Een muis model van vasculaire Heterotopic milt transplantatie voor het bestuderen van milt celbiologie en transplantatie immuniteit

Samenvatting

Dit protocol Details van de chirurgische stappen van een muismodel van vasculaire heterotopic milt transplantatie, een technisch uitdagend model dat kan dienen als een krachtig instrument in het bestuderen van het lot en de levensduur van de Miltcellen, de mechanismen van verschillende milt cel populaties in progressie van de ziekte, en transplantatie immuniteit.

Samenvatting

De milt is een unieke lymfe orgel dat een cruciale rol speelt in de homeostase van het immuunsysteem en hematopoietische systemen. Patiënten die splenectomie hebben ondergaan, ongeacht neerslaan oorzaken zijn vatbaar voor een overweldigende post-splenectomie infectie te ontwikkelen en de ervaring verhoogde Risico's van diepe veneuze trombose en maligniteiten. Onlangs, epidemiologische studies aangegeven dat splenectomie zou kunnen worden geassocieerd met het optreden van hart-en vaatziekten, wat suggereert dat fysiologische functies van de milt nog niet volledig zijn erkend. Hier introduceren we een muismodel van vasculaire heterotopic milt transplantatie, die niet alleen kan worden gebruikt om de functie en gedrags-activiteit van milt immuun cel subsets in verschillende biologische processen studie, maar ook kan een krachtig instrument om te testen het therapeutische potentieel van milt transplantatie bij bepaalde ziekten. De belangrijkste chirurgische stappen van dit model zijn donor milt oogst, het verwijderen van de ontvanger inheemse milt, en milt Graft revascularisatie. Met behulp van congenic muis stammen (bijv. muizen met CD 45.1/CD 45.2 achtergronden), hebben we opgemerkt dat na syngeneic transplantatie, zowel donor-afgeleide milt lymfocyten en myeloïde cellen gemigreerd uit de Graft zo vroeg post-operatieve dag 1, gelijktijdig met de instroom van meerdere soorten ontvangers cellen, waardoor het genereren van een unieke hersenschim.  Ondanks de relatief uitdagende technieken, kan deze procedure worden uitgevoerd met > 90% slaagkans. Dit model maakt het bijhouden van het lot, levensduur, en de functie van splenocyten tijdens steady state en in een ziekte setting na een milt transplantatie, waardoor het aanbieden van een grote kans om de duidelijke rol voor de milt afgeleide immuun cellen te ontdekken in verschillende ziekteprocessen.

Inleiding

De milt is het grootste secundaire lymfe orgaan in het lichaam en is kritiek in de immune en hematopoietische systemen. De functies worden voornamelijk uitgevoerd door twee morfologisch verschillende compartimenten, de rode pulp en de witte pulp¹. De rode pulp is een drie-dimensionale trabekelnetwerk van veneuze sinussen en milt koorden die bestaan uit reticulaire vezels, reticulaire cellen, en de bijbehorende macrofagen. Deze unieke structuur kan de rode pulp op te treden als een effectief bloed filter dat buitenlandse materialen en oude of beschadigde bezinkingen verwijdert. De witte pulp bevat follikels, marginale zone, en de periarteriolar lymfe scheden (PALS) en is een belangrijke site voor antigeen overvulling en verwerking, lymfocyten automatisch besturen, transformatie, proliferatie, en rijping². Niettemin, de milt is algemeen beschouwd als een uitvoerbaar orgaan, omdat andere lymfeorganen, zoals lymfeklieren, kan ook uitvoeren van een aantal van haar functies en het verlies van milt niet meestal leiden tot de dood. Splenectomie is daarom op grote schaal uitgevoerd als een therapeutische methode voor patiënten met milt letsel of goedaardige hematologische ziekten³. Echter, patiënten met splenectomie geconfronteerd met een aantal lange-termijn complicaties. Bacteriële infecties zijn de best-erkende complicaties van splenectomie^4,5. Onlangs heeft de overweldigende post-splenectomie sepsis is erkend als een intensieve complicatie van splenectomie geassocieerd met een hoge mortaliteit⁶. Bovendien blijkt uit recente epidemiologische studies dat splenectomie kan worden geassocieerd met het optreden van hart-en vaatziekten, wat suggereert dat verdere fysiologische functies van de milt nog moeten worden verkend^7,8.

Zowel milt transplantatie en milt allotransplantation zijn gebruikt in de kliniek. Momenteel, milt transplantatie door het implanteren van secties van milt weefsel in zakjes gemaakt in de grotere Omentum wordt beschouwd als de enige mogelijkheid voor het behoud van milt functie na traumatische splenectomie^9,10. Echter, de werkzaamheid van deze operatie is discutabel als post-chirurgie complicaties zoals aseptische necrose van de milt weefsel en kleine darmobstructie als gevolg van postoperatieve aanhechtingen kunnen optreden¹¹. Milt allotransplantation is betrokken bij multiviscerale transplantatie¹². Klinisch bewijs van multiviscerale transplantatie suggereert dat milt allotransplantation kan een beschermende rol spelen in kleine darm Allograft afwijzing zonder dat graft-versus-host Disease (GVHD)¹². Maar toch is de literatuur betreffende het gunstige effect van milt allotransplantation als component van multiviscerale transplantatie nog beperkt en de onderliggende mechanismen blijven worden bepaald. In 2006, Yair Reisner et al. gemeld dat transplantatie varken embryonale milt weefsel dat geen T-cellen heeft om muizen kon genezen hemofilie A, een genetische ziekte zonder dat GVHD¹³, ondersteuning van die milt transplantatie houdt therapeutische belofte in bepaalde ziekten. Daarom is er behoefte aan verder onderzoek naar het therapeutische potentieel van milt transplantatie.

De dierlijke modellen van milt transplantatie zijn waardevol om de niet gewaardeerde functie van de milt-afgeleide immune cellen in ziektevooruitgang te onderzoeken evenals het potentiële therapeutische effect van milt transplantatie te testen. Experimentele hele milt transplantatie modellen zijn gedocumenteerd sinds begin 1900, zoals beoordeeld door Cohen¹⁴. In 1969, Coburn Richard J. en Lee et al. gedetailleerd de techniek van milt transplantatie bij ratten^15,16. Meer recentelijk, Swirski FK et al. beschreven een muismodel van milt transplantatie¹⁷. Vergeleken met ratten modellen, Muismodellen van de milt transplantatie zijn aantrekkelijker te wijten aan de verschillende inherente voordelen. Bijvoorbeeld, door gebruik te maken van een muismodel, kunnen we toegang tot een expansieve verscheidenheid van reagentia die niet beschikbaar zijn voor die van Rat modellen. Bovendien, door het gebruik van congenic muizen (bijvoorbeeld muizen met CD 45.1/CD 45.2 achtergrond), een syngeneic milt transplantatie maakt het mogelijk om het lot, de levensduur en de functie van splenocyten¹⁸track. Gebaseerd op het werk van Swirski FK et al.¹⁷, hebben we dit vereenvoudigde en verbeterde Protocol van milt transplantatie in muizen verder vastgesteld. Het protocol hieronder beschreven combineert zowel betrouwbaarheid en haalbaarheid op een gestandaardiseerde wijze en kan worden gebruikt als een instrument om milt biologie en transplantatie immuniteit studie.

Protocol

Alle procedures en het gebruik van dieren in deze studie werden uitgevoerd volgens de protocollen goedgekeurd door de Northwestern University interne zorg en het gebruik Comite (DEC). In deze studie, 8 tot 10 week oude mannelijke CD 45.2 en CD 45.1 muizen (zowel op BALB/c achtergrond, van Jackson Laboratory) werden gebruikt als milt donoren en ontvangers, respectievelijk te creëren syngeneic milt transplantatie modellen. Alle dieren werden gehuisvest in de steriele omgeving in de dieren faciliteiten van de Northwestern University. Het oog smeermiddel werd toegepast op alle muizen post-anesthetization om droogte te voorkomen.

1. chirurgische voorbereiding, anesthetization, en analgesie regime

1. Plaats een steriel wegwerp Laken (45,7 cm x 66 cm) op het chirurgische platform. Grijp voorzichtig de muis, injecteren ketamine (50 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) ze intraperitoneaal (i. p) voor anesthesie, en injecteren 0,05 mg/kg buprenorfine onderhuids voor analgesie.
2. Zorg voor de diepte van de anesthesie door teen-pinch, scheren het haar in de hele buik gebied met een scheermes en plaats de muis op de steriele chirurgische platform onder de operationele Microscoop op 6-10x vergroting.

2. donor milt oogst

1. Steriliseer de buik met een alcohol prep pad, veilig de ledematen met chirurgische tape, en maak een 3-4 cm middellijn verticale huid incisie van de pubis aan de xiphoid proces met een schaar.
2. Intrekken van de buikwand met steriele OPROLMECHANISMEN gemaakt van paperclips. Verplaats de darmen naar de rechterflank van de buik (chirurg links) kant met een steriele wattenstaafje om de milt bloot. Toeschroeien de korte maag ader verbonden aan de milt met een steriele lage temperatuur cauterisatie (Figuur 1a). Plaats een stuk steriel gaas gedrenkt met 37 ° c zout over de milt te houden vochtig (Figuur 1b).
3. Scheiden en mobiliseren van de poortader van de pancreas weefsel (figuur 1c) door ligating de poortader takken (superieure pancreaticoduodenal ader en rechter maag ader); plaats een hechtdraad rond de poortader DISTAAL van de milt ader (figuur 1d).
4. Flip de milt aan de rechterkant om de aorta en coeliakie stam bloot met de milt slagader (Figuur 1e). Ontleden en mobiliseren aorta-coeliakie-milt slagader door ligating de Leverslagader en maag slagader; plaats een hechtdraad rond de aorta proximaal van de coeliakie slagader (Figuur 1f-G).
5. Injecteren 100 internationale eenheden (IU) heparine in de inferieure vena cava (IVC) om het hele lichaam te heparinize en 3 minuten wachten om de heparine te verzekeren effecten te nemen. Binden de aorta proximaal aan coeliakie slagader, transect de poortader, en vervolgens perfuse het hele lichaam met behulp van 10 mL van heparinized koude (4 ° c) zoutoplossing (10 mL/20 s) van de abdominale aorta DISTAAL naar coeliakie stam (figuur 1h).
6. Verzamel de milt Graft en bloc met de bijbehorende aorta-coeliakie-milt segment en de poortader samen met een segment van milt ader en een klein deel van de pancreas weefsel. Behoud van de graft in 5 mL van 4 °C zoutoplossing vóór transplantatie. Euthanaseren de muis door cervicale dislocatie.

3. ontvanger splenectomie en milt enten implantatie

1. Plaats een verwarmingskussen op het chirurgische platform en stel de temperatuur in op 37 °C. Plaats een steriel Laken (45,7 cm x 66 cm) bovenop het verwarmingskussen om een steriel chirurgisch platform te creëren. Herhaal de stappen 2,1 en 2,2 voor chirurgische voorbereiding en anesthetization. Maak een 3-4 cm middellijn incisie en trek de buikwand zoals beschreven in stap 2,1 en stap 2,2.
2. Voorzichtig Beweeg de darm naar de rechterkant van de muis met een steriele wattenstaafje aan de ontvanger de milt bloot. Binden de milt ader en slagader en verwijder de milt.
3. Voorzichtig Beweeg de darm naar de linker kant van de muis en bedek de darmen met natte gaas (gedrenkt met steriele 37 °C zoutoplossing). Ontleden en binden de lumbale takken van de infrarenal aorta en IVC; Cross-Clamp de infrarenal aorta en IVC met behulp van twee 4 mm microvasculaire klemmen.
4. Plaats een 11-0 nylon hechting door de infrarenal aorta (een volledige dikte) en trekken om een elliptische aortotomy te maken door een enkele snede met een microschaar (de lengte moet overeenkomen met de diameter van de donor aorta, Figuur 2a). Pierce het IVC met een 30 G naald om een elliptische venotomy te creëren en de opening te verlengen tot donor poortader-matched lengte met behulp van microschaar (Figuur 2a).
5. Wis het intraluminal bloed of bloedstolsel (in de aorta en IVC) met 500 l van heparinized Saline (10 eenheden/mL).
6. Plaats de milt graft in de rechterflank van de ontvanger muis buik; Identificeer zorgvuldig de aorta manchet van de donor en de poortader van de donor. Na ervoor te zorgen dat de schepen niet zijn gedraaid, bedek de milt Graft met gaas gedrenkt met koude (4 ° c) zoutoplossing.
7. Sluit de aorta manchet van de donor aan op de proximale en distale Apex van de aortaotomy van de ontvanger met twee verblijf hechtingen (11-0 nylon hechting, zelfde als hieronder) (Figuur 2b, C). Maak een anastomosis met 2-3 beten van ononderbroken 11-0 nylon hechtingen tussen de aorta manchet van de donor en de aortaotomy (voorste wand) van de ontvanger (figuur 2D). Draai de milt enten naar de linkerkant van de ontvanger; Maak de anastomosis tussen de aorta manchet van de donor en de aortotomy (achterste wand) van de ontvanger (figuur 2e).
8. Voer een anastomosis uit om de poortader van de donor aan te sluiten op de achterste wand van het IVC van de ontvanger, met 4 tot 5 beten van ononderbroken hechtingen aan de binnenzijde van het IVC en sluit vervolgens de hechtdraad aan de buitenkant van het IVC (figuur 2F, G).
9. Laat het schip klemmen en gebruik steriele wattenstaafje om tamponade bloeden totdat de milt kleur wordt teruggewonnen (figuur 2H).
10. Sluit de buik met een 5-0 synthetische absorbeerbare vicryl hechting in een doorlopend patroon. Sluit de huid laag met een 5-0 nylon hechting in een onderbroken patroon.
    Opmerking: Voor de stappen 4.7-4.8, alternatief, maak een anastomosis tussen de poortader van de donor en het IVC van de ontvanger eerst (stap 4,8); Maak dan een anastomosis tussen de aorta manchet van de donor en de achterste wand van de aortotomy van de ontvanger, met behulp van 2 tot 3 doorlopende hechtingen in de binnenkant van de aorta en sluit de hechtdraad aan de buitenkant van de aorta.

4. terugwinning van dieren

1. Injecteer 1 mL warme zoutoplossing onderhuids via 4 afzonderlijke locaties (0,25 mL/locatie) na het sluiten van de buik.
2. Houd de muis in een incubator met temperatuur gecontroleerde (30 ° c) voor de eerste paar uur na de operatie, de muis te controleren totdat zij heeft weer voldoende bewustzijn, en breng de muis naar een nieuwe schone kooi met regelmatig voedsel en water, met een verwarming pad (30 ° c ) onder de kooi. Houd de muis na de operatie in een aparte kooi.

5. post-chirurgische pijnbestrijding

1. Injecteren 0,05 mg/kg buprenorfine onderhuids 24 h en 48 h na de operatie te handhaven analgesie regime.

Resultaten

De hele procedure van de muis milt transplantatie kan worden voltooid binnen 90 min door ervaren microchirurgen. Ons laboratorium heeft uitgevoerd meer dan 100 milt transplantaties bij muizen. Het succespercentage is meer dan 90%, zoals gedefinieerd door het voortbestaan van zowel de ontvanger muis en de milt Graft op post-operatieve dag (POD) 1 of POD 7 (onze studie eindpunt). Het voortbestaan van de milt Graft werd bevestigd door de macroscopische verschijning en stroming Cytometry anal...

Discussie

Overtuigend bewijs suggereert dat milt-afgeleide monocyten spelen een belangrijke rol in steriele inflammatoire processen zoals atherosclerose¹⁹, acute ischemische hersenen²⁰ of longschade¹⁸, evenals myocard I/R letsel en het verbouwen van^21,22,23. Deze rapporten benadrukken de ondererkenning rol van de milt bij veel chronische ziekten, waarvan hart-en vaatz...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparine-oplossing	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injectiekwaliteit normale zoutoplossing	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf naaldhouder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra fijne micro-dissectie schaar	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 zijde	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon op 4 mm (3/8) naald	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antilichaam	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antilichaam	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antilichaam	BD Bioscience	557657
Ms B220 antilichaam	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antilichaam	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antilichaam	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antilichaam	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antilichaam	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antilichaam	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antilichaam	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antilichaam	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955