Methodenartikel

Voorbereiding van neutraal geladen, pH-responsieve polymere nanodeeltjes voor cytosolische siRNA levering

DOI:

10.3791/59549

⸱

2 mei 2019

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi, 3Biomedical Engineering Program, University of Mississippi

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Methoden ter voorbereiding en karakterisering van de fysisch-chemische eigenschappen en bioactiviteit van neutraal geladen, pH-responsieve siRNA nanodeeltjes worden gepresenteerd. De criteria voor succesvolle siRNA nanomedicines zoals grootte, morfologie, oppervlaktelast, siRNA lading, en gen het silencing worden besproken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het succes van siRNA als een gerichte moleculaire geneeskunde is afhankelijk van zijn efficiënte cytosolische levering aan cellen binnen het weefsel van pathologie. Klinisch succes voor de behandeling van eerder ' undruggable ' leverziekte doelen met siRNA is bereikt. Nochtans, vergt de efficiënte levering van de tumor siRNA extra farmacokinetische ontwerpoverwegingen, met inbegrip van lange omlooptijd, ontwijking van ontruimings organen (b.v., lever en nieren), en tumor penetratie en behoud. Hier beschrijven we de voorbereiding en in vitro fysisch-chemische/biologische karakterisering van polymere nanodeeltjes ontworpen voor een efficiënte siRNA levering, met name voor niet-lever weefsels zoals tumoren. De siRNA nanodeeltjes worden bereid door elektrostatische teint van siRNA en de diblok copolymeer poly (ethyleenglycol-b-[2-(Dimethylamino) ethyl methylmethacrylaat-co-butyl METHYLMETHACRYLAAT]) (peg-DB) om poly-complexen te vormen ( polyplexes) waar siRNA is afgezonderd binnen de polyplex kern en PEG vormt een hydrofiele, neutraal geladen Corona. Bovendien, de DB blok wordt membraan-lytische als blaasjes van de endolysosomal pathway breng (< pH 6,8), triggering endosomale ontsnappen en cytosolische levering van siRNA. De methodes om de fysisch-chemische kenmerken van siRNA nanodeeltjes zoals grootte, oppervlaktelast, deeltjes morfologie, en siRNA lading te kenmerken worden beschreven. Bioactiviteit van siRNA nanodeeltjes wordt gemeten met behulp van Luciferase als een model gen in een snelle en high-throughput gen silencing assay. Ontwerpen die deze eerste tests passeren (zoals PEG-DB-gebaseerde polyplexes) worden geschikt geacht voor de vertaling van preklinische dierstudies de beoordeling van de levering van siRNA aan tumoren of andere sites van pathologie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omdat siRNAs de vertaling van eiwitten uit mRNA sequenties remt, kunnen ze theoretisch gebruikt worden voor alle bekende pathologieën1,2,3,4,5. Echter, het gebruik van siRNA in de geneeskunde wordt beperkt door de ruim slechte farmacokinetische profiel van siRNA moleculen6,7. Wanneer intraveneus geïnjecteerd, siRNAs worden snel gewist door de nieren en/of afgebroken door nucleasen8,9. Door zijn grote omvang en negatieve lading kan siRNA geen cellen binnengaan of ontsnappen aan de endolysosomal route om toegang te krijgen tot het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC) dat zich bevindt in de cytosol10,11,12, 13. Zo heeft uitgebreide inspanning gericht op het ontwerp en de uitvoering van siRNA Delivery Strategies14. Deze inspanning heeft zich grotendeels gericht op de ontwikkeling van lipiden-en polymeer-gebaseerde nanodeeltjes die pakket siRNA, te beschermen tegen ontruiming en degradatie in vivo, en initiëren cellulaire opname en endosomale ontsnappen door ioniserende, kationische amine groepen. Veel pre-klinische successen zijn gemeld en meest recentelijk, de eerste klinische succes is gemeld voor nanodeeltjes op basis van lever siRNA levering aan erfelijke transthyretine-gemedieerde (hATTR) Amyloïdose15te behandelen.

Er zijn vele kanker-veroorzakende genen die momenteel "undruggable" door conventionele farmacologie (d.w.z., kleine molecule drugs) zijn, motiverend het ontwerp van polymere siRNA nanodeeltjes (si-NPs) om kanker16te behandelen. Er zijn echter een aparte set van design parameters die moeten worden overwogen voor niet-lever siRNA levering. Het leveringssysteem moet de kationische last van polyplex beschermen die samenstelling binnen de systemische omloop17,18,19veroorzaakt. Voor de levering van tumoren, in het bijzonder, si-NP stabiliteit is essentieel voor een lange circulatie te begiftigen en dus een verhoogde accumulatie binnen tumoren via de verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) effect20,21. Bovendien, controle over si-NP grootte is essentieel, aangezien alleen nanodeeltjes ongeveer 20-200 nm diameter in grootte hefboom EPR22, en kleinere si-NPs (~ 20-50 nm diameter) vertonen verbeterde tumor penetratie over grotere grootte nanodeeltjes en microparticles23.

Om deze extra ontwerp beperkingen aan te pakken voor systemische tumor levering van siRNA na intraveneuze toediening, neutraal geladen, pH-responsieve si-NPs zijn ontwikkeld (Figuur 1)24. Deze si-NPs zijn PEGylated, of recentst, Zwitterionated25, voor neutrale oppervlaktelast en weerstand tegen eiwit adsorptie en opsonization in omloop. Aangezien zij zich niet uitsluitend op kationische karakter kunnen baseren om intracellulaire levering te drijven, is de uiterst efficiënte endosomale vlucht noodzakelijk voor het bereiken van het krachtige gen silencing. Dienovereenkomstig, de kern van deze si-NPs is samengesteld uit een zeer endosomolytic kern die inert is op extracellulaire pH (7,4), maar die wordt geactiveerd in een switch-achtige wijze in de aangezuurde voorwaarden van de endolysosomal pathway [pH 6,8 (vroege endosomes) – 5,0 ( lysosomen)]. Ten slotte, een mengsel van kationische en hydrofobe inhoud binnen de kern van Si-NPs bieden zowel elektrostatische en van der Waals stabilisatie krachten, verbetering van de stabiliteit van de si-NPs in het bloed in vergelijking met louter kationische systemen.

De integratie van vele functies in een relatief eenvoudig ontwerp is mogelijk met behulp van omkeerbare toevoeging-fragmentatie Chain Transfer (RAFT) gecontroleerde polymerisatie om polymeren te produceren met complexe architectuur en nauwkeurige samenstelling. Om si-NPs met neutrale oppervlaktelast, pH-ontvankelijkheid, en NP stabiliteit te produceren, wordt het vlot gebruikt om poly (ethyleenglycol-b-[2-(Dimethylamino) ethyl methylmethacrylaat-co-butyl METHYLMETHACRYLAAT]) (peg-DB te synthetiseren; Figuur 1a). PEG-DB is elektrostatisch gecomplexeerd met siRNA, het vormen van Si-NPs met een PEG Corona en DB/siRNA core (Figuur 1b). PEG vormt een inerte, neutraal geladen hydrofiele laag op de si-NP Corona. Het DB blok bestaat uit een 50:50 Molar ratio van 2-(Dimethylamino) ethyl methylmethacrylaat (DMAEMA) en butyl methylmethacrylaat (BMA). Kationische DMAEMA elektrostatisch complexen negatief-geladen siRNA. BMA Self-Associates binnen de NP core door van der Waals interacties, toenemende NP stabiliteit. Samen, DMAEMA en BMA geven pH-afhankelijke lipide bilayer-lytische gedrag aan de DB polymeer blok. Op extracellulaire pH, de DB blok is afgezonderd aan de si-NP kern en is inert voor lipide bilayers. Onder zure omstandigheden, zoals die binnen de endolysosomal pathway, ioniseer DMAEMA binnen de DB blok vergemakkelijkt de Proton spons effect, waar endosomale buffering leidt tot osmotische zwelling en scheuren26. Daarnaast hydrofobe BMA delen binnen de DB blok actief te integreren in en lyse lipide bilayers, wat resulteert in krachtige endosomolysis. Aldus, is siRNA complex met PEG-DB om si-NPs te vormen die neutraal-geladen en hoogst stabiel bij extracellulaire pH zijn maar die lipide bilayers bij zure pH verstoren, verzekerend cytosolische levering van de siRNA lading.

Hierin worden beschreven de experimentele procedures voor de productie van Si-NPs van PEG-DB. Methoden om de fysisch-chemische parameters en bioactiviteit van Si-NPs te karakteriseren worden gepresenteerd en besproken. Om snel te beoordelen si-NP bioactiviteit, Luciferase wordt gebruikt als een model gen voor knock-out studies. Firefly Luciferase is het eiwit dat verantwoordelijk is voor de ' Glow ' van vuurvliegjes27. Dienovereenkomstig, zoogdiercellen transfected met de Firefly Luciferase gen produceren een bioluminescent ' Glow ' die kunnen worden gevangen met behulp van een luminometer om het niveau van Luciferase expressie te kwantificeren. Hier gebruiken we Luciferase om de bioactiviteit van Si-NPs te beoordelen door het leveren van siRNA tegen Luciferase en het kwantificeren van de overeenkomstige reductie in bioluminescentie in Luciferase cellen vergeleken met cellen die een scrambled siRNA ontvangen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding en karakterisering van Si-NPs

  1. si-NP voorbereiding
    1. Los polymeer in 10 mM citroenzuur buffer (pH 4,0) op 3,33 mg/mL. Polymeer kan eerst worden opgelost op 10x concentratie in ethanol om de ontbinding te garanderen.
      Opmerking: polymeer kan worden opgelost bij lagere concentraties, maar het gebruik bij concentraties boven 3,33 mg/mL kan homogene NP-vorming voorkomen.
    2. Voeg siRNA (50 μM in diH2O) toe om te resulteren in N+:P- ratio van 10. Meng polymeer-en siRNA oplossingen grondig door pipetten en laat incuberen gedurende 30 minuten. De N+:P- ratio vertegenwoordigt het aantal positief geladen amine-groepen op het polymeer tot het aantal negatief geladen fosfaatgroepen op de siRNA en wordt berekend volgens de onderstaande formule:
      figure-protocol-1
      waar, mol Pol is de maal hoeveelheid polymeer, RU amine is het aantal herhalende eenheden van positief geladen aminen per polymeer, mol siRNA is de maal hoeveelheid siRNA, en BP siRNA is het aantal basisparen per siRNA molecuul.
    3. Voeg een 5-voudige overmaat van 10 mM fosfaatbuffer (pH 8,0) toe en meng voorzichtig door de buis te pipetteren of te omkeren. Om te bevestigen dat de uiteindelijke pH neutraal is (~ 7.2-7,5), Pipetteer 10 l van Si-NP-oplossing op pH-teststrips.
      Opmerking: citroenzuur en fosfaat buffers worden bereid volgens de Millipore Sigma buffer Reference Center Charts.
  2. Fysisch-chemische karakterisering van Si-NPs
  3. Noteer de grootte en het oppervlak van de resulterende si-NPs met Dynamische lichtverstrooiing (DISTRIBUTIELIJSTEN). Bereid een voorbeeld van DISTRIBUTIELIJSTEN voor door 1 mL si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) te filteren tot en met 0,45 μm-filters voor porie-grootte in een vierkante kwarts-of polystyreen Cuvette. Record grootte en oppervlakte heffing metingen met behulp van een DL-instrument volgens de specificaties van de fabrikant.
    1. Bevestig de grootte en de morfologie van Si-NPs door Imaging-analyse met behulp van Transmission Electron microscopie (TEM).
      1. Voeg 5 l van Si-NP-oplossing toe op 1 mg/mL tot TEM-rasters en incubeer voor 60 s. dep droog voor 3 s.
      2. Voeg 5 l van 3% uranyl acetaat oplossing toe en incubeer voor 20 s. dep droog voor 3 s. droge roosters 's nachts onder uitdroging.
      3. Beeld rasters volgens het protocol dat is vastgesteld voor de specifieke Microscoop die moet worden gebruikt.
    2. Karakteriseren de lading van siRNA in si-NPs bij diverse N+:P- verhoudingen gebruikend agarose gel vertraging.
      1. Om 2% agarose gel te veroorzaken, voeg 2 g van elektroforese rang agarose poeder aan 100 mL van 1x TAE (tris-acetate-EDTA) buffer bij pH 8,0 toe. Beweeg om agarose op te schorten. Hitte die in microgolf wordt blootgelegd tot al agarose wordt opgelost (1-3 min).
      2. Eenmaal gekoeld, voeg 5 l van ethidium bromide (10 mg/mL in H2O), en meng goed. Giet agarose in een gel lade en plaats kam om putten te produceren, laten drogen voor 30 min. zorgvuldig verwijderen kam te verlaten achter het laden van putten, en vul de gel lade om de Max te vullen lijn met 1x TAE buffer.
      3. Genereer si-NPs (volgens de bovenstaande procedure) op 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20 en 40 N+:P- ratio's. Plaats 2 l hoeveelheid ladings kleurstof (geen SDS en verminderende agenten) op paraffine film voor elke si-NP formulering. Meng 10 l van Si-NP oplossing met beladings vloeistof op paraffine folie door pipet.
      4. Voeg si-NP/loading Dye oplossingen toe aan agarose gel Wells. Looppas voltagebron bij 100 V voor 35 min (of tot de steekproeven 80% van gel lengte hebben doorkruist).
      5. Visualiseer siRNA bands op een UV-transilluminator volgens de specificaties van de fabrikant.

2. bepaling van de in vitro bioactiviteit van Si-NPs

  1. Knock-out van het model Gene Luciferase
    1. Genereer Luciferase si-NPs (volgens de bovenstaande procedure) met behulp van Luciferase siRNA en scrambled si-NPs met behulp van een scrambled siRNA sequentie als een controle. Formualte beide si-NPs op dezelfde laatste N+:P- ratio en op de optimale ratio geïdentificeerd door agarose gel retardatie studies. Voorbeeld siRNA sequenties zijn opgenomen in de tabel van materialen.
    2. Zaad Luciferase-uitdrukken van cellen [MDA-MB-231/Luciferase (BSD) stabiele cellen] in 96-goed zwart-ommuurde platen op een dichtheid van 2.000 cellen per put. Laat zich 's nachts in volle media (DMEM, 10% FBS) in een incubator (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid).
    3. Verdun si-NPs in volledige serum media voor een definitief volume van 100 l per put en siRNA concentratie van 100 nM. Behandel de cellen voor 24 uur met si-NPs.
    4. Verwijder na 24 uur behandelingen en vervang media met volledige serum media met 150 μg/mL D-Luciferin. Incubeer cellen voor 5 min voor het meten van luminescentie op een plaat lezer of in vivo optisch beeldsysteem volgens de specificaties van de fabrikant.
    5. Vervang luciferin-bevattende media met verse, volledige serum media, en incubeer 24 h meer. Herhaal de bovenstaande stap, het verwijderen van media en het vervangen met volledige serum media met 150 μg/mL D-Luciferin, gevolgd door een 5 min incubatie voorafgaand aan het meten van luminescentie op de 48 h timepoint.
    6. Voor longitudinale studies, handhaaf cellen onder steriele omstandigheden terwijl het meten van luminescentie. Doorgaan met de cultuur in verse, volledige media tussen metingen na vervanging van luciferin-bevattende.
      Nota: de aangewezen siRNA concentratie zal met verschillende si-NPs en siRNA molecules variëren. Bij gebruik van neutraal geladen polyplexes met een endosomolytic kern (bijv. PEG-DB), 100 nM wordt meestal goed verdragen door de cellen en produceert > 75% Luciferase knock-out. De massa ratio van PEG-DB te siRNA op 10 N+:P- ratio en 100 nm siRNA behandelingen (uitgaande van 26 bp siRNA) is 23,3, dat wil zeggen, voeg 23,3 ng van Peg-DB voor elke 1,0 ng van siRNA. Bijvoorbeeld, voeg 1,16 l van 3,33 mg/mL polymeer voor 166,5 ng van siRNA om een goed te behandelen op 100 nM in een 96-well plaat (100 mL media volume per well).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enkele essentiële kenmerken van effectieve si-NPs voor in vivo siRNA levering zijn de juiste grootte (~ 20-200 nm diameter), siRNA verpakking, en Gene silencing bioactiviteit. Hoewel dit niet een uitputtende lijst (zoals besproken in de discussie), moeten deze fundamentele kenmerken worden bevestigd voordat overweegt verder testen van een formulering.

Figuur 2 illustreert de karakterisering van Si-N...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De si-NPs hier beschreven worden gevormd door elektrostatische vereniging van anionische siRNA en kationische polymeren in polyion complexen (polyplexes). Elektrostatische complexen van siRNA en het kationische DB blok van PEG-DB polymeren wordt vergemakkelijkt door het mengen bij lage pH (4,0). Bij pH 4,0, is DMAEMA hoogst geprotoneerd, en bijgevolg wordt het DB blok hoogst geladen. Dit zorgt ervoor dat de polymeren oplossen als unimers in oplossing in tegenstelling tot de vorming van micellen en dat DB complexen effici...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs onthullen geen mogelijke belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn dankbaar drs. Craig Duvall en Rebecca Cook voor toegang tot gegevens en Lab middelen voor het uitvoeren van dit onderzoek. De auteurs zijn dankbaar voor de Vanderbilt Instituut voor Nanoscale Science and Engineering (VINSe) voor de toegang tot DISTRIBUTIELIJSTEN en TEM (NSF EPS 1004083) instrumenten. De auteurs zijn dankbaar voor de National Science Foundation voor de ondersteuning van de Graduate Research Fellowship Program (NSF # 1445197). De auteurs zijn dankbaar voor de nationale instituten van de gezondheid voor financiële steun (NIH R01 EB019409). De auteurs zijn dankbaar voor het ministerie van defensie conregressie gericht medisch onderzoekprogramma voor financiële ondersteuning (DOD CDMRP OR130302).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 μm pore-size syringe filtersThermo Fisher ScientificF2513317 mm diameter, PTFE membrane
0-14 pH test stripsMillipore SigmaP4786
10x TAE bufferThermo Fisher Scientific/InvitrogenAM9869
6-7.7 pH test stripsMillipore SigmaP3536
96-well black walled platesCorning3603Tissue-culture treated
Agarose PowderThermo Fisher Scientific/Invitrogen16500
Citric acid monohydrateMillipore SigmaC1909
dibasic sodium phosphate dihydrateMillipore Sigma71643
D-luciferinThermo Fisher Scientific88294Monopotassium Salt
DMEMGibco11995065High glucose and pyruvate
EthanolMillipore Sigma459836
ethidium bromideThermo Fisher Scientific/Invitrogen15585011
FBSGibco26140079
loading dyeThermo Fisher Scientific/InvitrogenR0611
Luciferase siRNAIDTN/AAntisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC
AAUUGUU
Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU
GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cellsGenTarget IncSC059-BsdLuciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity
monobasic sodium phosphate monohydrateMillipore SigmaS9638
Scarmbled siRNAIDTN/AAntisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC
GCGUA*T* *DNA bases
square polystyrene cuvettesFisher Scientific14-955-1294.5 mL capacity
TEM gridsTed Pella, Inc.1GC50PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper
Trisodium citrate dihydrateMillipore SigmaS1804
uranyl acetatePolysciences, Inc.21447-25

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  2. Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
  3. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
  4. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244(2002).
  5. Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
  6. Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543(2015).
  7. Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
  8. Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
  9. Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
  10. Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
  11. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638(2013).
  12. Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
  13. Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
  14. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  15. Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
  16. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502(2017).
  17. Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
  18. Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
  19. Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
  20. Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20(2016).
  21. Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
  22. Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347(2003).
  23. Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
  24. Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
  25. Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
  26. Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
  27. de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
  28. Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
  29. Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249(2007).
  30. Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
  31. Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
  32. Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
  33. Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
  34. Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21(2018).
  35. Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166(2013).
  36. Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
  37. Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
  38. Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Dynamische lichtverstrooiingtransmissie elektronenmicroscopieagarosegel retardatieendosomale ontsnappingpH responsieve polymeercytosolische afgiftegene silencing assay

Gerelateerde artikelen