Targeting Alfa Synuclein aggregaten in cutane perifere zenuwvezels door Free-floating immunofluorescentie assay

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor een vrij zwevende indirecte immunofluorescentie assay op de huid biopsie secties die het mogelijk maakt voor de identificatie van de ziekte specifieke conformatie varianten van Alfa synuclein betrokken bij de ziekte van Parkinson en meerdere eiwitten van de perifere zenuwstelsel.

Samenvatting

Tot op heden is voor de meeste neurodegeneratieve ziekten alleen een post-mortem histopathologisch definitieve diagnose beschikbaar. Voor de ziekte van Parkinson (PD), de diagnose nog steeds berust alleen op klinische symptomen van de motor betrokkenheid die later verschijnen in de ziekte natuurlijk, wanneer de meeste van de Dopaminerge neuronen zijn al verloren. Daarom is er een sterke behoefte aan een biomarker die patiënten kunnen identificeren aan het begin van de ziekte of op het risico van de ontwikkeling ervan. In de afgelopen jaren, huid biopsie heeft bewezen een uitstekend onderzoek en diagnostisch hulpmiddel voor perifere zenuwziekten zoals kleine vezel neuropathie. Interessant is dat een kleine Fiber neuropathie en Alfa synuclein (αSyn) neurale deposito's zijn aangetoond door huid biopsie bij PD patiënten. Inderdaad, huid biopsie heeft het grote voordeel dat het een gemakkelijk toegankelijke, minimaal invasieve en pijnloze procedure die het mogelijk maakt de analyse van perifeer zenuwweefsel vatbaar voor de pathologie. Bovendien, de mogelijkheid van het herhalen van de huid biopsie in de loop van de follow-up van dezelfde patiënt maakt het bestuderen van de longitudinale correlatie met de progressie van de ziekte. We zetten een gestandaardiseerd betrouwbaar protocol om de aanwezigheid van αSyn aggregaten in de huidzenuw vezels van de PD patiënt te onderzoeken. Dit protocol omvat weinig korte fixatie stappen, een cryotome en vervolgens een vrij zwevende immunofluorescentie Double-kleuring met twee specifieke antilichamen: anti-eiwit gen product 9,5 (PGP 9.5) om de cutane zenuwvezels en anti 5G4 voor het opsporen van merk αSyn aggregaten. Het is een veelzijdig, gevoelig en gemakkelijk uit te voeren protocol dat ook kan worden toegepast voor het richten van andere eiwitten van belang in de huid zenuwen. De mogelijkheid om αSyn aggregaten merk is een andere stap voorwaarts om het gebruik van huid biopsie als een instrument voor de vaststelling van een pre-mortem histopathologisch diagnose van PD.

Inleiding

Huid biopsie heeft verworven een groot belang als de diagnostische en Research Tool op het gebied van neurologische aandoeningen¹. Inderdaad, epidermis en dermis bevatten overvloedige somatische zintuiglijke zenuwvezels (gemyeliniseerde en mergloze), Nociceptieve vrije zenuwuiteinden, zintuiglijke receptoren en autonome innervatie van zweetklieren, schepen, talgklieren en spier arrector pilorum ².

In het midden van de 20e eeuw, de Setup voor Immunohistochemistry van PGP 9.5 antilichaam toegestaan het bewijs van een uitgebreide innervatie van de menselijke epidermis zoogdier huid³. PGP 9.5 is een carboxyl-Terminal hydrolase gelijkelijk verdeeld langs axons van zowel het centrale en perifere zenuwstelsel (PNS). De beschikbaarheid van dit antilichaam liet niet alleen toe om de morfologie en de anatomie van PNS in de huid te verduidelijken maar ook uitgevoerd de studie van ziekten verbonden aan het^3,4. Huid biopsie bijgedragen aan het definiëren van een nieuwe klinische entiteit: de kleine vezel neuropathie. Verschillende internationale groepen toonden de associatie tussen het verlies van intraepidermal zenuwvezels en symptomen/tekenen van kleine Fiber neuropathie⁵ door de huid biopsie analyse en mits gestandaardiseerde protocollen voor zenuw morphometry evenals normatieve referentiewaarden die in de klinische praktijk^6,7,8moeten worden gebruikt.

Onlangs heeft een grote hoeveelheid bewijsmateriaal aangetoond dat neurodegeneratieve ziekten, gekenmerkt door misgevouwen eiwit accumulaties in het centrale zenuwstelsel, zijn multi-systeem pathologieën⁹. Inderdaad, PD wordt gekenmerkt door αSyn accumulatie in de Dopaminerge neuron van Substantia nigra, maar het is aangetoond dat αSyn en haar pathologische vorm, phosphorylated ΑSyn (P-αSyn), ook kan worden gedetecteerd in de perifere weefsels. Gastro-intestinale mucosa¹⁰, speekselklieren¹¹, huid autonome vezels omringende zweetklieren en pilomotor spieren^12,13,14, tonen immunoreactivity aan pathogene vormen van αSyn, in overeenstemming met de hypothese van braak dat intrigerend postulaat dat αSyn de pathologie kan in PNS goed vooraf beginnen, vóór zijn accumulatie in hersenen¹⁵. Verder, de aanwezigheid van p-αSyn is aangetoond in de huid zenuwen van patiënten met rem gedragsstoornissen die worden beschouwd als prodromal PD^16,17 dus huid pathologische αSyn kan worden beschouwd als een veelbelovende vroege perifere histopathologisch marker van synucleinopathy.

De vereniging van kleine vezel neuropathie in PD is eerder aangetoond en het is gebleken dat intraepidermal zenuwvezels dichtheid weerspiegelt progressie van de ziekte^18,19. Vandaar, de huid biopsie is een nuttig instrument voor het bestuderen van neurodegeneratie in PD en voor de vaststelling van een pre-mortem histopathologisch diagnose van de ziekte. Inderdaad, huid biopsie heeft een groot voordeel van een gemakkelijk toegankelijke en minimaal invasieve procedure, waardoor de analyse van het zenuwweefsel vatbaar voor de pathologie. Ten slotte, de mogelijkheid van het herhalen van de huid biopsie in de loop van de follow-up van dezelfde patiënten maakt het bestuderen van de longitudinale correlatie met progressie van de ziekte.

In ons laboratorium, het exploiteren van een dubbele immuun-kleuring met PGP 9.5 en de conformatie-specifieke monoclonal 5G4 antilichaam, dat de ziekte specifieke vormen van αSyn met inbegrip van kleine aggregaten^20,21erkent, waren we in staat om aan te tonen de aanwezigheid van αSyn aggregaten in huid zenuwen met een veelbelovende hoge diagnostische efficiëntie¹⁹. Immunofluorescentie analyse van de huid biopsie in conformationele ziekten onderscheidt zich als een veelbelovende bron van biomarkers door het combineren van zowel de opsporing van eiwit aggregaten en de maatregel van de neurodegeneratie in vivo. Hierna illustreren we een eenvoudig en veelzijdig protocol over de behandeling van de huid biopsie en het uitvoeren van de vrij zwevende immunofluorescentie kleuring voor het opsporen van αSyn aggregaten. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor het richten van een andere proteïne van belang, uitgedrukt in huid PNS.

De volgende studie protocol is gebruikt om de diagnostische nut van geaggregeerde αSyn analyse in de PNS van PD door de huid biopsie¹⁹te evalueren. De criteria van de opneming voor PD waren: een welomlijnde klinische diagnose volgens de Britse kenmerkende criteria van de hersenen Bank, ziekteduur minstens 3 jaar, geen familiegeschiedenis, en geen belangrijke cognitieve stoornis of belangrijke dysautonomic symptomen in de geschiedenis. Uitsluitingscriteria waren bekende oorzaken van neuropathie (versuikerde hemoglobine, creatinine, vitamine B12, TSH, serum immunofixation, HIV, HCV, syfilis, en Borreliosis). Elk onderwerp onderging aan 3 mm-diameter huid biopten bij drie anatomische plaatsen (hals bij C8 dermatomale niveau, dij 10 cm boven de knie, been 10 cm boven zij malleolus) aan de kant, die klinisch meer werd beïnvloed. In het algemeen, het volgende protocol is over de behandeling van de huid biopsie en het uitvoeren van de vrij zwevende immunofluorescentie kleuring en analyse. Vandaar kan het worden aangepast en worden gebruikt voor de opsporing van andere proteïnen van belang in huidweefsel.

Protocol

Het protocol is goedgekeurd door de Cantonal ethische Commissie en alle ingeschreven onderwerpen hebben schriftelijk geïnformeerde toestemming gegeven aan de studie.

1. huid biopsie collectie

1. Laat een gekwalificeerde arts de huid biopsie uit te voeren in een passende klinische setting.
2. Kies het gebied om de huid biopsie uit te voeren en schoon met een alcoholdoekje.
3. Bereid de verdoving oplossing met 1 CC van lidocaïne 2%.
4. Met de naald parallel aan het gebied, injecteren lokale anesthesie onderhuids.
5. Na controle van het effect van de anesthesie, neem de 3 mm wegwerp Punch en toepassing rotatie en delicate neerwaartse druk om het te draaien naar beneden door de epidermis en dermis, totdat de onderhuidse vet is bereikt.
6. Trek de punch.
7. Gebruik wegwerp tang om voorzichtig Trek de huid plug-up.
8. Gebruik een schaar te snijden uit de basis van het specimen op het niveau van het vetweefsel.
9. Plaats het specimen in een buis met 10 mL periodate-lysine-Paraformaldehyde (PLP) fixatieve oplossing.
10. Desinfecteer het gebied en bedek het met een kleefband.

2. weefsel fixatie en-opslag

1. Maak verse PLP fixatieve oplossing (Zie tabel 1).
2. Onmiddellijk na het verzamelen van de huid biopsie, dompel het in een buis met 10 mL PLP fixatief oplossing en Incubeer het 's nachts (O/N) bij 4 ° c.
3. De dag na, onder de rook kap, verwijder de PLP fixatief voorzichtig en in dezelfde buis, was de biopsie 3 keer voor 5 min met 5 mL van 0,1 M Sorensen de oplossing (tabel 1).
4. Gooi de oplossing van de Sorensen weg en broed de biopsie uit met 5 mL Cryo-beschermingsoplossing O/N bij 4 °C.
5. Bewaar de biopsie bij 4 °C indien de snede met een cryotome binnen 1 week wordt uitgevoerd; Bewaar de biopsie bij-20 °C indien de snede binnen 3 maanden wordt uitgevoerd; embed de biopsie in een cryomold (stappen 3.2-3.4) en bewaar het op-80 °C om het te behouden voor een langere periode van tijd.

3. weefsel besnoeiing met een Cryotome

1. Stel de cryotome bij-20 °C in.
2. Neem een cryomold en vul het met de Cryo-inbedding medium. Vermijd het maken van bubbels.
3. Met behulp van een pincet Dompel de biopsie in de Cryo-inbedding medium met de longitudinale as (epidermis-dermis) parallel aan de onderkant van de cryomold.
4. Snap Freeze het monster met vloeibare stikstof om een stevige kubus van Cryo-inbedding medium met de biopsie in de juiste oriëntatie te verkrijgen.
5. Zet het monster in de cryostat en wacht 30 minuten om de biopsie te acclimatiseren.
6. Bevestig het monster op de cryostat en snijd 50 µm secties.
7. Met de hulp van een kleine borstel, de overdracht van de Cryo-secties in een 96 goed plaat met 200 µ L van antivries oplossing in elk goed. Een sectie per well.
8. Opslag bij-20 °C.
   Opmerking: Als het analyseren van de gehele biopsie niet wordt geanalyseerd, snijd het slechts gedeeltelijk. In dit geval moeten de secties worden opgeslagen bij-20 °C en het resterende deel van de biopsie bij-80 °C om het voor een langere periode te bewaren.

4. immunofluorescentie kleuring

1. Vul een 96 goed plaat, met 100 µ L van het wassen oplossing.
2. Breng de te analyseren gedeelten van de opslag plaat over naar de nieuwe met de spoeloplossing. 1 sectie per elk goed (4 secties per anatomische plaats, per patiënt: gewoonlijk een totaal van 12 secties per patiënt).
3. Laat de sectie in de was oplossing voor 10 min bij kamertemperatuur (RT). Breng de sectie in een ander goed met dezelfde oplossing en herhaal de wasbeurt.
4. Verplaats de secties in nieuwe putten met 100 µ L van het blokkeren van oplossing en incuberen voor ten minste 90 min en voor een maximum van 4 uur bij RT.
5. Verdunnen de primaire antilichamen anti-PGP 9.5 (konijn Polyclonal, 1:1000) en anti-5G4 (muis monoclonal, 1:400) in de werkende oplossing.
6. Breng de secties in nieuwe putten met 100 µ L van de werkende oplossing van de primaire antilichamen en incubeer hen O/N bij RT.
7. Als stap 4,3, was de secties 2 keer minstens 10 min bij RT, met 100 µ L van het wassen oplossing.
8. Verdunnen de secundaire antilichamen (geconjugeerd met verschillende fluorophores) geit anti-konijn op te sporen PGP 9.5 (1:700) en een geit anti-muis om 5G4 (1:700) te detecteren in de werkende oplossing.
9. Breng de secties in nieuwe putten met 100 µ L van de werkende oplossing van de secundaire antilichamen voor 90 min bij RT. Vanaf dit punt, bedek de 96 goed plaat met aluminiumfolie om het bleken van fluorophore geconjugeerd met secundaire antilichaam/IES te voorkomen.
10. Als stap 4,3, was de secties 2 keer minstens 10 min, met 100 µ L van de het wassen oplossing.
11. Breng de secties in nieuwe putten met 100 µ L van DAPI (verdund 1:5000 in PBS 1x) voor 5 min bij RT.
12. Als stap 4,3, was de secties 2 keer minstens 10 min, met 100 µ L van de het wassen oplossing.
13. Monteer de secties op een dia in de juiste positie vermijdend het misvouwen.
14. Voeg een paar druppels van de montage medium op de glijbaan en dek af met een dekglaasje.
15. Laat dia's drogen O/N alvorens de confocale/fluorescentiemicroscoop te gebruiken.
16. Bewaar de dia's in een geschikte doos bij 4 °C vermijdend de lichte blootstelling. Indien nauwkeurig opgeslagen, het signaal zal zichtbaar zijn voor ongeveer 6 maanden.
    Opmerking: De overdracht van een gedeelte van de 96 goed plaat met de nieuw gesneden plakjes aan de 96 goed plaat met de was-oplossing (stap 4,1) wordt uitgevoerd met behulp van een kleine borstel die helpt bij het ophalen van de biopsie. Na de overdracht van de sectie in de eerste goed, elke keer dat de slice moet worden uitgebroed met een andere oplossing, verplaats het van goed naar goed met de hulp van de borstel.

5. immunofluorescentie beeldvorming

1. Bekijk secties onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop of een confocale Microscoop (20X, 40x of hoger vergroting, gebruik opeenvolgende frames van 2 µm stappen op een Z-stack plan voor de beste resultaten).
2. Beelden te verwerven door een Microscoop aangesloten camera
3. Gebruik een adequate imaging software (dwz ImageJ) om positieve signalen te analyseren in secties in termen van ruimtelijke spreiding en de intensiteit van het signaal. Voer hiervoor de onderstaande stappen uit.
   1. Open het bestand met ImageJ software.
   2. Klik op de afbeelding > Kleur > Split kanalen om elk kleurkanaal te analyseren.
   3. Klik op afbeelding > stack ≫ Z-project om een samenvoeging van meerdere sectie-acquisities te verkrijgen.
   4. Klik op afbeelding > kleur > kanalen samenvoegen om een samenvoeging van verschillende kleurkanalen van dezelfde overname te verkrijgen.

Antivries oplossing (opslag bij 4 °C voor maximaal 6 maanden)	30% glycerol 30% ethyleenglycol 30% dH2O 10% 2x fosfaatbuffer
Blokkerende oplossing (voorbereiden op het moment)	4% normaal geiten serum 1% Triton X-100 in de oplossing van het wassen
Cryo-Bescherm (opslag bij 4 °C voor maximaal 6 maanden)	20% glycerol 80% Sorensen oplossing
Disodium waterstof fosfaat oplossing (opslag bij RT tot 6 maanden)	0,45 m Disodium waterstof fosfaat (Na2HPO4) in dH2O Filter in een steriele fles
Lysine oplossing (opslag bij 4 °C voor maximaal 3 weken)	50% van 0.3 M L-lysine monohydrochloride oplossing 50% van 0.1 M de oplossing van Sorensen pH 7.6 pH 7,4, filter in een steriele fles
Paraformaldehyde (de) 8% (bereid onder de rook kap en op te slaan bij 4 ° c voor maximaal 1 maand)	2,6 m in dH2O (tot 55 °C _do niet meer dan 60 °C om vorming van vormende zuren te vermijden) filter in een steriele fles
Fosfaatbuffer 2x (opslag bij 4 °C voor maximaal 6 maanden)	6% mononatriumglutamaat fosfaat (NaH2PO4) oplossing 45% Disodium fosfaat (Na2HPO4) oplossing in dH2O
PLP fixatief oplossing (voorbereiding op het moment, onder rook kap)	25% Paraformaldehyde 8% 0.01 m natrium (meta) periodate 75% lysine oplossing <
Natrium Dihydrogen fosfaat monohydraat (opslag bij RT tot 6 maanden)	0.52 m natrium Dihydrogen fosfaat monohydraat (NaH2PO4 * H2O) in dH2O Filter in een steriele fles.
De oplossing van Sorensen (opslag bij 4 °C voor maximaal 1 maand)	2,5% mononatriumglutamaat fosfaat oplossing 18,7% Disodium fosfaat oplossing pH 7.6, in dH2O
Wassen oplossing (voorbereiden op het moment)	0,25 m Trizma basis 0.26) pH 7.6, in dH2O
Werkende oplossing (voorbereiden op het moment)	50% blokkerende oplossing 50% wassen oplossing

Tabel 1: Vereiste oplossingen. Lijst van de vereiste oplossingen voor het protocol en korte beschrijving van hoe het te bereiden.

Resultaten

Naar aanleiding van de beschreven procedure (Figuur 1), we gedetecteerd αSyn aggregaten, gelabeld met 5G4 antilichaam, in dermale zenuwbundels innervating autonome structuren van PD patiënten. De morfologie van Alfa-synuclein deposito's verschijnt als een gestippelde signaal langs de axonen van de huid zenuwen (Figuur 2). Inderdaad, het exploiteren van dit protocol in 19 PD patiënten en 17 controles in de huid biopten op drie anatomische site (cervicale, dij en ...

Discussie

We beschrijven een vrij zwevende immunofluorescentie assay voor huid biopten voor de diagnose van PD: het exploiteert dubbele immunokleuring met anti-PGP 9.5 antilichaam, een panaxonal marker, en anti-5G4, een conformatie specifieke antilichaam dat de geaggregeerde vorm erkent van αSyn.

De grote voordelen van huid biopsie voor diagnostische doeleinden in PD en eventueel in andere eiwit conformatie stoornissen zijn: 1) de directe toegang tot zenuwweefsel vatbaar voor ziekte door een licht invas...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2 mg/mL
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2 mg/mL
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium