Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het bestuderen van Cryptosporidium infectie in 3D-weefsel-afgeleide menselijke Organoid cultuur systemen door Microinjection

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59610

⸱

14 september 2019

 ,  , 
1Hubrecht Institute, Oncode Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), UMC Utrecht, 2Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 3Janssen Pharmaceutica

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven protocollen voor het bereiden van oöcysten en zuiveren sporozoieten voor het bestuderen van infectie van menselijke intestinale en luchtweg organoïden door Cryptosporidium parvum. We demonstreren de procedures voor micro injectie van parasieten in het intestinale organoïde lumen en immunokleuring van organoïden. Tot slot beschrijven we de isolatie van gegenereerde oöcysten uit de organoïden.

Samenvatting

Cryptosporidium parvum is een van de belangrijkste oorzaken van de ziekte van de mens diarree. Om de pathologie van de parasiet te begrijpen en efficiënte geneesmiddelen te ontwikkelen, is een in vitro cultuur systeem dat de omstandigheden in de gastheer recapitates nodig. Organoïden, die sterk lijken op de weefsels van hun oorsprong, zijn ideaal voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en parasiet. Organoïden zijn driedimensionale (3D) weefselstructuren die zijn afgeleid van adulte stamcellen en die gedurende langere tijd in cultuur groeien zonder genetische afwijkingen of transformatie te ondergaan. Ze hebben een goed gedefinieerde polariteit met zowel apicale als basolaterale oppervlakken. Organoïden hebben verschillende toepassingen in drug testing, bio Banking, en ziekte modellering en host-microbe interactiestudies. Hier presenteren we een stap-voor-stap Protocol van hoe de oöcysten en sporozoïeten van Cryptosporidium voor het infecteren van de menselijke intestinale en luchtweg organoïden voor te bereiden. Vervolgens laten we zien hoe micro-injectie kan worden gebruikt om de microben in de organoïde lumen te injecteren. Er zijn drie belangrijke methoden waarmee organoïden kunnen worden gebruikt voor host-microbe interactiestudies — micro Injection, mechanisch scheren en beplating, en door het maken van monolayers. Micro Injection maakt onderhoud van de 3D-structuur mogelijk en zorgt voor nauwkeurige controle van de parasiet volumes en direct apicaal zijcontact voor de microben. We bieden Details voor een optimale groei van organoïden voor Imaging of oocyste productie. Ten slotte tonen we ook aan hoe de nieuw gegenereerde oöcysten kunnen worden geïsoleerd van de organoïde voor verdere downstream verwerking en analyse.

Inleiding

Ontwikkeling van geneesmiddelen of vaccins voor de behandeling en preventie van Cryptosporidium infectie is belemmerd door het ontbreken van in-vitro systemen die de in vivo situatie bij de mens nauwkeurig nabootsen1,2. Veel van de momenteel beschikbare systemen alleen toestaan korte termijn infectie (< 5 dagen) of bieden geen ondersteuning voor de volledige levenscyclus van de parasiet3,4. Andere systemen die de volledige ontwikkeling van de parasiet mogelijk maken, zijn gebaseerd op vereeuwigd cellijnen of cellijnen van kanker die de fysiologische situatie bij de mens niet getrouw recapituleren5,6,7 . Organoïden of ' mini-orgels ' zijn 3D-weefsel afgeleide structuren die worden gekweekt in een extracellulaire matrix aangevuld met verschillende weefsel specifieke groeifactoren. Organoïden zijn ontwikkeld uit verschillende organen en weefsels. Ze zijn genetisch stabiel en recapituleren de meeste functies van de organen van hun oorsprong en kunnen gedurende langere tijd in cultuur worden gehouden. We hebben een methode ontwikkeld voor het infecteren van humane intestinale en Long organoïden met Cryptosporidium dat een nauwkeurig in vitro model biedt voor de studie van gastheer-parasiet interacties die relevant zijn voor intestinale en respiratoire Cryptosporidiose8 ,9,10,11,12,13. In tegenstelling tot andere gepubliceerde cultuur modellen, het organoïde systeem is representatief voor Real-Life host parasiet interacties, maakt het mogelijk voor de voltooiing van de levenscyclus, zodat alle stadia van de parasiet levenscyclus kan worden bestudeerd, en onderhoudt parasiet propagatie tot 28 dagen10.

Cryptosporidium parvum is een apicomplexaanse parasiet die het epitheel van de Ademhalings-en darm tracten infecteert, waardoor een langdurige diarree ziekte ontstaat. De resistente milieu fase is de oocyste, gevonden in verontreinigd voedsel en water14. Eenmaal geconsumeerd of geïnhaleerd, de oocyste excysts en releases vier sporozoieten die hechten aan epitheliale cellen. Sporozoites glijden op hosts cellen en Engage host cel receptoren, maar de parasiet niet volledig de cel binnenvallen, en lijkt te induceren van de host cel om het te verzwelgen15. De parasiet, die binnen een intracellulair maar extracytoplasmisch compartiment geïnternationaliseerd is, blijft op het apicale oppervlak van de cel, repliceert binnen een parasitophoreuze vacuole. Het ondergaat twee ronden ongeslachtelijke voortplanting — een proces dat merogony wordt genoemd. Tijdens merogony ontwikkelen type I meronts die acht merozoïeten bevatten die vrijkomen om nieuwe cellen binnen te dringen. Deze merozoïeten binnenvallen nieuwe cellen te ontwikkelen tot type II meronts met vier merozoïeten. Deze merozoites, wanneer vrijgegeven, infecteren cellen en ontwikkelen tot macrogamonts en microgamonts. Microgameten worden vrijgegeven en bevruchten de macrogameten die zygoten produceren, die volwassen worden tot oöcysten. Volwassen oöcysten worden vervolgens in het lumen vrijgegeven. Oöcysten zijn ofwel dun-ommuurd die onmiddellijk excyst om het epitheel te reinfecteren, of dikke ommuurde die vrijkomen in het milieu om de volgende gastheer14infecteren. Alle stadia van de levenscyclus van Cryptosporidium zijn geïdentificeerd in het organoïde cultuur systeem dat eerder werd ontwikkeld door onze groep10.

Omdat menselijke organoïden getrouw de menselijke weefsels9,11,13nabootsen en alle replicatieve stadia van Cryptosporidium10ondersteunen, zijn ze het ideale weefselkweek systeem om te bestuderen Cryptosporidium biologie en gastheer-parasiet interacties. Hier beschrijven we de procedures voor het infecteren van organoïden met zowel Cryptosporidium oöcysten en excysted sporozoites, en het isoleren van de nieuwe oöcysten geproduceerd in dit weefselcultuur systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle weefselhandling en resectie werden uitgevoerd onder de door de institutionele Review Board (IRB) goedgekeurde protocollen met toestemming van de patiënt.

1. bereiding van C. parvum oöcysten voor injectie

Opmerking: Cryptosporidium oöcysten werden gekocht van een commerciële bron (Zie de tabel met materialen). Deze oöcysten worden geproduceerd in kalveren en worden opgeslagen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met antibiotica. Ze kunnen ongeveer 3 maanden worden bewaard bij 4 °C en mogen nooit worden bevroren. Normaalgesproken gebruiken we oöcysten binnen een maand. Organoïden kunnen worden geïnfecteerd met ofwel intact oöcysten, of sporozoïeten kunnen worden geïsoleerd van excysted oöcysten en gebruikt om organoïden te infecteren als het belangrijk is om geen oöcysten te hebben van het oorspronkelijke entmateriaal.

  1. Prepareren Cryptosporidium oöcysten voor het infecteren van cellen (Figuur 1a).
    1. Houd oöcysten op ijs tijdens alle manipulaties totdat ze worden toegevoegd aan de organoïden.
    2. Bereken het aantal oöcysten dat nodig is voor een volledige zes-well plaat van organoïden (meestal ongeveer 5 x 105– 2,5 x 105 voor de plaat). Tel het aantal oöcysten in een hemocytometer om de hoeveelheid te controleren en over te brengen naar een centrifugebuis.
      Opmerking: Om te helpen in de visualisatie, oöcysten kunnen worden gemengd 1:1 met een oocyste-specifieke fluorescentie antilichaam (Zie de tabel van de materialen) voordat het wordt geladen op de hemocytometer. De fluorophore-gelabelde oöcysten kunnen dan gemakkelijk worden gevisualiseerd en geïnventariseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Wij stellen voor het injecteren van ongeveer 100 – 1000 oöcysten/organoid. In het algemeen, 1000 – 2000 organoïden kunnen worden geteeld in een zes-goed plaat.
    3. Breng het volume van de suspensie voor oöcysten tot 900 μL met PBS. Voeg 100 μL natriumhypochloriet (bijv. Clorox) bleekmiddel (bij 4 °C) toe. Inbroed 10 min. op ijs.
    4. Centrifugeer gedurende 3 minuten in een micro centrifuge bij 8.000 x g bij 4 °c. Oriënteer de buizen in de centrifuge met de opening van de dop naar binnen gericht. De pellet kan moeilijk te zien zijn, dus wetende waar de parasieten in de buis zijn omhuld is essentieel.
    5. Verwijder de supernatant met een pipet die voorzichtig is om de pellet te vermijden. Voeg 1 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) en Vortex toe om te mengen.
    6. Centrifugeer gedurende 3 minuten in een micro centrifuge bij 8.000 x g bij 4 °c.
    7. Herhaal spoelingen nog twee keer met DMEM.
    8. Bereid expansievat (OME) of differentiatie organoïde medium (OMD) waaraan taurocholaat is toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5% (w/v) (Zie tabel met materialen). Taurocholate moet altijd worden bereid en vers toegevoegd.
      Opmerking: We hebben met succes 0,5% taurocholate gebruikt in onze infectie testen waar het entmateriaal intact oöcysten is, en zagen verbeterde tarieven van infectie zonder schadelijke effecten op de gastheer cellen. Echter, taurocholate wellicht onverwachte effecten op cellen, en lagere concentraties zijn met succes gebruikt in infectie testen16.
    9. Respendeer oöcysten in 100 μL organoïde kweekmedium aangevuld met 0,5% (w/v) natrium taurocholaat. Tel oöcysten opnieuw zoals beschreven in stap 1.1.2.
    10. Voeg snel groene kleurstof toe aan de suspensie om de injectie te visualiseren.
    11. Vul micro-loader tips (Zie de tabel met materialen) met de oocyste suspensie en gebruik deze om getrokken haarvaten te vullen.
      Let op: De hele procedure moet worden uitgevoerd in een weefsel cultuurkap met veiligheidsprotocollen van niveau 2. Gebruik van maskers wordt aanbevolen als Cryptosporidium oocysten kunnen ook besmettelijk zijn in de lucht.

2. in vitro zuivering van sporozoïeten uit C. parvum oöcysten

  1. Purify sporozoieten van C. Parvum oöcysten na het bleken en wassen van de bleekmiddel zoals hierboven beschreven.
    1. Breng de oöcysten over naar een buis van 15 mL. Respendeer oöcysten op kamertemperatuur excystation medium (0,75% w/v natrium taurocholaat in DMEM) te verkrijgen 1 x 107 oöcysten/ml. De toevoeging van taurocholaat verbetert de excystation snelheid van de oöcysten, verbetering van de sporozoite opbrengst.
    2. Incuberen oocyste suspensie bij 37 °C gedurende 1 – 1,5 uur.
    3. Controleer het monster microscopisch voor omvang van de excystation; 60 – 80% excystation is redelijk voor goed herstel van sporozoites. Als het niveau van de excystation laag is, inincuberen langer (nog eens 30 min tot 1 h).
    4. Bepaal het percentage excystation ten opzichte van het aantal startende oöcysten. Excystation wordt als volgt berekend:
      % excystation = [1 – (aantal intacte oöcysten/aantal oöcysten bij start)] x 100
    5. Was cellen om excystation reagentia te verwijderen door 14 mL PBS of medium toe te voegen, te mengen en cellen te herstellen (intact oöcysten, oöcyste schelpen en sporozoïeten) door centrifugeren bij 3.400 x g gedurende 20 minuten om sporozoïeten te herstellen. Aspireren zorgvuldig om te voorkomen dat cellen verliezen.
    6. Respendeer de sporozooriet pellet in 1 – 2 mL DMEM om 3 x 107 oöcysten/ml te verkrijgen (gebaseerd op het aantal beginnende oöcysten).
    7. Om overgebleven oöcysten en schelpen te verwijderen, filtert u de suspensie door een 3 μm filter (Figuur 1b). Gebruik een 47 mm filterhouder apparaat uitgerust met polycarbonaat filter (poriegrootte 3 μm) bevestigd aan een 10 mL spuit vat. Plaats het apparaat van de filterhouder bovenop een buis van 15 mL. Plaats de montage in een ijsemmer of in een koude ruimte.
    8. Voeg 7,5 mL van de sporozoite suspensie toe aan de filter assemblage en laat ze door de zwaartekracht filteren. Doorspoelen met een andere 7,5 mL DMEM.
      Opmerking: Om succes in sporozoite isolatie te garanderen, zijn verse oöcysten en een goed excystation van cruciaal belang. Als er te veel onexcysted oöcysten zijn, zal de suspensie niet door de zwaartekracht stromen. Druk op de spuit toepassen kan geforceerd oöcysten door. Micro injectie van sporozoïeten is uitdagender dan die van oöcysten omdat sporozoïeten kunnen klonteren en het capillair blokkeren. Om dit te voorkomen, raden wij het maken van een bredere capillaire Tip bij het injecteren van organoïden met sporozoites. Om voldoende infectie niveaus te bereiken, moeten 2 – 4 keer het aantal sporozoïeten in elke organoïde worden geïnjecteerd in vergelijking met organoïden die zijn geïnfecteerd met oöcysten.
    9. Centrifugeer de gefilterde sporozoïet suspensie op 3.400 x g met behulp van een draaiende emmer rotor voor 20 minuten tot pellet sporozoites.
    10. Respenderen in 50 – 100 μL OME of OMD organoïde kweekmedium (Zie de tabel met materialen) aangevuld met 0,05% (w/v) snelle groene kleurstof en L-glutathion, betaïne, l-cysteïne, linolzuur en taurine-bevattende Reduceer buffer5 (Zie de Tabel met materialen).
      Opmerking: Te lang incuberen van oöcysten kan resulteren in de lysis van sporozoieten en slecht herstel en moet daarom worden vermeden.

3. in vitro cultuur van humane intestinale en Long Organoïden voor micro injectie

  1. Cultuur intestinale organoïden onder expansie en differentiatie media omstandigheden.
    Opmerking:    De details van de intestinale en Long organoïde vermeerdering zijn eerder beschreven in andere artikelen8,13(ZieTabel met materialenvoor media recepten). Hier beschrijven we kort de organoïde cultuur methode met specifieke verwijzing naar optimalisatie voorCryptosporidiuminjectie en groei. We hebben geconstateerd dat voor de beeldvorming van parasieten in organoïden de organoïden die in het expansie medium worden geteeld, beter zijn dan die in gekweekte media, omdat er minder vuilophoping is dan in organoïden die in differentiatie medium zijn geteeld. Echter, als het doel is om oöcysten te isoleren, produceren organoïden geteeld in differentiatie media veel hogere aantallen oöcysten.
    1. Handhaaf organoïden in 3D-culturen in extracellulaire matrix (Zie de tabel met materialen) bij 37 °c. Voeg OME (Expansion media) bovenaan toe en vernieuw elke dag.
      Opmerking: Voor Long organoïden hebben we geen aparte expansie-en differentiatie media.
    2. Om organoïden te splitsen en te platen voor micro injectie, verwijder de media uit de 6-well plaat met menselijke organoïden en voeg F12 + + + toe (Zie de tabel met materialen) naar de put en Splits de matrix op door pipetteren met een 1 ml pipetpunt meerdere malen. Verzamel cellen in een buis van 15 mL (2 mL F12 + + + per buis is genoeg voor verdere procedures).
    3. Voeg 10 – 12 mL F12 + + + toe aan een andere buis van 15 mL en plaats een pipet met vuur gepolijst glas in het medium, Pipetteer 3 keer op en neer om de menselijke intestinale en Long organoïden op te breken.
      Opmerking: Gebruik een lange glazen pipet (20 – 30 cm) en vuur-Poets het kort. Maak de opening (diameter van 1 mm) niet erg klein omdat organoïden beschadigd kunnen raken. Maak de punt van het pipet glad door het kort te polijsten. Breek organoïden in kleinere stukjes van ~ 50 μm. Long organoïden hebben een dikker buitenste membraan en vereisen daarom een sterkere afschuiving met de glazen pipet in vergelijking met de intestinale organoïden. Bovendien hebben ze een tragere groeisnelheid dan intestinale organoïden (tot 14 dagen tussen elke passage).
    4. Voeg F12 + + + toe tot 5 – 7 mL en centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min.
      Opmerking: De centrifugeersnelheid in deze stap is hoger dan normaal om een goede celpellet te maken die goed gescheiden is van de extracellulaire matrix (Zie de tabel met materialen). We hebben gezien dat in vergelijking met muis dunne darm organoïden, menselijke dunne darm organoïden moeilijker te verstoren.
    5. Verwijder zo veel mogelijk medium zonder de cellen te storen, en breng vervolgens de pellet met matrix op 4 °C aan; 200 – 300 μL matrix per put van een zes-put-plaat is vereist. Organoïden moeten één op de drie gesplitst worden om een vrij hoge celdichtheid te behouden.
    6. Plaat de organoïden in matrix druppeltjes van ongeveer 5 – 10 μL, elk in de put van een 6-well plaat. Inbroed 20 – 30 minuten bij 37 °C en voeg vervolgens het expansie medium (OME) bovenop.
    7. Verander het medium elke 2 – 3 dagen.
      Opmerking: In ongeveer 5 – 7 dagen bereiken organoïden die in EM groeien een grootte van 100 – 200 μm en zijn ze klaar voor injectie.
    8. Om de organoïden te differentiëren, na 5 – 6 dagen in EM, verander de media in differentiatie media (DM) voorwaarden en houd voor 5 – 6 extra dagen voor het injecteren van de parasieten.
      Opmerking: Voor de uitbreiding van organoïden wordt aanbevolen om de organoïden dicht te maken. Voor micro injectie wordt het gebruik van een 6-put plaat aanbevolen met organoïden verguld met een mindere dichtheid. Bijvoorbeeld, plaat organoïden uit drie putjes van een zesboorput in een volle zes-Wells plaat voor micro injecties. De matrix moet bij-20 °C worden gehouden voor lange termijn opslag en ontdooid bij 4 °C of op ijs vóór gebruik. Uitbreiding van de Long organoïden gebeurt op een vergelijkbare manier, maar met behulp van Long organoïde specifieke mediacomponenten (tabel 1)8 .

4. micro injectie van oöcysten/sporozoïeten in het Organoid lumen

  1. Microinjecteer parasieten in de apicale kant van de 3D organoïde (Figuur 2).
    1. Maak glazen capillairen van 1 mm diameter met behulp van een micro pipet trekker.
      Opmerking: De instellingen die worden gebruikt op de pipet-trekker (Zie tabel met materialen) zijn: Heat = 663, pull = 100, Velocity = 200, time = 40 MS. instellingen moeten worden aangepast volgens de instructies van de gebruiker voor een bepaalde machine.
    2. Snijd de punt van het capillair met de Tang. De grootte/diameter van het capillaire uiteinde meet ongeveer 9 – 12 μm; Dit zorgt voor een gemakkelijke stroom van oöcysten (4 – 5 μm grootte).
    3. Vul de capillairen met oocyste of sporozoite suspensie met behulp van micro-loader tips.
    4. Laad het met oocyste gevulde capillair op een micro injector.
    5. Microinjecteer 100 – 200 nl suspensie in elke organoïde onder een omgekeerde Microscoop bij 5x vergroting, waarbij de druk constant blijft. Na de micro injectie vernieuwt u de media met OME of OMD elke dag en houdt u de plaat bij 37 °C.
      Opmerking: We gebruiken geen micro Manipulator voor micro injectie. Het gebruik van dezelfde capillaire wordt aanbevolen voor het hele experiment om te zorgen voor gelijke injectie in elk monster.

5. immunofluorescentie kleuring van Organoïden

  1. Verzamel organoïden (1 – 2 x 24 putjes) met een P1000 pipet in een buis van 15 mL met een koude F12 + + +.
  2. Pellet organoïden bij 300 x g gedurende 2 minuten, verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren en Pipet de pellet voorzichtig los in het resterende volume.
  3. Voeg 5 mL 2% Paraformaldehyde toe in PBS. Om te voorkomen dat de organoïden aan de muur kleven, moet u de buis niet omkeren. Laat de organoïden zich op de bodem van de buis vestigen en fixeren bij 4 °C 's nachts of 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder het fixeermiddel en voeg 10 mL permeabilization buffer (0,2% Triton in PBS) toe.
  5. Draai de buis op kamertemperatuur gedurende 20 minuten (dit zorgt ervoor dat alle organoïden in suspensie blijven).
  6. Pellet de organoïden op 300 x g gedurende 2 minuten en gooi het supernatant dan weg.
  7. Regeer de organoïden zachtjes in 500 μL blokkerende oplossing (Zie de tabel met materialen) en breng over naar een micro centrifugebuis van 2 ml.
  8. Inincuberen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur op een shaker. Laat organoïden door de zwaartekracht op de bodem van de buis vestigen. Vervang de blokkerende oplossing door primaire antilichaam oplossing (Zie tabel van de materialen) en inincuberen voor 1 – 2 h bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °c.
  9. Was 3x met PBS met 0,1% tween. Laat de organoïden elke keer schikken en verwijder het supernatant.
  10. Voeg secundaire antilichaam oplossing toe (Zie de tabel met materialen) en inincuberen voor 2 uur bij kamertemperatuur.
  11. Was 3x met PBS met 0,1% tween. Laat 50 μL PBS na de derde wasbeurt.
  12. Monteer op de glijbaan door het pipetteren van de organoïden opgehangen in 50 μL PBS op de dia. Verwijder overtollige PBS, voeg een druppel montage middel toe (Zie de tabel met materialen) en voeg de Afdeklijst bovenaan toe. Sluit de zijkanten af met nagellak en laat het drogen.

6. isolatie van oöcysten uit Organoïden

  1. Isoleren van nieuw gevormde oöcysten uit de organoïde lumen.
    Opmerking:    Oöcysten zijn geïsoleerd van de organoïden door immunomagnetische scheiding met behulp van een oocyste isolatie kit (Zie deTabel met materialen) met de hieronder beschreven wijzigingen. De geïsoleerde oöcysten kunnen vervolgens worden geanalyseerd door immunofluorescentie en elektronenmicroscopie.
    1. Begin met gedifferentieerde organoïden die gedurende 5 – 7 dagen in OMD zijn bewaard en die niet geïnfecteerd zijn, gedurende 1 dag geïnfecteerd zijn en gedurende 5 dagen geïnfecteerd zijn. Gebruik de eerste twee als negatieve besturingselementen.
      Opmerking: We hebben geconstateerd dat gedifferentieerde organoïden meer oöcysten produceren dan Long of het uitbreiden van intestinale organoïden10.
    2. Verzamel organoïden in 15 mL centrifugebuizen. Centrifugeer de organoïden gedurende 20 minuten bij 3.000 x g en 10 °c.
      Opmerking: Deze hoge snelheid is nodig om ervoor te zorgen dat er geen oöcysten verloren gaan van alle organoïden die kunnen worden gebroken.
    3. Verwijder de organoïde media en vervang deze door 5 ml water.
    4. Verstoren de organoïden door herhaalde krachtige pipetteren met een vuurgepolijste glazen Pasteur-pipet.
    5. Als er klontjes zichtbaar zijn, breng de organoïde suspensie over naar een glas dounce homogenisator en homogeniseren tot organoïden goed verstoord zijn. De dounce homogenisator zal geen invloed hebben op de oöcysten.
    6. Zodra er geen zichtbare klonters zijn, voeg 5 mL buffer A toe van de oocyste isolatie kit. Meng en voeg vervolgens 120 μL van de magnetische kralen toe bedekt met anti-oocyste IgM.
    7. Inincuberen van de celsuspensie en magnetische kralen voor 2 uur bij kamertemperatuur met continue menging op een rocker platform.
    8. Leg aan het einde van de incubatie de buisjes met cellen en parels op een magnetisch scheidings rek dat is ontworpen voor buizen van 15 mL.
    9. Draai de buisjes in magnetisch scheidings rek handmatig gedurende 3 min. De parels zullen zich aan de zijkant van de buis naast de magneet houden.
    10. Voorzichtig, met een 10 mL Pipet, verwijder de supernatant van de kralen. Regeer de parels in 450 μL buffer B en breng over naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
      Opmerking: Houd de supernatant totdat de isolatie van de oöcysten wordt bevestigd.
    11. Om overgebleven kralen en oöcysten te verzamelen, was de 15 mL tube met 450 μL buffer B en voeg deze Wash toe aan de magnetische kralen in de microcentrifuge buis.
    12. Herhaal stap 6.1.11 nog een keer. Alle kralen en gevangen oöcysten moeten nu worden overgebracht naar de microcentrifuge buis.
    13. Plaats de microcentrifuge buis op een magnetisch scheidings rek dat is ontworpen voor het vasthouden van microcentrifuge buizen.
    14. Draai de buis in de magnetische scheidingswand met de hand gedurende 3 min.
    15. Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet in een nieuwe buis.
      Opmerking: Houd de supernatant totdat de isolatie van de oöcysten wordt bevestigd.
    16. Verwijder de microcentrifuge buis met magnetische kralen en oöcysten uit het magnetische scheidings rek.
    17. Voeg 100 μL van 0,1 N HCl toe aan magnetische kralen om de oöcysten van de kralen te elzen. Vortex voor 30 s.
      Opmerking: Vortexer moet worden ingesteld op iets minder dan de maximumsnelheid.
    18. Inbroed de kralen in 0,1 N HCl gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    19. Vortex weer. Plaats de buis vervolgens terug op het magnetische scheidings rek. Wacht tot de kralen zich aan de zijkant van de buis hechten en breng de supernatant over naar een nieuwe microcentrifuge buis.
    20. Herhaal stap 6.1.17 tot en met 6.1.19 en combineer het tweede eluaat met de eerste elutie.
    21. Neutraliseer het eluaat met 20 μL van 1 N NaOH, of een andere neutraliserende buffer zoals 1 M Tris, pH 8.
    22. Om oöcysten te tellen, neem 10 μL van het eluaat, Combineer het met 10 μL oocyste-specifiek antilichaam (Zie tabel met materialen) en Tel fluorescerende oöcysten op een hemocytometer.
      Opmerking: Geïsoleerde oöcysten kunnen worden bewaard bij 4 °C of onmiddellijk worden gebruikt voor immunofluorescentie of elektronenmicroscopie beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hier gepresenteerde protocollen resulteren in de efficiënte zuivering van oöcysten en sporozoïeten (Figuur 1a) klaar voor Microinjection. Het excystation protocol resulteert in de vrijlating van sporozoieten van ongeveer 70 – 80% van de oöcysten, daarom is het essentieel om de resterende oöcysten en schelpen te filteren door middel van een 3 μm filter. Filtratie resulteert in bijna 100% sporozoietzuivering (Figuur 1b). Bovendien zorgt de toevoeging van een gr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Cultuur van Cryptosporidium parasieten in intestinale en luchtweg organoïden biedt een nauwkeurig model om gastheer-parasiet interacties10 te bestuderen, maar heeft ook veel andere toepassingen. De huidige methoden voor het selecteren en propageren van genetisch gemodificeerde Cryptosporidium parasieten vereisen bijvoorbeeld passage in muizen19 die geen isolatie van parasieten mogelijk maakt die modificaties hebben die essentieel zijn voor in-vivo-infectie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn Deborah A. Schaefer dankbaar van de school voor dier-en vergelijkende Biomedische Wetenschappen, het College voor landbouw en levenswetenschappen, de Universiteit van Arizona, Tucson, AZ, USA om ons te helpen met de productie en analyse van oocyste. We danken ook Franceschi Microscopy en Imaging Center en D.L. Mullendore aan de Washington State University voor tem-voorbereiding en beeldvorming van geïsoleerde organoïde-oöcysten.

D.D. is de ontvanger van een VENI-beurs van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. is de ontvanger van een VENI-subsidie van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO-ALW, 863.14.002) en werd gesteund door de Marie Curie-beurzen van de Europese Commissie (voorstel 330571 KP7-PEOPLE-2012-IIF). Het onderzoek dat tot deze resultaten heeft geleid, heeft financiering ontvangen van de Europese Onderzoeksraad onder ERC Advanced subsidie Agreement No. 67013 en van NIH NIAIH onder R21 AT009174 naar RMO. Dit werk maakt deel uit van het Oncode Institute, dat deels wordt gefinancierd door de Nederlandse Kankervereniging en werd gefinancierd door een subsidie van de Nederlandse Kankervereniging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Basement membrane extract (extracellular matrix)amsbio3533-010-02 
Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody)Waterborne, IncA400FLR-1XFinal Concentration = Gebruik 2-3 druppels/slide
Crypto-Grab IgM coated Magnetic beadsWaterborne, IncIMS400-20 
Dynamag 15 rackThermofisher Scientific12301D 
Dynamag 2 rackThermofisher Scientific12321D 
EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µmEMD-MilliporeTSTP02500 
Fast green dyeSIGMAF7252-5G   
Femtojet 4i MicroinjectorEppendorf5252000013 
Glass capillaries of 1 mm diameterWPITW100F-4 
Matrigel (extracellular matrix)Corning356237 
Microfuge tube 1.5 mLEppendorfT9661-1000EA 
Micro-loader tipsEppendorf612-7933 
Micropipette puller P-97Shutter instrumentP-97 
Normal donkey SerumBio-RadC06SB 
PenstrepGibco15140-122 
Sodium hypoclorite (use 5%)Clorox50371478 
Super stick slidesWaterborne, IncS100-3 
Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holderEMD-MilliporeSX0002500 
Taurocholic acid sodium salt hydrateSIGMAT4009-5G 
Tween-20Merck8221840500 
Vectashield mounting agentVector LabsH-1000 
Vortex Genie 2Scientific industries, IncSI0236 
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)  Finale hoeveelheid
DMEMInvitrogen12634-010500 mL
PenstrepGibco15140-1225 mL stock in 500 mL DMEM
GlutamaxGibco350500385 mL stock in 500 mL DMEM
HepesGibco156300565 mL stock in 500 mL DMEM
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansiemedia)  Finale concentratie
A83-01Tocris2939-50mg0.5 µM
Adv+++  aanmaken tot 100 mL
B27Invitrogen175040441x
EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
GastrinTocris3006-1mg10 nM
NACSigmaA9125-25G1.25 mM
NICSigmaN0636-100G10 mM
Noggin CMIn house* 10%
P38 inhibitor (SB202190)SigmaS7076-25 mg10 µM
PGE2Tocris2296/1010 nM
PrimocinInvivoGenant-pm-11 mL/500 mL media
RSpoI CMIn house* 20%
Wnt3a CMIn house* 50%
In house* - cellijnen worden op verzoek geleverd   
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiatiemedia)  Om organoïden te differentiëren, werden kleine darmorganoïden uitgebreid en werden gedurende zes tot zeven dagen na splitsing in een Wnt-rijk medium gekweekt, en vervolgens in een differentiatiemedium gekweekt (intrekking van Wnt, nicotinamide, SB202190, in een differentiatiemedium (intrekking van Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandine E2 van een Wnt-rijk medium of OME)
LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiatiemedia)  Finale concentratie
Adv+++  aanmaken tot 100 mL
ALK-I A83-01Tocris2939-50mg500 nM
B27Invitrogen175040440.0763888889
FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
FGF-7Peprotech100-1925 ng/mL
N-AcetylcysteineSigmaA9125-25G1.25 mM
NicotinamideSigmaN0636-100G5 mM
Noggin UPEU-Protein ExpressNeem rechtstreeks contact op met het bedrijf10%
p38 MAPK-ISigmaS7076-25 mg1 µM
PrimocinInvivoGenant-pm-11:500
RhoKI Y-27632Abmole BioscienceM1817_100 mg2.5 µm
Rspo UPEU-Protein ExpressNeem rechtstreeks contact op met het bedrijf10%
Reducing buffer (voor resuspenderen van oocysten en sporozoieten voor injectie)

Referenties

  1. Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
  2. Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
  3. Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
  4. Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
  5. Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
  6. DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
  7. Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
  8. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).
  9. Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  12. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  14. O'Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
  15. Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
  16. Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
  17. O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
  18. Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
  19. Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
  20. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Micro injectietechniekzuivering van sporozo etenexcystatieprotocol3D organo densysteemgastheer microbe interactieimmunofluorescentie assayfiltratiemethodeapicale injectie
Het bestuderen van Cryptosporidium infectie in 3D-weefsel-afgeleide menselijke Organoid cultuur systemen door Microinjection
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.