Hier beschreven is het gebruik van verschillende zelfgemaakte tools om volwassen Drosophilaover te dragen, te koelen en te doden, evenals om glazen cultuur flesjes schoon te maken en eieren te verzamelen. Deze gereedschappen zijn gemakkelijk te maken en zijn vrij efficiënt in het hanteren van Drosophila.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Eenvoudige zelfgemaakte gereedschappen voor het hanteren van fruit vliegjes-Drosophila melanogaster
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, wordt veel gebruikt zowel in biologisch onderzoek als in het biologie onderwijs. Het hanteren van volwassen vliegen is gebruikelijk, maar moeilijk in de praktijk, als volwassen vliegen vliegen. Hier wordt gedemonstreerd hoe u enkele eenvoudige en kosteneffectieve hulpmiddelen maakt om moeilijke problemen bij de behandeling van Drosophilaaan te pakken. Gaten in Foam stoppers worden gemaakt en pipetpunten of trechters worden in de gaten gestoken. Vliegen gaat dan slechts in één richting naar de pipetpunt/trechter assemblage, waardoor de overdracht van volwassen Drosophila in of uit een injectieflacon efficiënt kan worden besturen. Bestaande protocollen zijn aangepast voor koel-anesthetiserende vliegen door te koelen in gemalen ijs en ze over te dragen op een koud, hard icepack oppervlak. Het icepack is bedekt met een stukje medisch gaas dat geïmmobiliseerde vliegt uit het gecondenseerde water wanneer onderzocht onder een stereomicroscoop. De vliegen worden uiteindelijk geëerd voor het tellen en sorteren of weggegooid door Microwaving. Er is ook een fles vormige kooi ontwikkeld voor het verzamelen van eieren, evenals een arbeidsbesparend apparaat en een begeleidend protocol voor het reinigen van glazen kweek flesjes.
Inleiding
De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is een modelorganisme dat op grote schaal wordt gebruikt in biologisch onderzoek en biologie onderwijs om een breed scala aan onderwerpen1,2te bestuderen. De fundamentele problemen van de behandeling Drosophila zijn de overdracht van volwassenen van flacon naar injectieflacon en immobilisatie van de vliegen, zodat ze gemakkelijker te hanteren, als alle volwassenen (behalve voor sommige mutanten3,4) kan vliegen.
Conventioneel, een onderzoeker transfers vliegt van de ene flacon naar de andere door het houden van twee flesjes mond-tot-mond, het tikken van de vliegen naar beneden of het toestaan van vliegen om te vliegen in een andere flacon, vervolgens scheiden en opnieuw aansluiten beide flesjes4. Natuurlijk, dit vereist dat de opening van twee flesjes met dezelfde diameter, en het is moeilijk om de hoeveelheid vliegen overgedragen. Ondertussen vereist dit snelle handen om de klus te klaren, en ontsnappen aan zwerf vliegen kan resulteren in problemen voor het laboratorium of klaslokaal. Het toevoegen van extra Virgin vliegen of mannetjes vliegen naar een reeds voorbereide Kruis is een andere routine taak in Drosophila experimenten. Conventioneel, vliegen moet worden geïmmobiliseerd in het Kruis flacon voor de toevoeging van extra vliegen.
Volwassen Drosophila wordt routinematig verdoofd door ether, co2of chillen5. In vergelijking met ether en co2 blootstelling, is koeling de meest kostenefficiënte agent voor het immobiliseren van volwassen Drosophila en het minst schadelijk voor zowel de vliegen als onderzoekers (vooral jonge studenten)6,7. Echter, water dat continu condenseert op het koude oppervlak of de kamer voor de vliegen. Het is moeilijk om de fenotypes van natte vliegen te bepalen, en ze kunnen gemakkelijk beschadigd raken tijdens het manipuleren8,9. Dit heeft de koelmethode steeds meer geaccepteerd.
Tools voor Fly-transferal en een methode voor vlieg koeling zijn eerder beschreven10. Hierin wordt een gemodificeerde koel anesthesie techniek gerapporteerd die veilig, betrouwbaar en haalbaar is voor Drosophila experimenten. Ook beschreven in dit artikel zijn 1) methoden voor het doden van volwassenen voor het tellen, sorteren of verwijderen, 2) arbeidsbesparende apparaten en protocollen voor het schoonmaken van glazen cultuur flesjes, en 3) een eenvoudige kooi voor het verzamelen van eieren. De gemakkelijk ontworpen en kosteneffectieve instrumenten die hier worden beschreven, kunnen worden gebruikt om de moeilijke problemen van vlieg afhandeling aan te pakken, en deze methoden zijn getest en zijn bewezen robuust, betrouwbaar en gemakkelijk te hanteren voor ervaren en beginnende onderzoekers.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. gereedschappen en accessoires voorbereiden
- Tip/trechter stoppers
- Verkrijg twee spons pluggen (de diameter van de stekkers moet iets groter zijn dan de inwendige diameter van de flacons gebruikt voor het overbrengen van vliegen). Maak een gat in de centra van de spons pluggen met een verwarmde elektrische soldeerbout.
- Verkrijg twee pipetpunten van 1 mL, snijd één op de helft dwars met een scherp mes en gooi het puntige uiteinde weg. Snijd vervolgens 1,5 cm van het puntige uiteinde van de tweede pipetpunt. Lijm de resten van de twee pipetpunten samen met een multifunctionele lijm om een langwerpige pipetpunt te maken (Figuur 1a).
- Steek een trechter en de verlengde pipetpunt in de spons pluggen om een tip en trechter stopper te maken (hierna aangeduid als T-en F-stoppers) en sluit de pipetpunt aan met een micro centrifugebuis van 100 μL (Figuur 1a).
Opmerking: De lengte van de trechter Steel moet groter zijn dan de hoogte van de stekker. Als het korter is dan of gelijk is aan de hoogte van de stekker, dan zal vliegen ontsnappen aan de opening van de steel. Het uiteinde van de trechter Steel moet zich ten minste 2 cm boven het oppervlak van het kweekmedium of de bodem van een lege injectieflacon bevinden. Kleine trechters (bijv. schijf diameter < 60 mm) met kleine inwendige stuurpen opening diameters (< 5 mm) hebben de voorkeur. Een glas of een plastic trechter kan worden gebruikt om een F-stopper te maken. Plastic trechters hebben echter de voorkeur voor biologie klassen, omdat ze minder snel breken dan glas trechters.
- Microdissecting naalden
- Verkrijg mechanische potloden die zich comfortabel voelen in de hand en insecten pinnen die overeenkomen met de diameters (bijvoorbeeld 0,5 mm, 0,7 mm) van hun lood vullingen.
- Snijd de brede uiteinden van de insecten pinnen met een tang en bestand de cut plat. Vervang de lood met de pinnen (afbeelding 1B). Druk op de Click-knop en voer 0.5 – 1 cm van een PIN uit om een dissectie uit te voeren. Reinig de PIN en duw het volledig terug in de potlood schacht na een dissectie activiteit om het veilig te maken voor elke persoon om te hanteren.
Opmerking: Microdissecting naalden zijn niet alleen nuttig in dissecties van organen zoals larvale speekselklieren, maar ook in het tellen en sorteren van dode volwassen vliegen.
- Harde icepacks
- Verkrijg verschillende refreezable harde icepacks (grote icepacks hebben de voorkeur). Afbeelding 1c toont een icepacks die goed werkte, die 26,5 cm x 14,5 cm x 2,5 cm meet en heeft boven-en onderzijden die volledig plat zijn.
- Snijd medisch gaas (niet-steriel) in stukken die iets kleiner zijn dan de koude oppervlakken van de icepacks die ze bedekken. Een stukje medisch gaas dat iets kleiner is dan 26,5 cm x 14,5 cm heeft bijvoorbeeld de voorkeur om een icepack te bedekken dat wordt weergegeven in afbeelding 1c.
Opmerking: De nodige accessoires voor deze koeling gereedschappen omvatten: een ijsbox (we gebruikten een 25 cm x 15 cm x 15 cm Foam box voor één persoon en 37 cm x 28 cm x 20 cm doos voor meer dan één persoon), die wordt gebruikt voor het opslaan van gemalen ijs; een paar fijne punt pincet, die worden gebruikt om gekoelde vliegen te grijpen door hun vleugels en ze over te dragen aan een flacon; een paar beschermende werkhandschoenen, die worden gebruikt om gekoelde icepacks uit een vriezer van-20 °C te nemen; en plastic folie, die wordt gebruikt om het podium van een stereomicroscoop te bedekken.
- Drosophila Eier opvang kooi
Opmerking: Kant-en-klare Drosophila Eier collectie kooien zijn verkrijgbaar bij veel biotechnologiebedrijven11. Hier beschreven is een kleine acryl fles-vormige Eier opvang kooi voor 60 mm Petri schalen (figuur 1d links; het kooi ontwerp wordt in het midden weergegeven). Het kan worden aangepast voor andere Petri schaalmaten (bijv. 100 mm, 35 mm). Dit maakt de overdracht van vliegen in of uit de kooi met gemak. Een eenvoudige kooi kan als volgt worden bereid.- Gebruik een Snap Cutter om een zachte plastic drank fles (500 mL, inwendige diameter ca. 65 mm) te snijden in een geschatte 2:1 (puntige uiteinde: Blunt end) ratio en gooi het stompe uiteinde weg.
- Wikkel een strook kaart papier rond een appelsap plaat (inwendige diameter 60 mm) met plakband [de appelsap plaat wordt gebruikt om eieren te verzamelen (Figuur 1e, rechts)].
- Draadloze buis borstel driver
- Verkrijg een accu-boormachine (max. snelheid = 500 rpm).
- Verkrijg een buis borstel met borstels langs de zijkanten en de voorkant. Idealiter moet de diameter van de borstel iets groter zijn dan de diameter van de kweek flacons die gereinigd moeten worden. Snijd het uiteinde van het handvat zodat het in de boorkop kan worden gestoken (figuur 1d).
Opmerking: De benodigde accessoires voor deze reinigings gereedschappen zijn roestvrijstalen sponzen en lange manchet rubberen handschoenen.
2. overdracht van volwassen vliegen van flacon A naar injectieflacon B
Opmerking: Overdracht van volwassen vliegen van de ene flacon naar de andere is de meest voorkomende praktijk die wordt uitgevoerd in Drosophila experimenten [bijv. het overdragen van vliegen van oude cultuur (a) naar verse cultuur (b) of van een kruis flacon (a) naar lege injectieflacon (b)] voor verdoven. Het hier beschreven protocol kan worden gebruikt voor eventuele volwassen vliegoverbrengende activiteiten. Tenzij anders vermeld, wordt dit protocol gebruikt om vliegen van injectieflacon A naar injectieflacon B in dit document over te brengen.
- Controleer de steel van de trechter van een F-stopper en de pipetpunt van een T-stopper zorgvuldig en wis vervolgens alle vliegen die in de stoppers achterblijven met een rubberen luchtblazer. Deze stap is van het allergrootste belang, vooral wanneer een set van T-en F-stoppers wordt gebruikt voor de continue overdracht van verschillende Drosophila lijnen.
- Tik op de vliegen in flacon A en vervang de stekker door een T-stopper en steek de injectieflacon B met een F-stopper.
- Injectieflacon A over injectieflacon B, steek het uiteinde van de pipetpunt van de T-stopper in de trechter opening van de F-Stopper, klop de rand van de omgekeerde injectieflacon A om vliegen uit de pipetpunt en door de steel van de trechter te laten glijden en laat in injectieflacon B vallen. Als een oud voedsel in een injectieflacon A minder compact wordt, kan het dalen wanneer de injectieflacon A omgekeerd en klopte. In een dergelijke situatie, omkeren injectieflacon B over injectieflacon A en laat de vliegen te kruipen in injectieflacon B.
- Scheid de T-stopper van de F-stopper. Sluit het uiteinde van de pipetpunt van de T-stopper met een microcentrifuge buis van 200 μL als de resterende vliegen in de injectieflacon A tijdelijk moeten worden overgebracht naar andere flacons; Verwijder anders de T-stopper en sluit de injectieflacon A. Verwijder de F-stopper en sluit de injectieflacon B.
3. immobiliseren vliegt door te koelen
- Houd de harde, refreezable icepacks in een diepvriezer van 20 °C voor ten minste 24 uur voor gebruik.
- Plaats een gekoeld, hard icepack bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 min. Bevochtig een stukje niet-aseptisch medisch gaas met wat stromend water en laat het goed vastklampen aan het oppervlak van het icepack. De medische gaas kan worden hergebruikt in de volgende vliegen koelen. Op hetzelfde moment, chill een lege flacon in gemalen ijs.
- Transfer volwassen vliegen die moeten worden geïmmobiliseerd in de gekoelde lege injectieflacon (CEV). Wanneer de twee Transfer flesjes zijn gescheiden, bedek de CEV met een Petri schaaltje of een Plug en klop de CEV tegen het gemalen ijs om alle vliegen in de CEV naar de bodem te tikken. Herhaal dit proces meerdere malen totdat alle vliegen zijn geïmmobiliseerd. De vliegen zullen worden geïmmobiliseerd binnen 30 s. Plaats de CEV vervolgens 1 minuut in het ijs. Het is niet aan te raden om te veel vliegen op een moment over te dragen voor anesthetiseren.
- Giet de gekoelde vliegen uit op het medische gaas dat het ijspakket bedekt. Verdeel de overlappende vliegen met een penseel en zorg ervoor dat elke vlieg kan worden gekoeld door het koude oppervlak van de icepack. Als een gekoeld hard icepack iets zwelt, plaats het dan op een handdoek en werk aan de platte kant.
- Verwijder de stage clips van de stereomicroscope, bedek het podium met een stukje plastic folie en zet het icepack op het podium. Zet het bovenlicht aan (een koude lichtbron is wenselijk), richt de stereomicroscoop op en verplaats de icepack totdat de gekoelde vliegen duidelijk kunnen worden gezien.
4. het doden van volwassen vliegen voor het tellen, sorteren of verwijderen
- Transfer Adult vliegt in een lege injectieflacon en dek het af met een Petri schaaltje.
- Keer de injectieflacon om, verwarm het voor 1 min + 20 s in een magnetron en laat de dode vliegen in de Petri schaal vallen.
- Zet beschermende werkhandschoenen aan en haal de injectieflacon uit de magnetron. Giet de dode vliegen op een witte papieren kaart, tellen of onderzoeken van de vliegen met een microdissecting naald onder een stereomicroscoop, en gooi de vliegen lichamen in een vuilnisbak na observatie.
- Om ongewenste vliegen te doden, Verwarm de vliegen voor 2 – 3 minuten in een magnetron, en tik vervolgens op de karkassen in een vuilnisbak.
Opmerking: Het is niet aan te raden om sommige vleugel mutanten (bijv. vleugel lengte Mutants) te doden voor onderzoek, omdat het moeilijk is om van de karkassen te oordelen als de vleugels verder reiken dan het puntje van de buik, dat wordt gezien in wild-type vliegen.
5. overdracht van vliegen in/uit fles vormige Eier opvang kooi
Opmerking: Zoals hierboven vermeld, worden T-en F-stoppers gebruikt om vliegen naar en uit de Eier opvang kooi over te brengen. Vliegen hoeft niet te worden verdoiliseerd gedurende dit proces. Andere details, zoals het bereiden van het appelsap medium, de Eier collectie en de dechorionisatie, vindt u in de literatuur12.
- Steek de Eier opvang kooi in de appelsap plaat of Monteer de appelsap plaat in de kooi gemaakt van een frisdrank flesje. Sluit het gewricht rond de twee componenten af met een strook paraffine folie.
- Plaats zoveel mogelijk vliegen in de kooi en sluit de kooi opnieuw aan met een schuim stopper na het overzetten van de vliegen.
- Om het voedsel voor vliegen in de kooi te veranderen, breng de vliegen in de kooi over naar een lege injectieflacon.
- Vervang de appelsap plaat en sluit deze opnieuw af en breng de vliegen van de injectieflacon terug naar de kooi.
- Wanneer de Eier opvang eindigt, breng de vliegen dan over in een lege injectieflacon en breng ze over in cultuur flesjes.
6. reinigen van glazen kweek flesjes
Opmerking: Over het algemeen bevat een oude cultuur flacon levende vliegen. In het hier beschreven protocol hoeven deze vliegen niet te worden gedood voordat ze worden gereinigd, tenzij ze transgene vliegen zijn.
- Verwijder eventuele permanente markerings inkt uit de glazen kweek flacons met natte, roestvrijstalen sponzen.
-
Dompel de cultuur flesjes in stromend water.
- Vul een laboratorium spoelbak met water, voeg vloeibare afwas zeep in het water en meng.
- Dompel de cultuur flesjes in het water en verwijder vervolgens de stekker, waardoor het water in de injectieflacon kan lopen. Het afwasmiddel in het water zal alle overgebleven volwassen vliegen zinken naar de bodem en verdrinken in het water.
- Week de oude kweek flesjes in water gedurende ten minste 30 minuten.
- Draai de boorkop van de boor, steek de buis borstel en de boorkop. Controleer de richting van de rotatie kiezer en zorg ervoor dat de boor rechtsom draait. Pas de snelheids trigger aan en zorg ervoor dat de maximale snelheid kleiner is dan 500 rpm.
-
Reinig de cultuur flesjes.
- Reinig de cultuur flacons ruwweg.
- Zet een lange manchet rubberen handschoen op de niet-dominante kant en houd de flacon in het water.
- Houd de draadloze buis borstel met de blote dominante hand, knijp de borstel in de injectieflacon met cultuur en knijp in de trigger.
Opmerking: Dompel de batterij niet in het water. Het roterende borsteltje breekt oud voedsel, PUPA, enz., en verwijdert meer dan 95% van het afval. - Stort het afval in een aparte vuilnisbak. Herhaal dit proces totdat het grootste deel van het afval in elke injectieflacon is gereinigd.
- Reinig de kweek flacons grondig.
- Reinig de buis borstel, drain en reinig de gootsteen, en vul het met schoon water.
- Verwijder het resterende afval van elke kweek flacon zoals beschreven in punt 6.4.1.
- Reinig de cultuur flacons ruwweg.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De T-en F-stoppers werden ontwikkeld als een set van eenvoudige gereedschappen die kunnen worden aangepast en gebruikt in elke Fly overdragen activiteiten. Het overdragen van vliegen van een oude cultuur in verschillende verse culturen omvat het verwijderen van de stekkers van de verse flesjes, vervangen door F-stoppers, dan aftappen van de vliegen in de oude injectieflacon, snel verwijderen van de stekker, en vervangen door een T-stopper. Als het oude voedsel compact is, dan is het belan...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit artikel worden enkele zelfgemaakte hulpmiddelen beschreven voor het verwerken van basisactiviteiten die betrokken zijn bij het fokken en experimenteren met Drosophila . Deze tools zijn eenvoudig maar wel effectief. Praktisch, elk lab kan deze tools gemakkelijk te maken, en een onderzoek of een onderwijs laboratorium hoeft niet te vinden van een kant-en-klare alternatief dat is misschien niet beschikbaar lokaal.
Fly-overdracht is de meest voorkomende praktijk en een moeilijke ta...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteur heeft niets te onthullen.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Een tang | |||
| Snoerloze boormachine | max snelheid: 500 rpm | ||
| Elektrisch soldeerbout | |||
| Vijlen | |||
| Trechter | diameter schijf<60mm | ||
| IJsbox | |||
| Insectspelden | |||
| Infraroodthermometer | HCIYET HT-830 | ||
| Lange rubberen handschoenen | |||
| Mechanica potloden | |||
| Medische gaas | |||
| Microcentrifugebuis | 100 ul | ||
| Microgolfoven | |||
| Parafilm | |||
| Peri schaal | interne diameter 60 mm | ||
| Pipettipjes | 1 ml | ||
| Kunststof film | |||
| Kunststof Peri schaal | Φ36 mm gebruikt om het lege glaasje te dekken | ||
| Spitse pincet | |||
| Beschermende werkhandschoenen | |||
| Opnieuw in te vriezen harde ijspacks | 26.5×14.5×2.5 cm of groter | ||
| Rubberen luchtblazer | |||
| Snap cutter | |||
| Frisdrankfles | 500 ml, interne diameter ca. 65 mm | ||
| Sponsdop | |||
| Roestvrijstalen sponzen | |||
| Buisborstel | |||
| Viooltje | Φ34 mm × 90 mm |
Referenties
- Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- JoVE Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Drosophila melanogaster. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- Ashburner, M., Roote, J. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 585-599 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2004).
- Ashburner, M., Thompson, J. The laboratory culture of Drosophila. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, Academic Press. 1-109 (1978).
- Ratterman, D. M. Eliminating ether by using ice for Drosophila labs. Tested Studies For Laboratory Teaching. O'Donnell, M. A. , 259-265 (2003).
- Culturing techniques for Drosophila . , Available from: https://www.ptbeach.com/cms/lib/NJ01000839/Centricity/Domain/113/ap%20biology%20Labs/Culturing%20techniques%20for%20Drosophila.pdf (2019).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , Academic Press. (2006).
- Artiss, T., Hughes, B. Taking the Headaches Out of Anesthetizing Drosophila: A Cheap & Easy Method of Constructing Carbon Dioxide Staging. The American Biology Teacher. 69 (8), e77-e80 (2007).
- Qu, W. -H., Zhu, T. -B., Yang, D. -X. A Modified Cooling Method and its Application in Drosophila Experiments. Journal Of Biological Education. 49 (3), 302-308 (2015).
- Egg-laying cages for drosophila. , Available from: https://www.kisker-biotech.com/frontoffice/product?produitId=0H-19-17 (2018).
- Roberts, D. B. Drosophila: a practical approach. , 2nd edn, Oxford University Press. (1998).
- Tang, M., Peng, Q. -F., Yang, D. Two devices for Drosophila experiments (in Chinese). Bulletin of Biology. 45 (11), 49-50 (2010).
- Zhou, T. -y, Gan, J., Yang, D. Preparation of sponge plug and sponge plug based fly transferring device for Drosophila experiments (in Chinese). Bulletin of Biology. 46 (6), 49-50 (2011).
- Yang, D. Genetics laboratory investigation. , 3rd edn, Science Press. (2016).
- Yang, D. Carnivory in the larvae of Drosophila melanogaster and other Drosophila species. Scientific Reports. 8, (2018).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting Started: An Overview on Raising and Handling Drosophila. Drosophila: Methods and Protocols. Dahmann, C. , Humana Press. (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
