Methodenartikel

Naar buiten kijken: isolatie van Cyanobacteriële vrijgekomen Koolhydraatpolymeren en eiwitten

DOI:

10.3791/59590

⸱

27 mei 2019

 , 
1Bioengineering and Synthetic Microbiology Group, Instituto de Investigação e Inovação em Saude, Universidade do Porto, 2Instituto de Biologia Celular e Molecular, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, 4Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier worden protocollen voor de isolatie van cyanobacteriële vrijkomende koolhydraatpolymeren en isolatie van hun exoproteomes beschreven. Beide procedures belichamen belangrijke stappen voor het verkrijgen van polymeren of eiwitten met hoge zuiverheids graden die kunnen worden gebruikt voor verdere analyse of toepassingen. Ze kunnen ook eenvoudig worden aangepast aan de specifieke behoeften van de gebruiker.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyanobacteriën kunnen een breed scala van biomoleules actief afscheiden in de extracellulaire omgeving, zoals heteropolysacchariden en eiwitten. De identificatie en karakterisering van deze biomoleules kan de kennis over hun secretie trajecten verbeteren en helpen om ze te manipuleren. Bovendien zijn sommige van deze biomoleules ook interessant in termen van biotechnologische toepassingen. Hier beschreven zijn twee protocollen voor eenvoudige en snelle isolatie van cyanobacteriële vrijgekomen koolhydraatpolymeren en eiwitten. De methode voor isolatie van vrijgekomen koolhydraatpolymeren is gebaseerd op conventionele precipitatie technieken van polysacchariden in waterige oplossingen met behulp van organische oplosmiddelen. Deze methode behoudt de eigenschappen van het polymeer en vermijdt tegelijkertijd de aanwezigheid van verontreinigingen uit celvuil en kweekmedium. Aan het einde van het proces is het gelyofiliseerd polymeer klaar om te worden gebruikt of gekarakteriseerd of kan het worden onderworpen aan verdere zuiverings rondes, afhankelijk van het uiteindelijke beoogde gebruik. Met betrekking tot de isolatie van het cyanobacteriële exoproteome, is de techniek gebaseerd op de concentratie van het cel vrije medium na verwijdering van de grote verontreinigingen door centrifugeren en filtratie. Deze strategie zorgt voor een betrouwbare isolatie van eiwitten die de extracellulaire milieu bereiken via membraan transporteurs of buitenste membraan blaasjes. Deze eiwitten kunnen vervolgens worden geïdentificeerd met behulp van standaard massaspectrometrie technieken. De hier gepresenteerde protocollen kunnen niet alleen worden toegepast op een breed scala aan cyanobacteriën, maar ook op andere bacteriële stammen. Bovendien kunnen deze procedures eenvoudig worden aangepast aan het uiteindelijke gebruik van de producten, de vereiste zuiverheid en de bacteriestam.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyanobacteriën worden alom erkend als productieve bronnen van natuurlijke producten met veelbelovende biotechnologische/biomedische toepassingen. Daarom zijn het begrijpen van cyanobacteriële secretie mechanismen en optimalisatie van de extractie/herstelmethoden essentieel om cyanobacteriën te implementeren als efficiënte microbiële celfabrieken.

Veel cyanobacteriële stammen zijn in staat om extracellulaire polymere stoffen (EPS) te produceren, voornamelijk gevormd door heteropolysacchariden, die verbonden blijven met het celoppervlak of vrijkomen in het medium1. Deze vrijgegeven koolhydraatpolymeren hebben verschillende kenmerken in vergelijking met die van andere bacteriën, die ze geschikt maken voor een breed scala aan toepassingen (bijv. antivirale middelen2, immunostimulerende3, antioxidant4, metaal-chelating5, emulgerende6, en drug delivery agenten7,8). Methodologie voor de isolatie van deze polymeren draagt niet alleen bij tot een betere opbrengst, maar ook tot meer zuiverheid en de specifieke fysische eigenschappen van het verkregen polymeer9. Een overgrote meerderheid van deze methoden voor isolatie van de polymeren is afhankelijk van neerslag strategieën uit het cultuurmedium die gemakkelijk kunnen worden bereikt door de sterke anionische natuur van het polymeer9,10. Bovendien kan het verwijderen van de oplosmiddelen die in de precipitatie stap worden gebruikt, snel worden bereikt door verdamping en/of lyofilisatie. Afhankelijk van de voorziene toepassing, kunnen verschillende stappen worden gekoppeld, hetzij na of vóór polymeer precipitatie om het eindproduct af te stemmen, waaronder Trichloorazijnzuur (TCA) behandeling, filtratie of grootte uitsluitings chromatografie (SEC) kolom zuivering10.

Cyanobacteriën kunnen ook een breed scala aan eiwitten afscheiden door middel van trajecten die afhankelijk zijn van membraan transporteurs (klassiek)11 of gemedieerd door blaasjes (niet-klassiek)12. Daarom vormt de analyse van het cyanobacteriële exoproteome een essentieel hulpmiddel om de cyanobacteriële eiwit secretie mechanismen te begrijpen/manipuleren en de specifieke extracellulaire functie van deze eiwitten te begrijpen. Betrouwbare isolatie en analyse van exoproteomes vereisen de concentratie van de extracellulaire milieu, omdat de overvloed van uitgescheiden eiwitten relatief laag is. Daarnaast kunnen andere fysische of chemische stappen (bijv. centrifugeren, filtratie of eiwit precipitatie) de kwaliteit van het verkregen exoproteome optimaliseren, het eiwitgehalte13verrijken en de aanwezigheid van verontreinigingen vermijden (bijv. pigmenten, koolhydraten, enz.) 14 , 15 of het overwicht van intracellulaire eiwitten in de monsters. Echter, sommige van deze stappen kunnen ook beperken de set van eiwitten die kunnen worden gedetecteerd, leidt tot een bevooroordeelde analyse.

Dit werk beschrijft efficiënte protocollen voor de isolatie van vrijgekomen koolhydraatpolymeren en exoproteomes van cyanobacteriën culture media. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast aan de specifieke doelstellingen van de studie en de behoeften van de gebruiker, met behoud van de basisstappen die hier worden gepresenteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. cyanobacteriële vrijgekomen koolhydraat polymeer isolatie

  1. Polymeer isolatie en verwijdering van verontreinigingen
    1. Cultiveer de cyanobacteriële stam onder standaardomstandigheden [bv. 30 °C onder een licht van 12 uur (50 μE m− 2s− 1)/12 h donker regime, met orbitaal schudden bij 150 rpm]. Meet de groei met behulp van standaardprotocollen [bv. optische dichtheid bij 730 nm (OD730nm), chlorofyl a, drooggewicht, enz.], en meet vervolgens de productie van vrijgekomen polysacchariden volgens de fenol-zwavelzuur methode16.
    2. Breng de cultuur over in dialyse membranen (12-14 kDa van het molecuulgewicht cut-off) en dialyze tegen minimaal 10 volumes gedeïoniseerd water gedurende 24 uur met continu roeren.
      Opmerking: afhankelijk van het volume van de cultuur te dialyze en medium samenstelling, kan het nodig zijn om het dialyse water te veranderen.
    3. Centrifugeer de kweek op 15.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Breng de supernatant over naar een nieuwe injectieflacon en gooi de pellet (cellen) weg.
    4. Centrifugeer opnieuw bij 20.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c om verontreinigingen zoals celwand resten of lipopolysacchariden (LPS) te verwijderen.
    5. Breng de supernatant over naar een glas beker en gooi de pellet weg.
  2. Precipitatie van het polymeer
    1. Voeg 2 volumes van 96% ethanol toe aan het supernatant.
    2. Inincuberen van de suspensie bij 4 °C, ten minste 's nachts.
    3. Polymer Recovery
      1. Voor kleine of niet zichtbare hoeveelheden neergeprecipiteerd polymeer: Centrifugeer de suspensie bij 13.000 x g gedurende 25 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg en regeer de pellet in 1 mL of 2 mL autoclaaf gedeïoniseerd water. Breng de waterige suspensie over naar een injectieflacon.
        Let op: het supernatant moet voorzichtig worden weggegooid, omdat het gemakkelijk kan worden geresuspendeerd.
      2. Voor zichtbare/grote hoeveelheden neergeprecipiteerd polymeer: Verzamel het neergeprecipiteerde polymeer met steriele metalen Tang naar een injectieflacon. Knijp in het polymeer en gooi de overtollige ethanol weg.
    4. Facultatief: afhankelijk van de mate van polymeer zuivering vereist, herhaal de precipitatie stap met 96% ethanol na resuspensie van de polymeren in gedeïoniseerd water.
  3. Lyofilisatie van het polymeer
    1. Bewaar de flacons met het neergeprecipiteerde polymeer bij-80 °C, ten minste 's nachts.
    2. Vriesdrogen (lyophilize) het polymeer voor ten minste 48 h (laat de suspensie niet ontdooien voor vriesdrogen).
    3. Bewaar het gedroogde polymeer op kamertemperatuur (RT) tot verder gebruik.
      Opmerking: het is raadzaam om het polymeer in een exsiccator op te slaan, omdat het water na verloop van tijd kan absorberen.

2. cyanobacteriële exoproteome isolatie

  1. Gemiddelde concentratie
    1. Cultiveer cyanobacteriën onder standaardomstandigheden [bv. 30 °C onder een licht van 12 uur (50 μE m− 2s− 1)/12 h donker regime, met orbitaal schudden bij 150 rpm]. Controleer de groei van cyanobacterium met behulp van standaardprocedures (bijv. od730nm, chlorofyl a, drooggewicht, enz.).
    2. Centrifugeer de culturen op 4.000 x g, gedurende 10 minuten bij RT.
    3. Breng de supernatant over in een kolf en gooi de celpellet weg.
    4. Filtreer het decanteerde medium door een filter van 0,2 μm poriegrootte.
      Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken voor een korte tijdsperiode, als het medium op 4 °C wordt gehouden.
    5. Concentreer het medium ongeveer 500x (gezien het aanvankelijke volume van het gefilterde medium), met behulp van centrifugale concentrators met een nominale moleculaire gewichts uitschakeling van 3 kDa. Centrifugeren dient te worden uitgevoerd op 4.000 x g (maximaal 1 uur per centrifugeren-ronde) bij 15 °c.
      Let op: voor de meeste concentratormerken moet het filterapparaat worden gespoeld door centrifugeren met ultrapuur water voor gebruik. Als het filter NAT is, laat het dan niet uitdrogen. Laat voldoende vloeistof op het reservoir wanneer het apparaat niet wordt gebruikt.
      Opmerking: het verlagen van de Centrifugeer temperatuur tot 4 °C kan nuttig zijn als het de bedoeling is om de eiwit activiteit te bestuderen, hoewel dit de benodigde tijd voor de monsterconcentratie zal verhogen. Het protocol kan gedurende korte perioden tussen de Centrifugeer stappen worden onderbroken als het medium op 4 °C wordt gehouden.
    6. Spoel de wanden van het monster reservoir van het filterapparaat af met het geconcentreerde monster en breng de inhoud over naar een micro centrifugebuis.
    7. Voer een extra wasstap van het filterapparaat monster reservoir met geautoclaveerd kweekmedium om te zorgen voor maximale exoproteome herstel.
      Opmerking: Volg de instructies van de specifieke fabrikant om het percentage van het herstel te kwantificeren.
    8. Bewaar de exoproteome monsters bij-20 °C tot verder gebruik.
      Opmerking: toevoeging van proteaseremmers wordt aanbevolen voor langdurige opslag.
  2. Analyse van het exoproteome
    1. Kwantificeer het eiwitgehalte door BCA-eiwit assay in 96-well plate volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Scheid de eiwitten met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) met behulp van standaard kleurings protocollen (bijv. Coomassie blauw, zilver kleuring).
    3. Knip de bands/gel-gebieden van belang en Verzamel ze in verschillende microcentrifugebuisjes met geschikte volumes Ultra zuiver water.
    4. Doorgaan met de identificatie en analyse van de eiwitten door massaspectrometrie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische weergave van de methode die wordt beschreven om vrijgekomen koolhydraatpolymeren uit cyanobacteriële culturen te halen, wordt afgebeeld in Figuur 1. Geprecipiteerde polymeren van de gematigde EPS-producent cyanobacterium Synechocystis SP. pcc 6803 en de efficiënte EPS-producent cyanothece sp. ccy 0110 worden weergegeven in Figuur 2. In Figuur 3worden gelyofiliseerde polymeren met verschillende mate...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de bacteriële secretie mechanismen beter te begrijpen en de vrijgegeven producten te bestuderen, is het van extreem belang om de efficiënte isolatie en analyse van de in de extracellulaire bacteriële omgeving aanwezige biomoleules te demonstreren (zoals vrijgegeven koolhydraatpolymeren en eiwitten).

Cyanobacteriële extracellulaire koolhydraatpolymeren zijn uiterst complex, voornamelijk als gevolg van het aantal en de proportie van verschillende monosacchariden die samenstelling

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) fondsen via het wedstrijd 2020-Operacional programma voor concurrentievermogen en internationalisering (POCI), Portugal 2020, en door Portugese fondsen via FCT-Fundação para a Ciência e een Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino superieur in het kader van het project POCI-01-0145-FEDER-028779 en de Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DialysemembranenMedicell Membranes Ltd DTV.12000.07Visking Tubing Size 7, Dia 23,8 mm, Breedte 39-41 mm 30m Rol 
Ethanol 96%AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A.4.000.02.02.00Fermentatie ethyl alcohol 96% AGA
PES Filter 0,2 µmFisher Scientific, Lda15206869Spuitfilter polystyreen 33MM 0,2µM STR 
Amicon Ultra-15, Ultracel-3KMerck Millipore Ltd.UFC900324Centrifugaalfilters met een nominale moleculaire gewichtsafsnijding van 3 kDa
Thermo Scientific Pierce BCA Protein AssayFisher Scientific, Lda10741395Groen-naar-blauw, nauwkeurig, detergens-compatibel assayreagens om de totale eiwitconcentratie te meten
Brillant Blue G Colloidal Concentrate Sigma Aldrich Química SLB2025-1EACoomassie blauw 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
  2. Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
  3. Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
  4. Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
  5. Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
  6. Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
  7. Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206(2017).
  8. Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
  9. Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
  10. Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
  11. Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
  12. Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
  13. Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
  14. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  15. Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
  16. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
  17. Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
  18. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565(2015).
  19. Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
  20. Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
  21. Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
  22. Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Koolhydraatpolymeren van cyanobacteri neiwitisolatiepolymeerprecipitatieconcentratie van het exoproteoomcentrifugatiefiltratieethanolprecipitatielyofilisatieprocesmassaspectrometrieadaptatie van bacteri le stammenbiotechnologische toepassingen

Gerelateerde artikelen