Opsporen en karakteriseren van zelf-assemblage van eiwitten in vivo door flow Cytometrie

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een FRET-based flow cytometrie protocol voor het kwantificeren van eiwit zelf montage in zowel S. cerevisiae en HEK293T cellen.

Samenvatting

Eiwit zelf assemblage regelt de eiwit functie en compartimendt cellulaire processen in ruimte en tijd. De huidige methoden om het te bestuderen hebben last van lage gevoeligheid, indirecte Read-outs, beperkte doorvoer en/of bevolkingsniveau in plaats van een resolutie van één cel. We ontwierpen een flow cytometrie-gebaseerde enkelvoudige methodologie die al deze beperkingen behandelt: verspreide Amphifluoristische FRET of DAmFRET. DAmFRET detecteert en kwantificeert eiwit-zelf assemblages door gesensibiliseerde emissie FRET in vivo, maakt implementatie over modelsystemen mogelijk-van gist tot menselijke cellen-en bereikt gevoelige, eencellige, high-throughput Lees-outs, ongeacht eiwit lokalisatie of oplosbaarheid.

Inleiding

Assays voor het bestuderen van homotypische eiwit interacties, of "zelf-assemblage" zijn belangrijk omdat de oligomere toestand en oplosbaarheid van eiwitten dicteren hun functie. Het proteoom is overvloedig met homo-multimers^1,2,3,4, terwijl relatief weinig eiwitten functioneren als monomeren. Eiwitten kunnen ook aberrantly assembleren als gevolg van stress, leeftijd of misregulering, wat leidt tot pathologische veranderingen in activiteit. Het identificeren van de factoren die dergelijke gebeurtenissen, of zelfs de fysieke aard van de assemblages moduleren, is vaak uitzonderlijk uitdagend.

Een groeiend aantal eiwitten zijn nu erkend om zichzelf te monteren met buitengewone cooperativiteit en onbepaalde stoichiometrie, resulterend in hun demenging van andere cellulaire bestanddelen, als eiwit-dichte fasen. Deze hebben de vorm van ongeordende condensaten, zoals druppels en gels, of sterk geordende filamenten, zoals amyloïde vezels. De conformationele fluctuaties in verband met laatstgenoemde maken de initiële vorming, of nucleatie, inherent probabilistisch op moleculair niveau^5,6. Omdat de waarschijnlijkheid van nucleatie schaalt met volume, kan de vorming van dergelijke assemblages zeer stochastisch zijn in de ruimtelijke grenzen van levende cellen^7,8. In het uiterste van stochastische nucleatie-beperkte fasescheiding zijn prionen, hoog geordende eiwit assemblages die slechts zelden nucleaat spontaan, maar eenmaal gevormd, sjabloon hun eigen groei voor onbepaalde tijd. Een dergelijk eiwit, dat bekend staat als ASC, voert een digitale prion-achtige schakelaar uit in de activiteit van aangeboren immuuncellen van zoogdieren. ASC zelf montage wordt nucleated door zijn interactie met specifieke eiwitten die zichzelf hebben oligomerized op bindende pathogeen-of gevaar-geassocieerde moleculaire patronen. De ASC assemblies op hun beurt nucleaat procaspase-1 om zichzelf te monteren en te activeren, wat leidt tot cytokine rijping en pyroptosis van de cel^9,10. De regio van ASC die verantwoordelijk is voor de assemblage behoort tot de Death domein superfamilie, die bestaat uit meer dan 100 leden in het menselijke proteome. Ondanks de cruciale rollen van de dood domeinen in aangeboren immuniteit en geprogrammeerde celdood, de meeste van hen hebben nog niet gekarakteriseerd met betrekking tot zelf-assemblage. De ontdekking en karakterisering van extra eiwitten met dergelijk gedrag zal sterk worden vergemakkelijkt door een directe, eencellige uitlezen van eiwit zelf montage.

Klassieke eiwit biochemie benaderingen om zelf assemblage van eiwitten te bestuderen, zoals grootte-uitsluitings chromatografie en ultracentrifugatie, zijn grotendeels beperkt tot beoordelingen van bevolkingsniveau. Echter, cel-naar-cel heterogeniteit als gevolg van nucleatie-beperkte faseovergangen kunnen niet worden gemodelleerd met dit detailniveau. Eencellige benaderingen op basis van fluorescentiemicroscopie herwinnen deze mogelijkheid, maar missen de doorvoer die nodig is om de nucleatie nauwkeurig te kwantificeren of om zeldzame assemblages te detecteren. Bovendien, oplosbare zelf-assemblages zoals de meeste enzymen en pre-amyloïde oligomeren, zijn te klein en mobiel om te worden opgelost door standaard Lichtmicroscopie. Ze kunnen worden gedetecteerd door meer geavanceerde benaderingen zoals fluorescentie correlatie spectroscopie, maar deze zijn zeer beperkt in het aantal cellen en de doorvoer.

Proximity-gebaseerde assays van eiwit assemblage, zoals fret en Split de complementatie, bieden een mogelijke oplossing voor deze problemen. Echter, ze vereisen in het algemeen het gebruik van twee verschillende constructies uitdrukken van het eiwit van belang gefuseerd aan aanvullende labels-de donor en acceptor fluorofores in het geval van FRET. Dit compromitteert experimentele doorvoer en vermindert ook de gevoeligheid als gevolg van cel-naar-cel variatie in de relatieve niveaus van donor en acceptor. Om dit te omzeilen, ontwierpen we een assay die gebruik maakt van een fotoconvertible fluorophore, mEos 3.1¹¹, waarmee één constructie zowel donor-als acceptor-gelabeld eiwit kan uitdrukken. Het emissiespectrum van niet-geconverteerde mEos 3.1 (GFP-achtige donor) overlapt voldoende met het excitatie spectrum van fotogeconverteerde mEos 3.1 (dsRed-achtige acceptor) om FRET te laten optreden wanneer de moleculen in de buurt zijn (< 10 nm). Dus, door cellen bloot te stellen aan een empirisch bepaalde dosis van 405 nm licht, die een optimale Fractie van totaal mEos 3.1 in de acceptor vorm converteert, bereiken we consistente en reproduceerbare relatieve niveaus van donor en acceptor over meerdere monsters, expressieniveaus en experimenten. We meten de acceptor fluorescentie wanneer opgewonden ofwel rechtstreeks met 561 nm licht, of indirect (door energie overdracht van de donor) met 488 nm licht (d.w.z. gesensibiliseerde emissie FRET). We rapporteren eiwit assemblage als de verhouding van deze twee waarden en term het amphifluoric FRET of AmFRET.

Om de eiwitconcentratie te berekenen door Flowcytometrie, berekenen we eerst de gemiddelde fluorescentie intensiteit van Spc42 gelabeld met mEos 3.1. Omdat gistcellen ongeveer 1000 moleculen van Spc42 bevatten, berekenen we vervolgens de intensiteit van de fluorescentie van een enkele fluorescerende groene mEos 3.1 molecuul. Door gebruik te maken van de gelijkmatige foto conversie bij alle cellulaire concentraties (Figuur 1e), correleren we vervolgens de totale MEOS 3.1 fluorescentie waarden voor alle acceptor-intensiteiten na foto conversie. Vervolgens kunnen we het totale aantal mollen van fluorescerende eiwitten verdelen door het geschatte cytosolische volume (zoals bepaald met behulp van Imaging flow cytometrie) om de totale cytosolische concentratie van het eiwit van belang te verkrijgen. Voor exacte berekeningen raadpleegt u het originele manuscript⁸.

Door de mEos 3.1-gesmolten proteïne uit een 2μ plasmide in gist uit te drukken, geven we een ongeveer duizend-voudige reeks eiwit concentraties in elk monster⁸. We bereiken hetzelfde in HEK293T cellen op grond van variatie in plasmide opname tijdens transfectie, en dus variabel kopie nummer.

De resulterende verdeling van AmFRET, of DAmFRET, voor vele duizenden cellen onthult de concentratie-afhankelijkheid van zelf-assemblage in de cytosol voor elk eiwit van belang. Over het algemeen vertegenwoordigt DAmFRET een faciliterende methodologie om de zelf montage van eiwitten te ontdekken en karakteriseren met een ongekende combinatie van gevoeligheid, doorvoer en reproduceerbaarheid.

Terwijl het gebruik van een beeldvormings cytometer ons in staat stelt om in vivo eiwitconcentratie metingen te verkrijgen, zijn dergelijke Cytometers nog niet beschikbaar bij de meeste onderzoeksinstellingen. Desondanks kan DAmFRET zelfs in een typische niet-beeldvormings cytometer worden uitgevoerd om distributies van eiwit assemblage over het bereik van eiwit expressie te krijgen.

Protocol

1. bereiding van Saccharomyces cerevisiae voor damfret assay

1. Transformeer experimenteel relevante giststammen met een 2μ galactose-indusgebonden plasmide die het eiwit van de belangstelling uitdrukt⁸ gelabeld ofwel op de C of N Terminus met MEOS 3.1 met behulp van een standaard lithium acetaat protocol¹² .
2. Kweek de gist in de vloeibare cultuur.
   1. Voor elke query eiwit, inoculeren gist kolonies (getransformeerd), in drievultaat, elk in 200 μL van geschikte niet-inducerende groeimedia (dat wil zeggen, media met 2% dextrose, gist stikstof basis en aminozuren voor selectie van het plasmide) in een 96-goed plaat ( Afbeelding 1c).
   2. Inincuberen cellen terwijl schudden op een plaat Shaker (Zie de tabel van de materialen) met 1,5 mm baan bij 1200 rpm bij 30 °c gedurende 16 uur.
3. Induceren van het gen van belang (representatief protocol voor 16 h-sommige eiwitten kunnen meer of minder tijd in beslag nemen).
   1. Na 16 h inductie, draai de plaat bij 2200 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT0 om de monsters te pellet.
   2. Verwijder media door krachtige inversie. Respendeer cellen met 200 μL geschikte inductie media (d.w.z. media met 2% galactose, gist stikstof basis en aminozuren voor de selectie van het plasmide). Zie afbeelding 1c.
   3. Incuberen cellen tijdens het schudden bij 30 °C gedurende 12 uur.
   4. Centrifuge (Zie de tabel met materialen) de plaat bij 2200 x g gedurende 2 minuten bij RT om de monsters te pellet. Verwijder media door krachtige inversie. Respendeer cellen met 200 μL van de inductie media.
   5. Inincuberen cellen terwijl schudden bij 1200 rpm bij 30 °C voor nog eens 4 uur. Deze resuspensie in verse media moet gebeuren 4 h voorafgaand aan het runnen van DAmFRET, om de auto-fluorescentie te verminderen.

2. aanmaak van zoogdieren plasmide

1. Bouw een zoogdier vector met een constitutieve promotor en mEos 3.1 met een tijdelijke aanduiding om het gen van belang in te voegen en een linker tussen hen.
   Opmerking: we bouwden een Golden Gate compatible vector, M1, uit een openbaar beschikbaar plasmide (Zie de tabel met materialen) met de volgende wijzigingen: een bestaande bsai-site werd verwijderd door een puntmutatie G naar a (op positie 3719 volgens de gestorte sequentie). MEOS 3.1 werd verkregen door middel van door de site gestuurde mutagenese van de de op I157V. Geïnverteerde BsaI-sites gevolgd door 4x (EAAAR) linker werden ingevoegd, door Gibson assembly, in-frame tussen CMV promoter en mEos 3.1 voor de productie van de laatste M1 vector. Eiwit expressie wordt gedreven door CMV Enhancer en promotor; en transcriptie beëindiging door SV40 polyadenylatie signaal.
2. Maak een bibliotheek met wisselplaten, compatibel met de geconstrueerde vector.
   Let op: we bestellen onze inserts voor Golden Gate assembly als synthetische lineaire fragmenten (zie tabel van materialen) geflankeerd door BsaI sites voor ligatie in M1 tussen CMV promoter en 4x (EAAAR)-mEos 3.1.

3. celcultuur en-transfectie van zoogdieren

1. Cultuur HEK293T cellen in DMEM + 10% FBS + 1x PenStrep media bij 37 °C bij 5% CO₂.
2. Op de dag voorafgaand aan de transfectie, zaad 5 x 10⁵ cellen in een 6-goed bord met 2 ml media.
3. Transfect cellen met 2 μg plasmide DNA met behulp van een transfectie reagens (Zie de tabel van de materialen) in een verhouding van 3:1 (transfectie reagens: DNA). Meng de componenten in 150 μL van verlaagde serum media (Zie de tabel met materialen) en inbroed het op RT gedurende 15 minuten, voeg de mix toe aan elke put en inbroed voor 48 h voor eiwit expressie.
4. Bevestig de eiwit expressie na 24 uur met epifluorescentie microscopie (488 nm excitatie, 515 nm-emissie).

4. bereiding van zoogdiercellen voor DAmFRET assay

1. Na 48 h eiwit expressie, verwijder de media van elke put en reinig de cellen zorgvuldig met 1 mL 37 °C fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Na het wassen, aspireren de PBS.
2. Voeg 0,5 mL trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (0,25%) en incuberen gedurende 5 min bij 37 °C.
3. Voeg 0,5 mL volledige DMEM-media toe aan elk goed, hervat de cellen en zorg ervoor dat er geen grote klonters zichtbaar zijn.
4. Breng het hele volume van elk goed over in 1,5 mL tubes.
5. Spin cellen gedurende 5 min bij 1000 x g bij kamertemperatuur (RT).
6. Verwijder de supernatant-en respendeer celpellet in 1 mL PBS + 10 mM EDTA.
7. Draai de cellen 5 min bij 1000 x g bij RT.
8. Verwijder het supernatant en rebreng de celpellet in 1 mL 4% Paraformaldehyde (PFA) + 10 mM EDTA in PBS.
9. Repareer cellen gedurende 5 minuten op een schudtafel met constante beweging.
10. Spin cellen gedurende 5 min bij 1000 x g bij RT.
11. Verwijder de supernatant en rebreng de celpellet in 1 mL PBS + 10 mM EDTA.
12. Spin cellen gedurende 5 min bij 1000 x g bij RT.
13. Verwijder het supernatant en hervat de cellen in voldoende buffervolume voor de cytometrie-run (voor 1 put van een 96-put-plaat gebruik 200 μL PBS + 10 mM EDTA).
14. Breng de geresuspendeerde cellen over naar een put van een ronde bodem 96-well plate.

5. foto conversie van gist en zoogdiercellen voor de bepaling

1. Fotoconversie monsters in een microplaat zonder afdekking met behulp van een UV-lamp (Zie de tabel van de materialen) uitgerust met een 320-500 nm (violet) filter en een straal collimator, gepositioneerd 45 cm boven de plaat, voor een duur van 25 minuten tijdens het schudden. Deze voorwaarden zijn geschikt wanneer de bundel macht aan de plaat is 11,25 MW/cm², met ongeveer 17.000 MJ/cm² van de totale foton dosis⁸.

6. DAmFRET-gegevensverzameling

1. Testcellen met behulp van een cytometer met niet-collineaire 488/561 lasers. De volgende gegevens zijn de minimale vereisten voor de berekening van FRET.
   1. Gebruik een 488 nm excitatie/515 nm emissie kanaal voor de inzameling van de donor fluorescentie.
   2. Gebruik een 488 nm excitatie/595 nm-emissie kanaal voor het verzamelen van de fluorescentie van het FRET-signaal.
   3. Gebruik een 561 nm excitatie/595 nm emissie kanaal (niet-collineair met het 488/595 kanaal) voor het verzamelen van de acceptor fluorescentie.
   4. Gebruik een 405 nm excitatie/457 nm emissie kanaal voor de collectie van autofluorescentie⁸.
   5. Maak gebruik van een brightfield-beeld kanaal voor volumeberekening.
      Opmerking: beeldvormings cytometer instellingen voor S. cerevisiae zijn als volgt: 60x doelstelling bij lage stroomsnelheid en hoge gevoeligheid; Laser krachten ingesteld op 405 Nm bij 15 mW, 488 Nm bij 15 mW, 561 Nm bij 20 mW. beeldvormings cytometer instellingen voor HEK293T cellen zijn als volgt: 40x doelstelling bij lage stroomsnelheid en hoge gevoeligheid; Laser krachten ingesteld op 405 Nm bij 15 mW, 488 Nm bij 15 mW, 561 Nm bij 20 mW. ook merk op dat onze beeldvormings cytometer speciaal ontworpen was om ruimtelijk gescheiden 488 nm en 561 nm lasers (d.w.z. op verschillende camera's) te hebben om een heldere resolutie van FRET van acceptor fluorescen te verkrijgen. Ce.
2. Verzamel gegevens voor 20000-50000 losse cellen per sample binnen een fluorescentie-positieve poort.
   1. Poort enkele cellen door een hoge beeldverhouding en een klein celgebied in tegenstelling tot samengeklonteerde cellen of puin die een lage beeldverhouding en grote of zeer kleine celgebieden zouden hebben respectievelijk.
      Opmerking: de equivalente parameters in een niet-Imaging cytometer zijn FSC (forward Scatter) voor de geschatte Celgrootte en SSC (side Scatter) voor celgranulariteit. Gebruik bovendien de FSC Pulse Height versus Pulse Width als proxy voor het gating van één cel. Bovendien is het cruciaal om geen gebeurtenissen te verzamelen die fluorescentie waarden hebben die de bovengrens van de gevoeligheid van de cytometer overschreden. In onze beeldvormings cytometer beperken we de verzameling van gebeurtenissen tot een onbewerkte maximale pixelwaarde van één minder dan de verzadigings limiet voor elk TL-kanaal dat we verzamelen. Evenzo moeten voor conventionele Flow-Cytometers gegevenspunten in de hoogste-intensiteits opslaglocatie (waaronder gebeurtenissen die buiten het dynamische detectiebereik vallen) niet worden geanalyseerd.

7. gegevensanalyse

1. Voer compensatie uit met een niet-fotogeconverteerd mEos 3.1-monster voor het zuivere donor signaal en monomerische DsRed2, dat een vergelijkbaar spectrum heeft met de rode vorm van mEos 3.1, voor het zuivere acceptor-signaal¹³. Voor meer gevoeligheid, zorg ervoor dat de FRET detector kanaal wordt ook beschouwd als een spillover doel, in het analyseprogramma.
2. Voorbeelden van de poort voor het selecteren van slechts enkele cellen die fluorescentie-positief zijn (zoals in Figuur 2).
3. Bereken de AmFRET parameter als de verhouding van het totale FRET signaal (488ex/595em) gedeeld door het totale FRET acceptor (561ex/595em) signaal.
4. Visualiseer gegevens met behulp van een flow-cytometrie-software (Zie de tabel met materialen).
   Opmerking: cytosolische concentraties voor S. cerevisiae in deze studie werden berekend met de onderstaande instellingen zoals in Khan et al.⁸. Data-analyse werd uitgevoerd met behulp van flow flowcytometrieonderzoeken software (Zie tabel van de materialen).

Resultaten

Detectie van oligomeren die niet puncta vormen

We hebben eerder DAmFRET toegepast voor de karakterisering van eiwit fase scheiding, wat meestal resulteert in de vorming van grote eiwit assemblages die ook kunnen worden gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie. Om de toepasbaarheid van DAmFRET te demonstreren aan diffractie-beperkte eiwit assemblages, analyseerden we een biologisch goed gekarakteriseerd eiwit dat discrete homo-heptamers vormt die veel te klein zijn om te worden gevisualiseerd door Lichtmicroscopie: de menselijke Co-chaperonin, HSPE1¹⁴. We vergeleek de DAmFRET profielen van gistcellen die mEos 3.1 alleen uitdrukken, of HSPE1-mEos 3.1. De laatste vertoonde uniforme positieve AmFRET-waarden, terwijl de eerstgenoemde verwaarloosbaar AmFRET vertoonde (Figuur 3a). De beelden van cellen verkregen door de Imaging flow cytometer (Zie de tabel met materialen) toonden diffuse fluorescentie in alle kanalen-donor, fret en acceptor, voor zowel MEOS 3.1-en HSPE1-MEOS 3.1-uitdrukken cellen (Figuur 3b). Om deze bevinding bij een hogere optische resolutie te bevestigen, gebruikten we confocale microscopie om z-stacks voor meerdere velden cellen vast te leggen. Inderdaad, de fluorescentie werd gelijkmatig verdeeld over het cytosol, zonder detecteerbare puncta, of de cellen uitgedrukt HSPE1-MEOS 3.1 of de de alleen (figuur 3c). Merk op dat de gekenmerkte K_d van HSPE1 ongeveer 3 μM is die iets onder de gevoeligheid van ons systeem ligt, en daarom observeren we niet de sigmoïdale relatie van fret tot concentratie die verwacht zou worden voor dit discrete homo-Oligomeer. Desalniettemin concluderen we dat DAmFRET in vivo bij een enkele celresolutie een robuuste, oplosbare homo-oligomerisatie detecteert.

Detectie van nucleatie-beperkte assemblages

Om het vermogen van DAmFRET te demonstreren om discrete homo-oligomeren te onderscheiden van nucleatie-beperkte assemblages zoals prionen, analyseerden we het humane ontstekings eiwit ASC. Terwijl WT ASC^pyd vormen filamenten in vivo, de inactieve R41E Mutant van ASC^pyd niet^9,10. We uitgedrukt in gistcellen ofwel mEos 3.1 alleen, of mEos 3.1 gesmolten met ofwel WT of R41E ASC^pyd. Gistcellen die de de alleen of de Mutante vorm van ASC^pyd uitdrukken, vertoonden een verwaarloosbare amfret over het gehele concentratiebereik, wat duidt op een onvermogen om zelf te interageren. WT ASC^pyd toonde daarentegen een damfret profiel met twee populaties: één met verwaarloosbare amfret en de andere met hoge amfret (figuur 4a). Zoals bevestigd door de fluorescentie beelden (figuur 4b), vertegenwoordigen deze populaties cellen die alleen oplosbaar eiwit bevatten of in plaats daarvan voornamelijk zelfgeassembleerd eiwit bevatten. De discontinue relatie tussen de populaties, en het feit dat ze optreden bij overlappende concentraties geeft aan dat een nucleatie barrière de monomere vorm van het eiwit stabiliseert en het kan houden van de montage gedurende de duur van het experiment ⁸. de kloof in amfret tussen de twee populaties geeft aan dat, zodra nucleatie optreedt, het in de buurt ogenblikkelijk sjablonen andere monomeren naar de geassembleerde vorm en bereikt een nieuwe steady state niveau van amfret. DAmFRET bevestigt eerdere structurele gegevens dat het punt Mutant ASC^pyd R41E verstoorde nucleatie over de concentraties die haalbaar zijn door dit expressie systeem (figuur 4a).

Toepasselijkheid van DAmFRET in zoogdiercellen

Hoewel gistcellen ideaal zijn voor DAmFRET, willen we de toepasbaarheid van DAmFRET uitbreiden tot zoogdiercellen. Om celdood te voorkomen, veroorzaakt door functionele ASC Polymers, testten we DAmFRET in HEK293T cellen die geen caspase-1 expressie hebben. We hebben dezelfde eiwitten in HEK293T cellen uitgedrukt als in gistcellen in figuur 4a. De resulterende DAmFRET profielen in HEK293T cellen lijken kwalitatief op die in gistcellen (figuren 4a,C). DAmFRET fungeert dus als de meest veelzijdige in vivo-methode voor het opsporen en kwantificeren van nucleated proteïne-zelf assemblages bij een enkelvoudige celresolutie met een hoge doorvoer, ongeacht zowel de aanwezigheid van microscopisch zichtbare puncta als het celtype.

Figuur 1 : Overzicht van het experimentele ontwerp S. cerevisiae. Dit cijfer is aangepast van Khan et al.⁸ met toestemming. (A) 2μ plasmide kaart met het open Lees frame voor het eiwit van belang, getagd met Photoconvertible MEOS 3.1 en gedreven door een oninductibele promotor. B) wanneer het in gistcellen wordt omgezet, leidt het 2μ-systeem van replicatie tot een hoog aantal variabiliteit tussen cellen. Deze variatie, gecombineerd met het transcriptionele lawaai van de GAL1-promotor, resulteert in een brede verdeling van de eiwit expressie in een populatie van cellen. C) experimenteel overzicht voor gist damfret assay. Om gezonde cellen voor de test te waarborgen, worden kolonies eerst geïnocculeerd voor proliferatie van meer dan 16 uur in synthetische media met de niet-inducerende koolstofbron, dextrose. Na proliferatie worden cellen overgebracht naar synthetische media met de inducerende koolstofbron, galactose, voor 16 uur. Na inductie worden cellen gedeeltelijk en uniform fotogeconverteerd door blootstelling aan 405 nm licht. (D) monsters worden vervolgens geanalyseerd met behulp van Imaging flow cytometrie. De spectra en intensiteiten van groene en rode mEos 3.1 maken ze zeer geschikt voor respectievelijk een FRET donor en acceptor. Wanneer in de nabijheid van elkaar, zoals in het polymeer afgebeeld in de onderste cel, de rode moleculen zal fluorescentie bij excitatie van groene moleculen (FRET). E) plot van donor-versus aanvaardintensiteiten die een strakke lineaire relatie vertonen bij foto conversie, waaruit blijkt dat de efficiëntie van de foto conversie niet wordt beïnvloed door het uitdrukkings niveau. F) verstrooiings plot van de gemiddelde acceptor versus donor intensiteiten van populaties cellen die een verscheidenheid aan MEOS-gelabelde eiwitten uitdrukken, in zowel oplosbare als amyloïde vormen, waaruit blijkt dat de efficiëntie van de foto conversie niet wordt beïnvloed door de fusie partner of oplosbaarheid (foutbalken geven de standaarddeviatie van biologische triplicaten aan). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2 : Damfret gating strategie voor Imaging flow cytometrie data. Gating strategie gebruikt voor het analyseren van alleen gericht, niet-gebudded enkelvoudige cellen met een lage auto fluorescentie en uitdrukken het fluorescerende eiwit. A) de hiërarchie van poorten voor het verkrijgen van goed gerichte, levende, enkelvoudige cellen voor analyse. B) histogram van de GRADIËNT RMS van het brightfield-kanaal. Deze meting maakt het mogelijk om cellen te selecteren die op de juiste manier onder uitgezonden licht zijn gericht. C) dichtheids plot van circulariteit versus gebied dat de gated populatie van niet-ontrodeerde sferische enkelvoudige cellen weergeeft. D) dichtheids grafiek met de intensiteit van de auto fluorescentie (Ch07) versus de donor fluorescentie (Ch02) die afzonderlijke populaties van cellen (gated) en donkere cellen weergeeft. E) spreidingsdiagram van donor-versus aanvaardintensiteiten die een duidelijk verlies van de donor fluorescentie in een subgroep van cellen vertonen, als gevolg van de fret tussen de donor en de acceptor fluoroforen. F) laatste damfret-plot. Cellen met niet-geassembleerd eiwit zijn gecentreerd rond Zero AmFRET, terwijl cellen met zelf-geassembleerd eiwit een positieve AmFRET-waarde vertonen. Twee overlappende populaties in het perceel zijn indicatief voor een eindige barrière voor het nucleeren van dat eiwit in hogere-orde assemblages zoals amyloïden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3 : Representatieve gegevens van monomere en heptamerische eiwitten door Flowcytometrie en microscopie. (A) damfret Profiel van monomere MEOS 3.1-eiwitten (links) en heptameric HSPE1 gelabeld met MEOS 3.1 (rechts) met verhoogde RATIOMETRISCHE fret als gevolg van homotypische assemblage. B) beelden van de cytometer, van cellen die MEOS 3.1 (links) en HSPE1 (rechts) weergeven die in alle vastgelegde kanalen worden getoond. C) representatieve beelden van gistcellen die monomere MEOS 3.1 (links) en HSPE1 (rechts) uitdrukken. De afbeeldingen zijn somprojecties van confocale segmenten. Ten minste 50 cellen werden afgebeeld om deze waarneming te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4 : Damfret-profielen vertonen soortgelijk zelf-assemblage gedrag van humane ASC^pyd eiwitten in S. cerevisiae en HEK293T cellen. A) dichtheids percelen met amfret versus cytosolische concentratie (in μM) van MEOS 3.1 (links), of MEOS 3.1 gesmolten tot WT (midden) of monomerizing Mutant van ASC^pyd (rechts) in S. cerevisiae. B) beelden van de cytometer, van cellen van de onderste en bovenste poort (respectievelijk linker-en middenpanelen) die WT ASC^pyduitdrukken; en van cellen die ASC^pyd R41E van de aangegeven poort (rechter paneel) uitdrukken. C) dichtheids percelen die de intensiteit van amfret versus acceptor weergeven voor dezelfde reeks eiwitten als in (a) maar uitgedrukt in HEK293T cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

DAmFRET is de meest uitgebreide methode om zelf montage van eiwitten in vivo te detecteren. DAmFRET combineert direct uitlezen van homotypische eiwit-eiwit interacties over een breed scala aan concentraties, met een enkelvoudige celresolutie en een hoge doorvoer. De directe read-out van DAmFRET en het feit dat de gesmolten eiwitten geen specifieke subcellulaire lokalisatie of onoplosbare toestand vereisen, elimineert valse positieven en breidt de toepasbaarheid ervan uit tot een breed scala aan eiwitten op hun inheemse subcellulaire locaties. Met name door het labelen van organellen met fluoroforen die spectraaal compatibel zijn met mEos 3.1, zoals T-Sapphire en mCardinal, kan de subcellulaire lokalisatie van oplosbare en geassembleerde vormen van eiwitten samen met DAmFRET worden bepaald.

Met behulp van de Imaging flow cytometer zoals hier beschreven, duurt het 8 uur om een 96-goed plaat te analyseren met ongeveer 20.000 gated cellen per put. We voeren echter ook routinematig DAmFRET uit met standaard (niet-beeldvormende) Cytometers die een veel hogere doorvoer bereiken (tot 20 samples per minuut). In feite is elke flow-cytometer met ruimtelijk gescheiden 488-en 561 nm-lasers die vrij is van logamp-artefacten en beschikt over de juiste PMTs en filters voor het opsporen van donor-, FRET-en acceptor-signalen voldoende om DAmFRET uit te voeren. Op dit moment komt deze winst in doorvoer ten koste van lokalisatie-informatie en volume bepaling, zodat zelf montage vervolgens moet worden geanalyseerd als een functie van eiwit expressie in plaats van concentratie. Dit is geen probleem voor kwalitatieve analyses. Bovendien kan het mogelijk zijn om het cytosolische volume te schatten door een spectraaal verschillende de te fusing naar een endogene "huishoud eiwit" waarvan de uitdrukking strak correleert met cytosolische volume.

Zoals we hebben laten zien door onze inzet van DAmFRET in zowel gist als zoogdiercellen, kan DAmFRET gemakkelijk worden aangepast aan verschillende uitdrukkings systemen. Hierdoor kan de zelf montage van eiwitten in hun inheemse cellulaire contexten worden bestudeerd. Bovendien biedt het de mogelijkheid om eiwit assemblage te vergelijken in zeer uiteenlopende celcultuurmodellen om het behoud van mechanismen te bestuderen die de zelf montage van eiwitten beheersen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
96 Well Plate	Axygen	P96-450R-C-S
ASC 2-92 (mammalian plasmid)		rhm1.0095	Beschikbaar op aanvraag
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid)		rhm1.0096	Beschikbaar op aanvraag
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid)		rhx2432	Beschikbaar op aanvraag
ASC 2-92 (yeast plasmid)		rhx2431	Beschikbaar op aanvraag
Centrifuge	Eppendorf	5430R	"centrifuge" in tekst
CSM -Ura	Sunrise Science Products	1004-100
Dextrose	EMD Millipore	DX0145-5
DMEM	Gibco	11966025
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-500G
FCS Express 6	DeNovo	FCS Express 6 Flow	"flowcytometrie software" in tekst
Fetal Bovine Serum	VWR Life Science	45001-108
Flow Cytometer	BioRad	ZE5	Niet-beeldende flowcytometer
FUGENE HD	Promega	E2311	"transfectiereagens" in tekst
Galactose	VWR Life Science	0637-500g
HSPE1 (yeast plasmid)		rhx1531	Beschikbaar op aanvraag
Imaging Flow Cytometer	EMD Millipore	ImageStream X Mark II	"beeldende flowcytometer" in tekst
Mammalian Cells		HEK293T
mEos3.1 (mammalian plasmid)		rhm1	Beschikbaar op aanvraag
mEos3.1 (yeast plasmid)		rhx0935	Beschikbaar op aanvraag
optiMEM	Gibco	31985062	"gereduceerd serummedium" in tekst
PBS	VWR Life Science	45000-446
PenStrep	Gibco	15070063
PFA	Sigma-Aldrich	P6148-1KG
Photoconversion Lamp	OmniCure	S1000
Plasmid #54525	Addgene	#54525	"publiek beschikbaar plasmide" in tekst
Titramax 1000 Plate Shaker	Heidolph Instruments	1000	"plaatjesschudder" in tekst
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
Yeast Strain		rhy1713	Beschikbaar op aanvraag - S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ::GAL1pr_WHI5_hphMX)