven protocol is zowel eenvoudig als robuust, en de respons CD4⁺ T-cellen kunnen worden gesorteerd voor gebruik in downstream functionele en Biochemische karakterisering van de assays^12,13.

Protocol

Alle proefpersonen gaven geïnformeerde toestemming voorafgaand aan het verzamelen van perifeer bloed. Ethische goedkeuring voor experimenten met behulp van PBMC werd gegeven door St. Vincent's hosptial (HREC-A 135/08, en HREC-A 161/15).

1. bereiding van het reagens

1. Human T Cell media
   1. Bereid RP-5-media voor op kweek PBMC, dat bestaat uit rpmi 1640, 1x niet-essentiële aminozuren, l-alanyl-L-glutamine dipeptide (2 mm), penicillair (100 U/ml)/streptomycine (0,1 mg/ml) en 5% gepoolde humane serum (PHS).
2. CFSE stockoplossingen
   1. Bereid een Master Stock door het oplossen van 25 mg CFSE in ~ 9 mL DMSO om een uiteindelijke stamoplossing met een concentratie van 5 mM te bereiken.
   2. Maak een werk kolf door de Master Stock in PBS te verdunen om een werkconcentratie van 10 μM te bereiken.

2. bereiding van humane PBMCs uit volbloed

1. Er zijn over het algemeen tussen 0,5 – 1,5 x 10⁶ PBMCs/ml menselijk perifeer bloed. Daarom is de vereiste hoeveelheid bloed afhankelijk van het gewenste aantal PBMCs. verdund menselijk perifeer bloed met PBS ten minste 1:2. Scheid de PBMCs door 15 mL dichtheidsgradiënt toe te voegen aan een buis van 50 mL en vervolgens 35 mL verdund volbloed te bedekken.
2. Centrifugeer bij 850 x g gedurende 15 minuten zonder vertraging bij kamertemperatuur (RT). Dit zal resulteren in drie duidelijke lagen: de onderste laag met de rode bloedcel pellet, middelste laag van dichtheidsgradiënt medium met witte bloedcellen die de bovenste interface en de bovenste plasma laag¹⁴bekleden.
3. Verwijder ongeveer 20 mL van de bovenste plasmaslaag. Verzamel de witte bloedcel laag, voorzichtig om te voorkomen dat de rode bloedcel pellet. Was 3x met PBS en Tel levensvatbare cellen met behulp van trypan blauwe uitsluiting op een hemocytometer. Verdun tot 1 x 10⁶ PBMCs/ml in PBS.
4. Niet-CFSE-gekleurde cellen
   1. Deze cellen worden gebruikt als compensatie controles voor Flowcytometrie, bestaande uit niet-bevlekt en CD4⁺ enkelvoudig-gekleurd cellen. Voeg 300 μL van elk controlemonster PBMC suspensie toe aan een tube van 10 mL, top met PBS, en centrifugeer bij 550 x g gedurende 5 minuten bij RT.
   2. Respendeer 1 x 10⁶ cellen/ml in RP-5 media. Incuberen deze niet-gelabelde cellen gedurende 7 dagen in een incubator van 37 °C/5% CO₂ met de CFSE-gelabelde cellen (stap 2.6.1).
5. CFSE-gekleurd cellen
   1. Breng de cellen van stap 2,3 over in een buis van 50 mL. Voeg 1,0 μL CFSE-werkvoorraad oplossing (10 μM) toe per 1 mL celsuspensie aan de zijkant van de buis. Meng snel door de buis meerdere malen te inverteren. De uiteindelijke concentratie van CFSE is 10 nM.
   2. Incuberen gedurende 5 min in een incubator van 37 °C/5% CO₂ . Om de kleuring te stoppen, voeg 5 mL RP-5 media toe, pellet de cellen door te centrifugeren gedurende 5 min bij 550 x g. Respendeer de PBMCs op 1 x 10⁶/ml in de RP-5 media.
   3. Voeg 1,0 mL celsuspensie toe aan een tube van 10 mL. Gebruik één buis voor elk antigeen dat moet worden getest.
6. Antigene Stimulatie van menselijke PBMCs en celcultuur
   1. Cultuur humane CFSE-gelabelde PBMCs met antigenen in RP-5 media gedurende 7 dagen in een incubator van 37 °C/5% CO₂ . Cultuur 1 x 10⁵ cellen/goed (100 μL) in een 96-put met 100 μL/goed van RP-5-media met verdund antigeen.
      Opmerking: de gebruikte antigenen, inclusief werk concentraties, worden samengevat in tabel 1.

3. anti-CD4 kleuring voor FACS analyse

1. Pipetteer 200 μL van de gekweekte cellen in FACS buizen, was de cellen 1x in 1,0 mL PBS met 0,1% FCS, en Centrifugeer gedurende 5 min bij 550 x g.
2. Vlek met anti-humane CD4 Alexa Fluor 647 (0,25 mg/mL) in 100 μL PBS/0,1% FCS. Houd een monster van cellen met een CFSE-label buiten beschouwing, onbevlekt met andere fluor Foren, om te gebruiken voor het instellen van de FACS CFSE-compensatie. Inincuberen de cellen op 4 °C beschermd tegen licht gedurende 20 minuten.
3. Was de cellen door 1 mL PBS/0,1% FCS toe te voegen, centrifugeer bij 550 x g gedurende 5 minuten bij RT en respendeer in 100 μL PBS/0,1% FCS. Voeg onmiddellijk vóór de analyse van de FACS 1 μL propidium jodide (PI, 0,1 mg/mL) toe aan alle buisjes, zodat de dode cellen kunnen worden uitgesloten door Flowcytometrie.

4. Flow cytometrische configuratie en gating strategie

Opmerking: Afbeelding 1 toont de FACS-configuratie, inclusief compensatie controles en gating-strategie.

1. Gate de forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC) (Figuur 1a) populatie om alle lymfocyten omvatten.
2. De populatie van de FSC versus PI (Figuur 1b) op Pi-negatieve cellen om apoptotische cellen uit te sluiten.
3. Gebruik ongekleurde cellen om een spannings basislijn in te stellen voor niet-fluorescerende cellen. Stel de spanningen voor de CD4-A647 en de CFSE zodanig in dat het fluorescentie signaal voor elk (figuur 1c) onder de 1.000 ligt. Gebruik de enkele kleurregelaars CFSE (figuur 1d) en CD4-A647 (Figuur 1e) om positieve fluorescentie signalen (~ 10.000) voor elke kleur te bevestigen met behulp van de voltages ingesteld met Onbevlekte cellen.
4. CFSE en PI hebben een aantal spectrale overlap; Pas de compensatie aan om PI-Fluoresentie van CFSE-Fluoresentie af te trekken totdat het alleen-CFSE-monster geen signaal oplevert in het PI-kanaal.
   Opmerking: Deze poorten werden toegepast op alle hierin geanalyseerde monsters.

5. berekening van de Celdelings index om de antigeen-specifieke CD4⁺ T-celproliferatie te inventariseren

Opmerking: Cell Division index (CDI) verwijst naar het aantal verdeelde cellen (CD4⁺/CFSE^dim) per 5.000 ONVERDEELDE cellen (CD4⁺/CFSE^Bright). Wanneer het aantal niet-verdeelde CD4⁺ -cellen niet exact 5.000 is, wordt het aantal verdeelde cellen gecorrigeerd om het aantal verdeelde cellen per 5.000 onverdeelde cellen uit te drukken. Bijvoorbeeld, met behulp van de tetanus toxoid-specifieke proliferatie (figuur 2D), er waren 4.930 onverdeelde cellen (CFSE^bright) en 3.268 verdeelde cellen (CFSE^Dim); Daarom is het gecorrigeerde aantal verdeelde cellen (5000/4930) x 3.268 = 3.304,3.

1. Bereken het CDI (tabel 1) door het aantal verdeelde cellen/5000 onverdeelde cellen van de antigeen-gestimuleerde groep te delen door het gemiddelde aantal verdeelde cellen (per 5.000 onverdeelde cellen) uit de cellen gekweekt zonder antigeen (tabel 2).

Results

In vitro stimulatie van humane PBMCs met tetanus toxoïde proteïne: PBMCs werden gekleurd met CFSE en werden gedurende 7 dagen gestimuleerd in de aanwezigheid van tetanutoxoïde. Bijna alle donoren toonden een sterke T-cel respons op tetanutoxoïde omdat ze waren gevaccineerd, waardoor tetanus tetanustoxoïd een nuttige positieve controle antigeen. Figuur 2 toont in drievis, dat de proliferatie van de CFSE van CD4⁺ T cellen van ongestimuleerde PBMCs mi...

Discussion

Proliferatie op basis van CFSE is een eenvoudige en robuuste methode voor het opsporen en inventariseren van antigeen-specifieke humane CD4⁺ T-cellen. Het is al eerder aangetoond dat het gebruik van de optimale concentratie van CFSE essentieel is voor optimale resultaten⁴. Te veel CFSE abrogates proliferatie, terwijl te weinig staat niet toe dat verdeelde en onverdeelde cellen te onderscheiden. Daarentegen worden relatief hoge concentraties (5,0 μM) van CFSE gebruikt om gezuiverde Murin...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1	Sino Biological	40010-V07E
Non-essential amino acids (1x)	Gibco	11140
Penicillin/Streptomycin (1x)	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Pooled human serum	Australian Red Cross	N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom made synthetic peptide
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Tetanus Toxoid protein	Statens Serum Intitut	N/A