Gebruik van Microtiter schotel Radiolabeling voor meervoudige in vivo metingen van Escherichia coli (p) Ppgpp gevolgd door Dunnelaagchromatografie

Llorenç Fernández-Coll; Michael Cashel

doi:10.3791/59595

Methodenartikel

Gebruik van Microtiter schotel Radiolabeling voor meervoudige in vivo metingen van Escherichia coli (p) Ppgpp gevolgd door Dunnelaagchromatografie

DOI:

10.3791/59595

⸱

4 juni 2019

Llorenç Fernández-Coll¹ , Michael Cashel¹

¹Intramural Research Program, Eunice Kennedy Shriver NICHD, NIH

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De groei van van bacteriële culturen in micro titer gerechten vergemakkelijkt een hoge doorvoer bemonstering die meerdere technische en biologische repliceren assays van nucleotide zwembad overvloed, met inbegrip van die van (p) ppgpp. De effecten van groei overgangen veroorzaakt door bronnen van fysiologische stress en herstel van stress kunnen worden gecontroleerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De (p) ppGpp nucleotide fungeert als een wereldwijde regulator in bacteriën in reactie op een verscheidenheid van fysieke en voedings stress. Het heeft een snel begin, in seconden, wat leidt tot accumulatie van niveaus die benaderen of overtreffen die van GTP Pools. Stress omkering gevallen een snelle verdwijning van (p) ppGpp, vaak met een halveringstijd van minder dan een minuut. De aanwezigheid van (p) ppGpp resulteert in veranderingen van cellulaire genexpressie en metabolisme die de schadelijke effecten van stress tegengaan. Gram-negatieve en gram-positieve bacteriën hebben verschillende responsmechanismen, maar beide zijn afhankelijk van (p) ppGpp concentratie. In elk geval is het noodzakelijk om tegelijkertijd veel radioolabeled bacteriële culturen te controleren op tijdsintervallen die kunnen variëren van 10 seconden tot uren tijdens kritieke stress overgangsperioden. Dit protocol behandelt deze technische uitdaging. De methode maakt gebruik van de temperatuur-en Shaker-gestuurde micro titer schotel incubatoren die parallelle monitoring van de groei (extinctie) en snelle bemonstering van gelijkmatig fosfaat-radiolabeled culturen op te lossen en kwantificeren nucleotide Pools door Dunnelaagchromatografie op PEI-cellulose. Kleine hoeveelheden monster zijn nodig voor meerdere technische en biologische replicaties van analyses. Complexe groei overgangen, zoals diauxische groei en snelle (p) ppGpp-omzet percentages kunnen met deze methode kwantitatief worden beoordeeld.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De (p) ppgpp tweede boodschapper is een wereldwijde regulator die de uitdrukking van een groot aantal genen moduleert, inclusief genen voor het synthetiseren van ribosomomen en aminozuren^1,2. Hoewel aanvankelijk ontdekt in Escherichia coli³, (p) ppgpp kan worden gevonden in zowel grampositieve en gram negatieve bacteriën, alsmede in plantaardige chloroplasten⁴^,⁵. Voor E. coli en andere gram-negatieve bacteriën, (p) ppgpp communiceert rechtstreeks met RNA polymerase op twee verschillende sites^6....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Media voorbereiding

Voor MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfoninezuur) media²⁵, gebruik 1/10 volume van 10X Mops zouten, 1/100 volume van 100x micronutriënten oplossing, 3 mm natriumfosfaat voor nachtelijke culturen of 0,2 mm natriumfosfaat voor uniforme labeling met ³²P, 0,2% glucose en 1 μg/mL thiamine (vitamine B1). Voeg indien nodig aminozuren toe bij 40 μg/mL.
1. Voor MOPS zouten, gebruik 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO₄, 95 mm NH₄cl, 2,6 mm K₂dus₄, 5 ΜM CACL₂, 10,56 mm MgCl₂, en 500 mm NaCl. Voeg de verschillende compo....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In E. coli K-12 stammen, de toevoeging van valine provoceert een endogene honger van isoleucine, wat resulteert in een toename van ppGpp niveaus na 5 min³. Cellen die zijn geteeld in MOPS met alle aminozuren, met uitzondering van ILV, werden gelabeld met ³²P zoals aangegeven in Figuur 1. Eenmaal geëtiketteerd, werd 6 μL van 10 mg/mL L-Valine (100 μg/mL eindconcentratie) toegevoegd voor de productie van Isoleucine-verhongering. Monsters werde.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bereiken van de meest uniforme labeling van de cellen is een kritieke stap voor dit protocol. Daarom is het gebruik van gedefinieerde media, zoals MOPS of tris media, van cruciaal belang om variatie van de drager fosfaatconcentraties en specifieke activiteit mogelijk te maken. Fosfaat gebufferde media, zoals M9 of media A, kunnen niet worden gebruikt. De meeste ongedefinieerde media bevatten variabele hoeveelheden fosfaat, zoals lb, vorming en casamino zuren. De fosfaat-isotoop ³³p is een zwakkere emitter .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health en Human Development, NIH.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer
(NH₄)₆(MO₇)₂₄	Fisher Scientifics	A-674
Autoradiografiefilm	Denville scientific inc.	E3218
CaCl₂	J.T.Baker	1-1309
Chloramfenicol	RPI	C61000-25.0
CoCl₂	Fisher Scientifics	C-371
CuSO₄	J.T.Baker	1843
FeSO₄	Fisher Scientifics	I-146
Formic acid	Fisher Biotech	BP1215-500
Glucose	Macron	4912-12
H₃BO₄	Macron	2549-04
H₃PO₄	J.T.Baker	0260-02
K₂SO₄	Sigma	P9458-250G
KH₂PO₄	Fisher Biotech	BP362-500
L-Valine	Sigma	V-6504
MgCl₂	Fisher Scientifics	FL-06-0303
Microplate reader Synergy HT	Biotek	Synergy HT
MnCl₂	Sigma	M-9522
MOPS	Sigma	M1254-1KG
Na₂HPO₄	Mallinckrodt	7892
NaCl	J.T.Baker	3624-01
NaH₂PO₄	Mallinckrodt	7917
NH₄Cl	Sigma	A0171-500G
P-32 radionuclide, orthofosforzuur in 1 mL water (5 mCi)	Perkin Elmer	NEX053005MC
Storage phosphor screen	Kodak	So230
Thermomixer	Eppendorf	5382000015
Thiamine	Sigma	T-4625
TLC PEI cellulose F	Merk-Millipore	1.05579.0001
Tricine	RPI	T2400-500.0
Typhoon 9400 imager	GE Healthcare
ZnSO₄	Fisher Scientifics	Z-68

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ppGpp meting fosfaat radiolabeling nucleotidepoolanalyse monitoring van stressrespons PEI cellulose TLC verwerking van radioactieve monsters analyse van groeicondities

Gebruik van Microtiter schotel Radiolabeling voor meervoudige in vivo metingen van Escherichia coli (p) Ppgpp gevolgd door Dunnelaagchromatografie

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Protocol

Resultaten

Discussie

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Materialen

Referenties

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gerelateerde artikelen