Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatisch vrij diatomaire zuurstof verwijderen uit een watersysteem met behulp van de substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA). Dit protocol beschrijft de expressie, zuivering, en activiteit analyse van deze enzym voor het opruimen van zuurstof.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Enkelvoudige molecuul (SM) microscopie wordt gebruikt in de studie van dynamische moleculaire interacties van de gelabelde biomoleules in real time. Echter, fluoroforen zijn gevoelig voor verlies van signaal via photobleaching door opgeloste zuurstof (O2). Om fotobleking te voorkomen en de levensduur van de te verlengen, worden zuurstof opruimings systemen (OSS) gebruikt om O2te verminderen. In de handel verkrijgbare OSS kan verontreinigd zijn door nucleasen die nucleïnezuren beschadigen of degraderen, waardoor de experimentele resultaten worden geïnterpreteerd. Hier gedetailleerd een protocol voor de expressie en zuivering van zeer actieve Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) zonder detecteerbare Nuclease besmetting. PCD kan efficiënt verwijderen reactieve O2 soorten door omzetting van het substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA) 3-Carboxy-CIS, CIS-muconic Acid. Deze methode kan worden gebruikt in elk watersysteem waarbij O2 een nadelige rol speelt bij het verzamelen van gegevens. Deze methode is effectief in het produceren van zeer actieve, Nuclease vrije PCD in vergelijking met commercieel beschikbare PCD.
Inleiding
Single molecuul (SM) biofysica is een snel groeiend veld dat de manier waarop we naar biologische fenomenen kijken verandert. Dit veld heeft de unieke mogelijkheid om fundamentele wetten van de fysica en chemie te koppelen aan de biologie. Fluorescentiemicroscopie is een biofysische methode die SM-gevoeligheid kan bereiken. Fluorescentie wordt gebruikt om biomoleules te detecteren door ze te koppelen aan kleine organische fluor Foren of Quantum dots1. Deze moleculen kunnen fotonen uitzenden wanneer ze opgewonden worden door lasers voordat ze onomkeerbaar2fotobleaching. Fotobleaching treedt op wanneer de fluorescerende et....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. induceren PCD expressie in E. coli
- Combineer 1 μL pVP91A-pcaHG-expressie plasmide (20 ng/μL, Figuur 1A) en 20 μl E. coli BL21 (in de handel verkrijgbare cellen van 20 μl, > 2 x 106 CFU/μg plasmide) in een buisje. Veeg de buis om te mengen. Plaats de buis op ijs 5 min.
- Plaats de transformatie bij 42 °C gedurende 30 sec. Vervolgens ijs 2 min.
- Voeg 80 μL Soc-media (Super optimale bouillon met van-onderdrukking: 2,5 mm KCl, 10 mm NaCl, 2% Tryptone, 0,5% gistextract, 10 mm MgSO4, 10 mm MgCl2, 20 mm glucose) toe. Schud bij 225 omwentelingen per ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In de handel verkrijgbare zuurstof Scavenger PCD is vaak verontreinigd met een DNA-Nuclease. Contaminerende Nuclease activiteit kan leiden tot valse resultaten in fluorescerende studies, met name studies die DNA analyseren of DNA interactie eiwitten. We hebben geconstateerd dat recombinant PCD, een heterodimer van hexahistidine gelabeld pcaH en pcaG, kan worden uitgedrukt in E. coli (Figuur 1). De heterodimer wordt eerst gezuiverd door nikkel-affiniteits chro.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Zuurstof opruimings systemen worden vaak opgenomen in één molecuul fluorescentiemicroscopie om fotobleaching3,7,8te verminderen. Deze microscopie technieken worden vaak gebruikt om nucleïnezuren of eiwit interacties met nucleïnezuren te observeren1,13,14. Verontreiniging van OSSs met nucleasen kan leiden tot valse resultaten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH GM121284 en AI126742 to KEY.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide en bis-acrylamide oplossing, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Azijnzuur, Glaciaal Gecertificeerd ACS | Fisher Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Gegranuleerd | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC-systeem | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, en Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugaal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium ijzer (II) sulfaat hexahydraat | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfaat (APS) Tabletten | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Gedehydrateerde Cultuur Media Additief: Flesselgist Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propaan, >=99,0% (titratie) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromofenol Blauw | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brillant Blauw | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidiumbromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gegranuleerde LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazool | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptine | Roche | 11017128001 | |
| Lysozym uit kippeneiwit | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesiumchloride Hexahydraat | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, met cuvetmogelijkheid | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competente Cellen | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media inbegrepen |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuïnezuur | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Natriumdodecylsulfaat | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Steriele Wegwerpfiltereenheden met PES-membraan > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Steriele Wegwerpfiltereenheden met PES-membraan > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variabele modus fluorescente imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
Referenties
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
