Method Article

Implementatie van een niet-lineaire Microscoop op basis van gestimuleerde Raman verstrooiing

DOI:

10.3791/59614

⸱

July 6th, 2019

 ,  ,  , 
1National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit manuscript wordt de implementatie beschreven van een gestimuleerde Raman verstrooiing (SRS) Microscoop, verkregen door de integratie van een SRS experimentele opstelling met een laser scanning microscoop. De SRS-Microscoop is gebaseerd op twee femtosecondelaser (FS) laserbronnen, een TI-Sapphire (TI: SA) en gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (OPO).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gestimuleerd Raman verstrooiing (SRS) microscopie maakt gebruik van near-infrarood excitatie licht; Daarom deelt het veel multi-photon microscopische Imaging-eigenschappen. SRS Imaging modaliteit kan worden verkregen met behulp van commerciële laserscannende microscopen door het uitrusten met een niet-gedescande voorwaartse detector met de juiste band pass-filters en het detectie schema van de lock-in versterker (LIA). Een schematische lay-out van een typische SRS-Microscoop omvat de volgende: twee gepulseerde laserstralen, (d.w.z. de pomp en sonde in een scan Microscoop), die moet worden overlapt in zowel ruimte en tijd op het beeldvlak, vervolgens gericht door een Microscoop doelstelling in het monster door twee scan spiegels (SMs), die de brandpunt in een x-y-vlak raster. Na interactie met het monster worden verzonden uitgangs pulsen opgevangen door een bovenobjectief en gemeten door een voorwaartse detectiesysteem dat in een omgekeerde Microscoop is ingebracht. Pomp pulsen worden verwijderd door een stapel optische filters, terwijl de sonde pulsen die het resultaat zijn van het SRS-proces dat zich voordoet in het brand volume van het preparaat, worden gemeten met een fotodiode (PD). De aflezen van de PD wordt door de LIA gedemoduleerd om de Modulatiediepte te extraheren. Een tweedimensionale (2D) afbeelding wordt verkregen door de voorwaartse detectie-eenheid te synchroniseren met de Microscoop Scaneenheid. In dit document wordt de implementatie van een SRS-Microscoop beschreven en met succes gedemonstreerd, evenals de rapportage van etiketten vrije beelden van polystyreen kralen met diameters van 3 μm. Het is vermeldenswaard dat SRS microscopen zijn niet commercieel beschikbaar, dus om te profiteren van deze kenmerken, de zelfgemaakte constructie is de enige optie. Aangezien SRS microscopie populair wordt op veel gebieden, wordt aangenomen dat deze zorgvuldige beschrijving van de implementatie van de SRS-Microscoop zeer nuttig kan zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In Life Science-toepassingen is SRS microscopie een krachtig hulpmiddel voor label vrije beeldvorming. Het basisidee van SRS microscopie is het combineren van de sterkte van trillational contrast en de mogelijkheid om beelden te verwerven in een paar seconden.

SRS is een proces waarbij het frequentieverschil tussen twee laserstralen frequenties (pomp signaal en Stokes signaal op verschillende frequenties) overeenkomt met de moleculaire trilling van een onderzocht monster, waardoor gestimuleerd Raman verstrooiing en een aanzienlijke verhoging van het Stokes signaal. In tegenstelling tot lineaire Raman-spectroscopie vertoont SRS een niet-line....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. het lasersysteem opstarten

  1. Controleer of de temperatuur van de koelmachines bij of onder 20 °C wordt gehandhaafd.
  2. Controleer of de vochtigheids regeleenheid goed werkt en of de luchtvochtigheid bij een waarde van ongeveer 40% blijft.
  3. Zet de TI: sa-laser aan, Volg strikt de instructies in de handleiding.
  4. Stel de golflengte in op 810 nm.
  5. Schakel de OPO en de aangesloten mini-computer in. Voer de toepassing die de OPO-Laser bestuurt.
  6. Selecteer bypass als 100% van de TI: sa Laser uitgang vereist is bij de uitgang van de OPO doos.
  7. Deselecteer bypass als 20% van de TI:....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een voorbeeld van SRS-meting (d.w.z. SRS-meting in één punt van het monster) wordt gerapporteerd in Figuur 7. Wanneer de balken niet in tijd of ruimte worden overlapt, wordt het verkregen resultaat gerapporteerd in figuur 8a. In Off-Resonance, de amplitude van het signaal gemeten door LIA is nul, terwijl de fase van het signaal gemeten door LIA springt tussen negatieve en positieve waarden. Overwegende dat, wanneer de liggers in de ruimte worden overlapt,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SRS microscopie heeft label-vrije beeldvorming naar nieuwe hoogten, vooral in studies van complexe biologische structuren zoals lipiden, die fundamenteel zijn voor cellen en cellulaire architectuur. Lipiden zijn betrokken bij meerdere fysiologische trajecten zoals productie van biologische membranen, en ze dienen als biosynthetische precursoren en signaal transducers10. Lipiden zijn verpakt in gespecialiseerde intracellulaire organellen, ook wel lipide druppeltjes (LDs). Hun diameters variëren van.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij waarderen V. Tufano van IMM CNR voor zijn waardevolle technische assistentie en Giacomo Cozzi, product specialist van Nikon Instruments, voor nuttige discussies en voortdurende ondersteuning. Dit werk werd deels gesteund door Italiaanse nationale operatieve Programma's PONa3 00025 (BIOforIU) en door euro-Bioimaging grootschalig panEuropean onderzoeksinfrastructuurproject.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acquisation toolNikonNikon C2ToolAcquisation supported tool
APE Pulse link control softwareAPE-APE Pulse link control softwaresoftware control
AutocorrelatorAPEAPE PulseCheck USB 50Autocorrelator
DetectorThorlabsThorlabs DET10APhotodiode
Detector cardThorlabsThorlabs VRCIR detector Card
Dichroic mirrorSemrockSemrock FF875-Di01-25X36Dichroic mirror
Dichroic mirrorSemrockFF875-Di01-25x36Dichroic mirror
EOMConoptics(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).Pockels cell
Fast detectorThorlabsThorlabs DET025AL/MPhotodiode
Fast mirror scanning unitNikonC2Microscpe scanning head
Femtosecond laser Ti:SACoherentCoherent Chameleon Ultra IIChameleon Ultra II
Function generatorTTiTG5011 AIM – TTiFunction generator
Inverted optical microscopeNikonEclipse TE-2000-E, NikonEclipse TE-2000-E, Nikon
Lock-in AmplifierStandford Research SystemSR844-200 MHz dual phaseA lock-in amplifier from Stanford Research Systems
Notch filter,SemrockNF03-808E-25Notch filter
Optical delay lineNewportNewport M-ILS200CCTunable optical delay line
Optical Parametric OscillatorCoherentCoherent Compact OPOCoherent Compact OPO
OscilloscopeWaveRunner640Zi 4GHz OSC/LeCroyDigital Oscilloscope
PCI CardNational instrumentNI PCIe 6363Data acquisation card
Position Sensors DetectorsNewportNewport Conex PSD9Position detector sensor
Power meter headCoherentPowerMax PM10,Laser power detector
Translation StagesThorlabsThorlabs PT1/MMeachnical Translation Stage with Standard Micrometer

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  2. Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stimulated Raman ScatteringNonlinear MicroscopyLaser AlignmentLock in AmplifierForward DetectionBeam OverlapLabel free ImagingPolystyrene BeadsVibrational ContrastMicroscope Implementation

Related Articles