Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol, ontworpen om gebruik te maken van chemogenetische hulpmiddelen om de activiteit van corticale Interneuron voorlopercellen getransplanteerd in de cortex van vroege postnatale muizen te manipuleren.

Samenvatting

Neuronale ontwikkeling wordt gereguleerd door een complexe combinatie van omgevings-en genetische factoren. Beoordeling van de relatieve bijdrage van elk onderdeel is een gecompliceerde taak, die bijzonder moeilijk is met betrekking tot de ontwikkeling van γ-aminoboterzuur (GABA) erge corticale interneuronen (CIs). CIs zijn de belangrijkste remmende neuronen in de hersenschors, en ze spelen belangrijke rollen in neuronale netwerken, door het reguleren van zowel de activiteit van individuele piramidale neuronen, evenals de oscillatoire gedrag van neuronale ensembles. Ze worden gegenereerd in voorbijgaande embryonale structuren (mediale en caudale ganglionische eminences-MGE en CGE) die zeer moeilijk zijn om efficiënt te targeten met behulp van utero-elektroporatie benaderingen. Interneuron voorlopercellen migreren lange afstanden bij normale embryonale ontwikkeling, voordat ze in het corticale circuit integreren. Dit opmerkelijke vermogen om te dispergeren en te integreren in een ontwikkelend netwerk kan worden gekaapt door het transplanteren van embryonale Interneuron precursoren in vroege postnatale gastheer cortices. Hier presenteren we een protocol dat genetische modificatie van embryonale Interneuron voorlopercellen mogelijk maakt met focale ex vivo elektroporation. Deze engineered Interneuron precursoren worden vervolgens getransplanteerd in vroege postnatale gastheer cortices, waar ze zullen rijpen in gemakkelijk identificeerbare CIs. Dit protocol maakt het gebruik van meerdere genetisch gecodeerde hulpmiddelen mogelijk, of de mogelijkheid om de expressie van specifieke genen in Interneuron voorlopercellen te reguleren, om de impact van genetische of omgevingsvariabelen op de rijping te onderzoeken en integratie van CIs.

Inleiding

De functie van neuronale netwerken berust op het bestaan van een evenwichtige aanvulling van excitatory projectie neuronen en remmende interneuronen. Hoewel corticale interneuronen (CIS) slechts 20% van alle neuronen in de zoogdier cortices vertegenwoordigen, worden tekorten in hun aantal of functie verondersteld een belangrijke rol te spelen in de pathogenese van neuroontwikkelingsstoornissen^1,2. De studie van CI-ontwikkeling is een uitdaging omdat CIs worden gegenereerd in voorbijgaande embryonale structuren die moeilijk toegankelijk zijn, en ze volgen een lange tangentiële migratie voordat ze het pallium bereiken en hun volwassen anatomische en fysiologische eigenschappen³. Zowel genetische als milieu mechanismen zijn gekend die CI-ontwikkeling⁴reguleren, maar het is moeilijk gebleken om de relatieve bijdrage van meerdere factoren te bestuderen.

Veel inzichten in CI-ontwikkeling werden verkregen met behulp van in vitro kweeksystemen na isolatie van voorlopercellen uit de ganglionische eminenties^5,6. Een van de grote voordelen van deze methoden is het potentieel om de geïsoleerde voor ouders te labelen en genetisch te modificeren en hun differentiatie in detail te volgen, om celautonome veranderingen te detecteren. Echter, deze methoden zijn niet in staat om informatie te bieden over de interacties tussen het ontwikkelen van interneuronen en een actief netwerk. We hebben deze protocollen aangepast door transplantatie van de gemodificeerde precursoren in de vroege postnatale cortex. Interneuron voorlopercellen geïsoleerd van embryonale ganglionische eminenties kunnen overleven, dispergeren en integreren in het hostnetwerk bij transplantatie in de cortex^7,8. Deze methode is gebruikt om de ernst van epileptische aanvallen in genetische Muismodellen te verminderen, en is voorgesteld als een mogelijke nieuwe therapie voor verschillende neuroontwikkelingsstoornissen^9,10. Een eerder protocol beschrijft een procedure om deze precursoren te transfusie met virale vectoren voorafgaand aan transplantaties¹¹. Het protocol dat we hier beschrijven, maakt ook de genetische modificatie van interneuronen mogelijk, maar vereist niet de creatie van een virale vector, die alleen een plasmide DNA nodig heeft, wat de flexibiliteit aanzienlijk vergroot. Sommige studies rapporteerden succes bij het gebruik in utero elektroporation voor het genetisch wijzigen van Interneuron voorlopercellen in de caudal ganglionaire eminences (CGE)¹², maar deze methode heeft zeer moeilijk te reproduceren bewezen.

In de sectie representatieve resultaten illustreren we het gebruik van deze methode om Designer receptoren te uiten die uitsluitend worden geactiveerd door designer drugs (DREADDs¹³) in de getransplanteerde CIS, een methode die we gebruikten in een recente publicatie¹⁴. We uitgedrukt hM3D (GQ), een Engineered receptor op basis van de menselijke cholinerge receptor CHRM3, die geen invloed op de neuronale functie tenzij het bindt zijn specifieke ligand Clozapine-N-oxide (CNO). CNO Administration activeert selectief activering van hM3D (GQ) uitdrukken van cellen. We gebruikten deze methode om te laten zien dat cel autonome en voorbijgaande depolarisatie voldoende is om te voorkomen dat apoptosis van CIs tijdens de ontwikkeling¹⁴. In combinatie met verschillende genetisch gecodeerde gereedschappen, dit protocol heeft het potentieel om up-of down-reguleren van genexpressie, en visualiseren of manipuleren celactiviteit tijdens verschillende stadia van Interneuron differentiatie.

Protocol

Dieren zijn gefokt en gehuisvest in overeenstemming met de wet op de dieren (wetenschappelijke procedures) van het Verenigd Koninkrijk (1986).

Opmerking: Voor de generatie van de pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP construct is een SalI-StuI fragment, dat de hM3D (GQ) sequentie bevat, geïsoleerd van plasmide 50463 (Addgene), en ingevoegd in de expressie vector pCAGGs-RFP (geschenk van F. Guillemot) verteerd met XhoI-EcoRV.

1. bereiding van de corticale schijfjes muis embryo

1. Steriliseren van labapparatuur (bijv. stereo microscopen) en oppervlakken (bijv. banken) met een geschikt detergens oplosmiddel en 70% ethanol (EtOH) oplossing in water (H₂O).
2. Gebruik dissectie gereedschappen die zijn geautoclaveerd en houd ze de hele tijd in 100% EtOH.
3. Bereid 3 20 mL aliquots van 4% low-Gelling temperatuur agarose in 1x fosfaatbufferoplossing (PBS), in 50 mL buizen, en houd ze op 55 °C.
4. Offeren zwangere muizen door cervicale dislocatie op 13,5 of 14,5 dagen van de dracht (embryonale dag E 13.5-E 14.5).
5. Met een paar dissectie schaar, open de buik van de zwangere muizen, verwijder de baarmoeder hoorns (met de embryo's) en plaats ze in ijskoude Krebs-oplossing (tabel 1), in een 90 mm Petri schaaltje.
6. Met een paar Straight student Fine Tang, open de amniotische zakjes, verwijder de embryo's en breng ze over in verse ijskoude Krebs-oplossing, in een nieuwe 90 mm Petri schaal. Dissect de muis embryo hersenen (forebrain, midbrain, hindbrain) van de rest van het embryo lichaam.
7. Houd de ontleed hersenen van de achterhersenen, breng ze over in ijskoude Krebs-oplossing in een nieuwe 90 mm Petri schaaltje en bewaar ze op ijs.
8. Met een waterdichte pen tekent u een rechte lijn aan het buitenoppervlak, midden in het onderste gedeelte van 6 35 mm Petri schalen.
9. Plaats één 4% laaggegelende agarose/PBS 20 mL aliquot bij 37 °C gedurende 5 min. onmiddellijk daarna slecht 10 mL in 2 35 mm Petri schalen en insluiten de ontleed hersenen.
   Opmerking: De olfactorische bollen moeten naar beneden (onderkant van de Petri schaal) worden geconfronteerd. Embed 3-4 hersenen per Petri schaaltje, lijn ze uit in de eerder getekende rechte lijn. Laat 3 − 5 mm ruimte tussen elke twee hersenen.
10. Herhaal de stappen 1,8 en 1,9 totdat alle ontleed hersenen zijn ingesloten.
11. Plaats de ingesloten hersenen op 4 °C, om de agarose te stollen en snijd vervolgens de drie hersenen in een enkel blok met de juiste grootte en oriëntatie.
    Opmerking: Laat ongeveer 3 mm rond de randen van de hersen monsters. Verander de oriëntatie van de hersenen, met de olfactorische bollen bovenaan.
12. Lijm het blok op het oppervlak van een microtoom basis en gebruik een chirurgisch mes dat helemaal door de bodem van het blok wordt gesneden, tussen elke twee hersenen, om 3 onafhankelijke blokken te maken (elk mini blok met één brein).
13. Sectie de blokken, in ijskoude Krebs oplossing, in 250 μm dikke plakjes, met behulp van een vibrerende Blade microtoom.
14. Met een gebogen platte micro-spatel verzamelen alleen de plakjes met de mediale of caudal ganglionaire eminences (MGE of CGE; Figuur 1) en individueel overbrengen naar filter membranen (13 μm diameter, 8,0 μm poriegrootte), zwevend op minimale essentiële medium (MEM, tabel 1) in polystyreen centrum-goed orgel cultuur gerechten (60 mm x 15 mm).
15. Plaats de gerechten in een incubator van CO₂ -weefselkweek, bij 37 °c, voor 1 uur, en bereid de focale elektroporation voor.

2. acute hersen slice Electroporation

1. Voor het begin van de elektroporation procedure, bereid 50 mL van 1% agarose gel in een 100 mm Petri schaal. Laat de agarose-gel ongeveer 30 minuten stollen bij kamertemperatuur (RT).
2. Bereid kleine agarose kolommen (1 mm diameter en 10 mm lengte), geperforeerd met een glazen pipet (225 mm lengte; 2 mL capaciteit) en breng ze over in ijskoude Krebs-oplossingen.
   Opmerking: Een rubberen druppelaar die geschikt is voor 2 mL pipetten is aan de pipet bevestigd en door erop te drukken kan de kolom van de glazen pipet worden losgelaten op de Krebs-oplossing.
3. Met een chirurgische Blade, gesneden kleine agarose blokken van twee maten: een kleine die past op het oppervlak van de elektrode (zie hieronder) en een grotere, die zal worden gebruikt als basis voor het uitvoeren van de focal DNA-injecties in de hersenen segmenten. Breng ook de agarose-blokken in ijskoude Krebs-oplossing over.
4. Bereid de set-up voor de focale injecties en de acute elektroporation (Figuur 2).
   Opmerking: Voor de injecties is de volgende apparatuur nodig: 1) een heldere veld dissectie stereo-microscoop, 2) een pneumatische Pico-Pump injector, 3) een micro manipulator, 4) een magnetische standaard, en 5) een stalen basisplaat. Voor de acute slice-elektroporation is de volgende apparatuur nodig: 1) een vierkante platina 10 mm Petri schaalelektrode, 2) een vierkante platina 10 mm afdek elektrode, 3) een micro manipulator, en 4) een elektroporator.
5. Focale DNA-injecties
   1. Bereid een DNA mengsel van expressie vectoren: pCAGGs-IRES-GFP (Control vector) + pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP, bij een concentratie van 1 μg/μL voor elke vector en voeg snelle groene oplossing (voorraad 25 mg/mL) in een verdunning 1/10.
   2. Vul een getrokken glazen micropipet (0,5 mm binnendiameter en 1 mm buitendiameter) met 10 μL van het DNA-mengsel en Injecteer kleine hoeveelheden (op het 25-50 nL-bereik) in het geselecteerde gebied (MGE/CGE) van het segment (Figuur 1 en Figuur 2).
6. Acute elektroporation
   Opmerking: De elektroporation moet onmiddellijk na de focale DNA-injectie worden uitgevoerd.
   1. Plaats het kleine agarose blok op de Petri schaalelektrode en bevestig de agarose-kolom aan de mobiele afdek elektrode met behulp van een platte micro spatel.
   2. Breng het segment met het ondersteunende membraan over op het agarose-blok en plaats de bovenste elektrode met de agarose-kolom bovenop het geselecteerde gebied (MGE/CGE) van het segment.
      Opmerking: laad spanningen van 125 V (twee pulsen van elk 5 MS, interval 500 MS) zullen een succesvolle elektroporation opleveren (Figuur 3).
7. Na de elektroporation plaatst u het segment met het ondersteunende membraan in de schaal en zet u het gerecht over in een broedplaats van CO₂ -weefselkweek, bij 37 °c.
8. Wissel na 1 uur het MEM-medium in voor een basismedium dat geschikt is voor primaire neuronale culturen (neuron basismedium; Tabel 1) en incuberen de plakjes 's nachts, voor ongeveer 18-24 uur.

3. bereiding van de cel-grafts

1. Controleer de efficiëntie van de elektroporation in alle segmenten. Selecteer alleen de segmenten waarin een aanvaardbaar aantal fluorescerende cellen wordt waargenomen (Figuur 3).
   Opmerking: Elektroporate ongeveer 30 segmenten/per experiment om het juiste aantal cellen voor enten te verwerven (zie hieronder).
2. Ontleden de geselecteerde regio (MGE/CGE) uit elk segment en snijd het weefsel in kleine stukjes in ijskoude Krebs-oplossing, onder een fluorescerende dissectie-stereomicroscoop.
3. Plaats ondertussen een tube van 1,5 mL met 900 μL neuron basismedium in een waterbad van 37 °C.
4. Breng de weefsel stukken met een P1000 micropipettor over in een buis van 1,5 mL met 500 μL L15/DNase medium, bereid door toevoeging van 100 μL 1 mg/mL DNase kolf in het medium DMEM/F12 in 900 μL L15 medium. Was de weefsel stukken door te tikken.
5. Voeg 100 μL DNase (voorraad 1 mg/mL in het medium DMEM/F12) toe aan het neuron basismedium van 900 μL.
6. Gooi het medium L15/DNase weg en regeer de weefsel stukken in 200 μL neuron Basic/DNase medium voorbereid in stap 3,5.
7. Stel een P200 micropipettor in op 180 μL en verwijder mechanisch de weefsel stukken door ze zachtjes, 20-30 keer op en neer te pipetteren totdat er een gladde en "romige" suspensie wordt verkregen.
8. Voeg 200 μL neuron Basic/DNase medium (eindtotaal volume 400 μL) toe en regenereren.
9. Neem een hoeveelheid van 4 μL cellen, Verdun naar behoren en monteer op een hemocytometer.
10. Onder een heldere veld Microscoop, Controleer de efficiëntie van de dissociatie en Tel het aantal cellen.
    Opmerking: Als de dissociatie succesvol is, zullen heldere (levend) enkelvoudige cellen en niet-celaggregaten worden nageleefd.
11. Centrifugeer celsuspensie van stap 3,8, bij 1.000 rpm, bij RT, gedurende 5 minuten, en verwijder vervolgens het supernatant uit de buis en voeg het juiste L15/DNase-medium toe (meestal 5-7 μL), zodat de uiteindelijke concentratie van cellen 8 x 10⁵-1,2 x 10^{6 is} cellen/μL.
    Opmerking: Tijdens de resuspensie is het uitermate belangrijk om luchtbellen te vermijden.
12. Plaats de cel aliquot op ijs en hebben extra L15/DNase medium voor de injecties.

4. intracraniële injecties

Opmerking: De volgende procedures vinden plaats in een procedure ruimte binnen de faciliteit voor huisdieren. Aangezien de cellen rechtstreeks aan de hersenen van pasgeboren pups worden geïnjecteerd zonder de hersenen bloot te stellen, worden aseptische condities aangehouden door de werkruimte te steriliseren met 70% EtOH-oplossing en geautoclaveerd glazen naalden te gebruiken. De volgende apparatuur is nodig voor de intracraniële injecties: 1) een heldere veld dissectie stereo-microscoop, 2) een micro-injector, en 3) een verwarmingspad voor muis herstel.

1. Maak een glazen naald door naalden aan te trekken volgens de aanbevelingen van de fabrikant. In dit protocol worden glazen naalden met een buitendiameter van 80 μm, een binnendiameter van 40 μm en een schuine kant van 30 ° gebruikt.
   Opmerking: Zoals hierboven vermeld, moeten naalden worden geautoclaveerd voor gebruik.
2. Opvulling handmatig de naald met biologisch inerte olie met behulp van een 30 G, 2 inch naald en een spuit.
3. Monteer en steek de naald in de injectoreenheid volgens de instructies van de fabrikant.
4. Bepaal de injectie-instellingen bij maximaal volume (69 nL) en een relatief langzame snelheid (23 nL/s).
5. Maak de naald leeg totdat de zuiger volledig is verlengd.
6. Vul de naald.
   1. Snijd een klein stukje van een enten tape en plaats het onder een heldere veld dissectie stereo-microscoop. Met een P10 micro Pipet, Breng 5 μL van het monster (cel aliquot) op de tape, zodat een bolvormige druppel wordt gevormd.
   2. Plaats de punt van de naald in het monster en vul de naald (de zuiger trekt intrekken en tekent het monster ermee).
      Opmerking: Aangezien het monster vrij visceus moet zijn, vult u de naald in kleine stapjes, zodat het monster zal worden geëequilibreer en in een langzame snelheid waardoor bellen niet ontstaat. Het monster moet glad en homogeen zijn binnen de naald. Als het monster te visceus is en het niet mogelijk is om de naald te vullen, voeg dan zoveel L15/DNase medium toe als nodig is om de juiste viscositeit te verkrijgen. Niettemin, dit zal de concentratie van het monster te veranderen, en idealiter moet worden vermeden.
7. Verdoving nieuwe geboren pups (postnatale dag 0-2 [P0-P2]) op ijs voor 2-5 min.
   Opmerking: Zorg ervoor dat het pup niet beweegt.
8. Plaats het verdoofd pup onder het heldere veld dissectie stereo-microscoop.
9. Voer 3-4 injecties van 69 nL per halfrond uit.
   Opmerking: De injectieplaatsen bevinden zich ongeveer 1 mm lateraal tot de middellijn en tussen 1 mm caudal tot bregma en 1 mm rostrale migratoire naar de interaurale lijn. De punt van de naald moet ongeveer 1 mm diep op het Piale oppervlak worden geplaatst. Na elke injectie wordt de naald ongeveer 30 sec. en in periodes teruggetrokken.
10. Onmiddellijk na de injecties, plaats de pup op een verwarmingskussen met de verwarming in de laagste stand (37 ° c). Wanneer de pup herstelt overbrengen naar de kooi met zijn moeder.
    Opmerking: Verlaat nooit de moeder zonder pups in de kooi. De hele procedure (van het verwijderen van de pup van zijn littermates, totdat het wordt teruggegeven) moet minder dan 10 minuten duren.

5. Clozapine-N-oxide injecties

1. Bereid de DREADD ligand, CNO Stock Solution door 1 mg CNO in 50 μL dimethylsulfoxide (DMSO) te verdunen totdat de oplossing doorschijnend is. Top-tot 10 mL met zoutoplossing zodat de uiteindelijke concentratie van CNO is 0,1 mg/mL.
   Opmerking: DMSO is giftig. Vermijd het gebruik ervan tot een concentratie hoger dan 0,1%. Gebruik als een controle een zoutoplossing met dezelfde DMSO-concentratie als de CNO bevattende oplossing.
2. Vanaf postnatale dag 14 en voor 3 constitutief dagen (P14-P16), in elke muis voeren twee intraperitoneale (I.P.) injecties van CNO (CNO-concentratie: 1 mg/kg) of 0,05% DMSO in zoutoplossing, per dag, 12 h uit elkaar.
3. Voer op de laatste dag (P17) een enkelvoudige injectie uit en offer muizen op cervicale dislocatie binnen een tijdsperiode van 30 min-1 uur.

Resultaten

Met behulp van de hier gepresenteerde procedure, hebben we getest of het overleven van corticale interneuronen tijdens vroege postnatale stadia wordt gereguleerd door activiteit op een autonome manier van de cel. We voerden 3 hersen slice elektroporation experimenten uit (12-16 embryo's [E 14.5 embryo's] per experiment) met de pCAGGs-IRES-GFP (Control) en pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP-expressie vectoren, met een concentratie van 1 μg/μL voor elke constructie. In onze elektroporation experimenten, slechts een fractie (ongeveer 50%; Figuur 3) van de GFP⁺ neuronen, co-uitgedrukt HM3D (GQ) (RFP⁺) en daarom diende de GFP⁺RFP^- populatie als een interne controle voor het effect van dreadd liganden. De corticale embryonale interneuronen werden mechanisch losgekoppeld en de resulterende celsuspensie (8 x 10⁵ cellen/μL) geënt in de cortex van P0-P1 wild type muizen. We hadden 6 injecties per hersenen uitgevoerd. In elk experiment werden minimaal 6 nieuw geboren pups geïnjecteerd. De toediening van CNO heeft de activiteit van getransfunteerde RFP⁺ -cellen selectief verhoogd, zoals blijkt uit de uitdrukking van de activiteitsafhankelijke proteïne-cfo's (Figuur 4). CNO behandeling volgens het beschreven Protocol (beheer tweemaal daags P14-P17) resulteerde in een toename van het aandeel van GFP⁺RFP⁺ ten opzichte van GFP⁺RFP^- cellen, in vergelijking met voertuig (0,5% DMSO in Saline) worden toegediend (Figuur 5).

Figuur 1: representatieve telencephalische schijfjes die worden gebruikt voor acute elektroporation experimenten. (a-C) Telencephalic plakjes verkregen op drie verschillende sequentiële rostro-caudal niveaus, gekleurd met 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI). LGE: laterale ganglionische eminentie; MGE: mediale ganglionische eminentie; CGE: caudal ganglionaire Eminence. Schaal staven = 200 μm. De gele sterretjes geven de elektroporation plaats in elk segment aan. De witte lijn markeert de rand van de ganglionische eminentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: schematische weergave van de experimentele workflow. A) muizen hersen schijfjes worden elektroporated met geschikte constructies, en (B) na 12 h gemodificeerde corticale Interneuron (CI) precursoren zijn geïsoleerd en (C) getransplanteerd in het pallium van pasgeboren muis pups (P0 − P2). Om de activiteit van onvolgroeide CIs te wijzigen, werden P14 pups die celtransplantaties hadden ontvangen, met CNO of Vehicle geïnjecteerd voor vier constitutieve dagen volgens het gepresenteerde protocol. (A ') Foto van de acute muis brain slice electroporatie set-up. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Representatieve succesvolle acute slice electroporatie experiment. A) representatieve coronale sectie van een e 14.5 embryo hersen transfusie in het CGE met zowel PCAGGS-IRES-GFP (GFP) en Pcaggs-HM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmiden en gekweekt voor 12 uur. De sectie is immunogekleurd voor GFP (A, B, C) en RFP (A, B, D). Het boxed gebied in deelvenster A wordt vergroot om de uitdrukking van zowel fluorescerende verslaggevers (B), GFP (C) en RFP only (D) weer te geven. De witte lijn markeert de rand van de ganglionische eminentie. B-D: zelfde foto, verschillende kanalen of combinatie van de twee verschillende kanalen. Schaal staven = 200 μm (A), 100 μm (B-D). Dit cijfer is gewijzigd van Denaxa et al.¹⁴. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: cel autonome toename van de activiteit van M3D (GQ)-het uitdrukken van getransplanteerde CIS bij toediening van CNO. (a-D) Representatieve confocale beelden van een coronale sectie van een P17 Mouse getransplanteerd op P1 met CI precursoren, getransffecteerd met zowel pcaggs-IRES-GFP (GFP) en pcaggs-hM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmiden en behandeld met CNO. De sectie is immunogekleurd voor GFP (A), RFP (B) en CFOs (C). D) het gecombineerde beeld van A, B en C immunofluorescentie (Combo). Merk op dat alleen CIs die zowel plasmiden (witte pijlen in A-D) gezamenlijk uitdrukken, cFos⁺ zijn in vergelijking met CIS die alleen de Control-GFP plasmide (gele pijlen in a-d) uitdrukken. E) kwantificering van CFOs⁺RFP⁺ cellen gevonden in het pallium van P17 muizen getransplanteerd op P1 (genormaliseerd naar de totale RFP⁺ populatie) en behandeld met voertuig of CNO (N = 2). A-D: dezelfde foto, verschillende kanalen of een combinatie van de drie verschillende kanalen. Schaal staven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Cel autonome toename van de activiteit van CIS verbetert de overleving . (a-D) Representatieve confocale beelden van de Somatosensorische cortex coronale schijfjes van de P17 muizen die bij P0-P2 met CI-precursoren zijn getransplanteerd met zowel pcaggs-IRES-GFP (GFP) als pcaggs-hM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmiden en behandeld met voertuig (A-B) (C-D). (E) kwantificering van RFP⁺ -cellen in het voor brein van de P17-muizen die bij P0-P2 zijn getransplanteerd (genormaliseerd naar de totale GFP⁺ -populatie). RFP⁺(voertuig) = 47% ± 3%, cno = 61% ± 3%, p = 0,01, student gekoppelde Sample t-test, n = 3 voertuig en 3 CNO, minimaal 150 cellen geteld per brein. A en B: zelfde foto, verschillende kanalen. C en D: zelfde foto, verschillende kanalen. Schaal staven = 50 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Denaxa et al.¹⁴. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Tabel 1: aanvullende informatie over de media die in dit protocol worden gebruikt.

Discussie

Hier beschrijven we een breed toegankelijke methodologie voor het genetisch wijzigen van de activiteit van CI-precursoren om de impact van intrinsieke activiteit op de CI-rijping te bestuderen, en/of het effect van gemoduleerde CIs op de assemblage/functie van de geïntegreerde corticale Circuits.

In het verleden hadden verschillende laboratoria, waaronder de onze, in utero-elektroporation experimenten gepresteerd om de projectie neuronen genetisch te wijzigen.⁶. Echter, in utero electroporatie in ganglionaire eminenties die CI-voorlopercellen omvatten is zeer moeilijk, als gevolg van elektrische geleiding pad problemen. Om dit probleem op te lossen, een klein aantal Labs uitvoeren echografie geleide injecties gevolgd door elektroporation, dat is een veeleisende techniek die dure apparatuur vereist. Dit protocol biedt een alternatief voor deze methodologieën die voor de meerderheid van de wetenschappelijke gemeenschap toegankelijk zijn.

Een van de meest uitdagende aspecten van dit protocol is het maximaliseren van het aantal cellen dat overleven in de host cortex tot volwassen stadia, wanneer fenotypische analyse wordt meestal uitgevoerd (zeer afhankelijk van het experiment ontwerp, maar meestal ouder dan P17). Er zijn drie belangrijke stappen die de onderzoeker moet letten: (1) de efficiëntie van de elektroporation. Dit kan gemaximaliseerd worden door de zuiverheid van DNA plasmiden te waarborgen. Voor deze procedure moeten alleen hoogwaardige DNA-plasmiden (een A₂₆₀/a₂₈₀ ratio van 1,9-2,0) worden gebruikt. We verkrijgen dergelijke hoogwaardige DNA-preparaten door het gebruik van cesium chloride-DNA-zuivering. Een andere cruciale factor is de promotor die de uitdrukking van het belang van het gen stimuleert. We ontdekten dat de pCAGGs vector, die bestaat uit de Chicken b-actin Promoter, extreem krachtig is en de elektroporation efficiency drastisch kan verhogen. 2. het aantal beginnende donor embryo's. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat een groot aantal (12-16) embryo's van dezelfde fase worden geëvacueerd. Dit aantal kan worden verhoogd als meer experimenteurs embryo dissecties uitvoeren en samen snijden, omdat het belangrijk is dat embryonale corticale schijfjes zo snel mogelijk worden verkregen, geëvacueerd en naar de incubator worden overgebracht. (3) het is belangrijk om ervoor te zorgen dat een groot aantal cellen in elk pup wordt geïnjecteerd om een hoge kans op getransplanteerde celoverleving tot volwassen stadia te garanderen. Bovendien zal dit de kans op succesvolle transplantaties drastisch verbeteren, omdat celpreparaten met lage dichtheid resulteren in ongelijke menging van de cellen met het medium, wat significante variabiliteit zal opleveren in de getransplanteerde hersenen¹⁵ .

Het hier beschreven protocol was op maat gemaakt voor het onderzoeken van de rol van activiteit bij het reguleren van CI-overleving op een cel-autonome manier. De P14-P17 tijdvenster voor het uitvoeren van de CNO injecties werd specifiek gekozen volgens gepubliceerde gegevens, waaruit blijkt dat de piek van getransplanteerde CI progenitors celdood optreedt tijdens deze periode¹⁶. Daarom is dit tijdsbestek of de frequentie van CNO-injecties mogelijk niet van toepassing op andere celtypen of hersengebieden, en moet de onderzoeker deze parameters aanpassen volgens de specifieke experimentele doeleinden. Tot slot, de hier beschreven methodologie voor de intracraniële injecties van CIs is alleen haalbaar voor P0-P5 pups (afhankelijk van de achtergrond van de muis lijn). In principe, elke injecties over P5 zal vereisen dunner of verwijderen van de schedel¹⁵.

Een van de belangrijkste voordelen van dit protocol is de mogelijkheid om nieuwe genetisch gecodeerde hulpmiddelen te gebruiken om de activiteit van CIs te visualiseren of te manipuleren tijdens verschillende fasen van differentiatie terwijl ze integreren in een ontwikkelend netwerk. Met het tempo van de ontdekking van nieuwe genetisch gecodeerde voltage-en calcium sensoren, evenals nieuwe chemogenetische en optogenetische hulpmiddelen, stelt dit protocol onderzoekers in staat om ze binnen enkele weken na de introductie in plasmide repositories te gebruiken, zoals Addgene.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Medium/Supplements
B-27	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	175040-044
DMEM/F12	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	21331-020
DNAse	SIGMA	DN15-100MG
FBS	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	10270-098
100x Glutamine	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	35050-061
L15	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	11415-049
MEM alpha, GlutaMAX	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	32561-029
Neurobasal medium	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	21103-049	Neuron basismedium
100x P/S	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	15140-122
Equipment
Electroporator	BTX	ECM 830 generator
Injector voor acute slice elektroporatie	Eppendorf	FemtoJet Microinjector
Injector voor celtransplantatie (I)	Visual Sonics	Vevo Injector System
Injector voor celtransplantatie (II)	WPI	NANOLITER2010
Magnetische standaard	WPI	M10L Magnetic Stand
Kite Manual Micromanipulator	WPI	KITE-M3-R
Platinum Electrode (I)	Protech International Inc.	CUY-700-1
Platinum Electrode (II)	Protech International Inc.	CUY-700-2
Stalen basisplaat	WPI	5479
Vibratome	Leica	VT1200S
Ander materiaal
Glazen capillairen voor elektroporatie	VWR	1B100-4
Glazen capillairen voor celtransplantatie	Visual Sonics	geleverd door  Visual Sonics
Nuclepore 8 µm whatman membraan	SLS	110414
Organenweefsel kweekschalen	BD Biosciences (Falcon)	353037