Hier presenteren we een protocol voor het verwerken van vers beenmerg (BM) geïsoleerd van muis of mens voor High-dimensionale massa Cytometry (Cytometry door time-of-Flight, CyTOF) analyse van neutrofiele-Lineage cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In dit artikel presenteren we een protocol dat is geoptimaliseerd voor het behoud van neutrofiele-Lineage cellen in Fresh BM voor hele BM CyTOF analyse. We gebruikten een myeloïde-bevooroordeelde 39-antilichaam CyTOF panel om de hematopoietische systeem te evalueren met een focus op de neutrofiele-Lineage cellen met behulp van dit protocol. De CyTOF resultaat werd geanalyseerd met een open-resource dimensionale reductie algoritme, viSNE, en de gegevens werd gepresenteerd aan de uitkomst van dit protocol aan te tonen. We hebben ontdekt nieuwe neutrofiele-Lineage Cell populaties op basis van dit protocol. Dit Protocol van verse hele BM voorbereiding kan worden gebruikt voor 1), CyTOF analyse om niet-geïdentificeerde cel populaties te ontdekken van hele BM, 2), het onderzoeken van hele BM gebreken voor patiënten met bloedziekten zoals leukemie, 3), assisteren optimalisering van fluorescentie-activated flow Cytometry protocollen die gebruik maken van verse hele BM.
Inleiding
In de afgelopen decennia, Cytometry methoden zijn een krachtig instrument om het hematopoietische systeem te onderzoeken in de BM. Deze methodes omvatten fluorescentie-geactiveerde Stroom Cytometry en de nieuwe methode van CyTOF gebruikend zware metaal-geëtiketteerde antilichamen. Ze hebben geleid tot ontdekkingen van vele soorten cellen in een heterogene biologisch specimen door identificatie van hun unieke oppervlakte marker expressieprofielen. Verhoogde spectrum overlappingen die geassocieerd zijn met meer kanalen leidt tot hogere gegevens onnauwkeurigheid in fluorescentie-activated flow Cytometry toepassingen. Daarom worden ongewenste cellen routinematig verwijderd om de cel populaties van belang te verrijken voor fluorescentie-activated flow Cytometry analyse. Bijvoorbeeld, Ly6G (of GR-1) en CD11b worden beschouwd als volwassen myeloïde Cell markers en Ly6G+ (of GR-1+) en CD11b+ cellen worden routinematig verwijderd uit BM monsters met behulp van magnetische verrijking kits voorafgaand aan flow Cytometry analyse van hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) of door het combineren van deze markers in een dump cocktail kanaal1,2,3. Een ander voorbeeld is dat neutrofielen routinematig uit menselijk bloed specimen worden verwijderd om perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) voor immunologische studies te verrijken. Hele beenmerg geïsoleerd van de muis of de mens, echter, is zelden onderzocht intact voor Cytometry analyse.
Onlangs is CyTOF een revolutionair hulpmiddel geworden om het hematopoietische systeem4,5,6te onderzoeken. Met CyTOF, worden de fluorophore-geëtiketteerde antilichamen vervangen door zwaar element reporter-geëtiketteerde antilichamen. Deze methode maakt het mogelijk voor de meting van meer dan 40 markers gelijktijdig zonder de zorg van het spectrum overlap. Het heeft de analyse van intact biologisch specimen zonder pre-uitputtings stappen of een stortplaats kanaal toegelaten. Daarom kunnen we het hematopoietische systeem uitvoerig bekijken met een hoge-inhoud dimensionaliteit van conventionele 2-D flow Cytometry percelen. Cel populaties weggelaten in het verleden tijdens uitputting of gating proces kan nu worden gebracht in het licht met de High-dimensionale gegevens gegenereerd door CyTOF4,5. We hebben een antilichamen paneel ontworpen dat gelijktijdig 39 parameters in het hematopoietische systeem meet met een focus op de myeloïde linage7. Vergeleken met de conventionele flow Cytometry gegevens, de interpretatie en visualisatie van de ongekende single-cell High-dimensionale gegevens gegenereerd door CyTOF is een uitdaging. Computationele wetenschappers hebben ontwikkeld dimensionaliteit reductie technieken voor de visualisatie van High-dimensionale datasets. In dit artikel, gebruikten we het algoritme, viSNE, die t-Distributed stochastische buurman inbedding (t-GND) techniek gebruikt om de CyTOF gegevens te analyseren en om de High-dimensionale resultaat presenteren op een 2-dimensionale kaart, terwijl het behoud van de High-dimensionale structuur van de gegevens8,9,10. Op de tSNE plot worden soortgelijke cellen gegroepeerd in subsets en de kleur wordt gebruikt om de functie van de cellen te markeren. Bijvoorbeeld, op Figuur 1 worden de myeloïde cellen verdeeld in meerdere cel subsets gebaseerd op de gelijkenissen van hun expressie patronen van 33 oppervlakte markers vloeide voort uit CyTOF (Figuur 1)4. Hier hebben we onderzocht muis beenmerg met onze eerder gemelde 39-marker CyTOF panel door viSNE Analysis7. viSNE analyse van onze CyTOF gegevens bleek een niet-geïdentificeerde cel populatie die zowel HSPC (CD117+) en neutrofiele (Ly6G+) kenmerken (Figuur 2)7toonde.
Samenvattend, presenteren wij een protocol om vers geheel beenmerg voor CyTOF analyse te verwerken. In dit artikel, gebruikten we muis beenmerg als een voorbeeld, terwijl dit protocol kan ook worden gebruikt voor het verwerken van menselijk beenmerg monsters. De details die specifiek zijn voor het menselijk beenmerg monsters zijn ook vermeld in het protocol als goed. Het voordeel van dit protocol is dat het Details zoals incubatietijd en temperatuur bevat die werden geoptimaliseerd om neutrofiele-Lineage cellen in het gehele beenmerg te bewaren om onderzoek op het intacte gehele beenmerg toe te laten. Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast voor fluorescentie-activated flow Cytometry toepassingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten volgden goedgekeurde richtlijnen van het Instituut van La Jolla voor allergie en immunologie de dierlijke zorg en het gebruiks Comité, en de goedkeuring voor het gebruik van knaagdieren werden verkregen van het Instituut van La Jolla voor allergie en immunologie volgens criteria die in de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de nationale gezondheidsinstituten.
1. het beenmerg van de oogstmuis (BM)
- Koop C57BL/6J muizen van een commerciële leverancier. Voer de standaard knaagdier Chow dieet en huis in microisolator kooien in een pathogeen-vrije faciliteit.
- Gebruik mannelijke muizen, 6-10 weken oud, voor experimentele doeleinden. Euthanaseren door CO2 inhalatie gevolgd door de cervicale dislocatie.
- Plaats de muis op een steriele chirurgische pad met de buikkant omhoog. Steriliseer de huid van de buik en achterpoten gebied door het spuiten van 70% ethanol. Gebruik een paar van ontleden chirurgische schaar te snijden de buikholte open.
- Verwijder de huid om achterpoten bloot te leggen. Gebruik een paar stomp-Tip dressing tang om de muis te houden Tibia recht onder de enkel. Gebruik een ander paar gebogen dressing tang om de Tibia te stabiliseren onder de stomp-Tip dressing Tang. Breek het scheenbeen en bloot het bot door het rippen van de spier met de stompe-Tip dressing Tang.
Opmerking: Het scheenbeen is losjes bevestigd aan de kniegewricht en kan gemakkelijk worden uitgekozen met behulp van de stompe-Tip dressing Tang. - Plaats het scheenbeen in koude 1x PBS.
- Vervolgens Verplaats de stabiliserende gebogen dressing Tang naar beneden naar het dijbeen. Schuif de stompe-Tip dressing Tang onder het kniegewricht en houd de Kneecap. Verplaats de Kneecap door voorzichtig te trekken it up. Bloot het dijbeen door het rippen van de spier verbonden aan de Kneecap. Houd de blootgestelde femur door de gebogen dressing Tang en snijd het dijbeen af van de onderkant van het bot met behulp van ontleden chirurgische schaar.
- Plaats het dijbeen in koude 1x PBS.
- Punch een gat in 0,5 mL micro centrifugebuis met een 18 G naald.
- Plaats zowel Tibia en femur in dezelfde 0,5 mL micro centrifugebuis met het open uiteinde van de botten naar beneden naar beneden naar het gat.
- Plaats de 0,5 mL buis met zowel Tibia en femur in een 1,7 mL micro centrifugebuis.
- Draai de dubbele gelaagde buizen met zowel Tibia en femur op 5.510 x g voor 30 s in de micro-centrifuge.
- Zorg ervoor dat de BM wordt geëxtraheerd uit de botten en pelletjes aan de onderkant van de buis. Gooi de 0,5 mL tube met de heilige botten. De muis BM is klaar voor de volgende stappen.
Nota: menselijke BM wordt geoogst bij klinische middelen zoals eerder beschreven11.
2. vlek BM cellen voor CyTOF
- De BM opnieuw op te schorten in 1 mL 1x rode bloedcel (RBC) lysis buffer. Voor menselijke BM, opnieuw op te schorten de hele BM in een 10x volume van 1x rode bloedcel (RBC) lysis buffer. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Draai de buis bij 350 x g voor 5 min bij 4 °c. Voor menselijke BM, herhaal stap 2,1 en 2,2 alvorens aan stap 2,3 te werk te gaan.
- Zorgvuldig aspireren de bovendrijvende en laat de pellet ongestoord. Hersuspendeer de pellet met 1 mL koude 1x PBS. Filter de pellet in een 15 mL kegelvormige buis door middel van een 70 μm cel zeef. De BM cellen zijn nu volledig geïsoleerd in de buis van de spier-en been puin. Was de cellen door toevoeging van 9 mL koude 1x PBS in de buis.
- Draai de 15 mL Tube bij 350 x g voor 5min bij 4 °c.
- Zorgvuldig aspireren de bovendrijvende en de BM-cellen opnieuw op te schorten met 10 mL koude PBS. Neem een hoeveelheid cellen voor het tellen. Cellen tellen met een hemocytometer.
- Hoeveelheid 5 x 106 BM-cellen in een nieuwe 15 ml buis voor CyTOF kleuring.
- Draai de 15 mL buis hoeveelheid op 350 x g voor 5 min bij 4 °c.
- Zorgvuldig aspireren de bovendrijvende en de BM-cellen opnieuw op te schorten met 125 nM cisplatine in 1 mL van CyTOF kleuring buffer als een levensvatbaarheid indicator voor het monster. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
- Na incubatie, Voeg 4 mL CyTOF kleuring buffer aan de buis. Draai de buis bij 350 x g voor 5 min bij 4 °c. Voor menselijke BM, voeg 10% humaan AB serum in de CyTOF kleuring buffer.
- Zorgvuldig aspireren de bovendrijvende en de BM-cellen opnieuw op te schorten met 50 µ L van FC receptor blokkerende oplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C. Sla deze stap voor menselijke BM.
- Voeg 50 µ L van de zelfgemaakte CyTOF antilichaam cocktail5 op het monster, zodat de totale kleuring volume is 100 l. Voorzichtig te mengen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C. Het uiteindelijke volume van de antilichaam cocktail is 100 l voor zowel Mouse BM en menselijke BM samples.
- Voeg 2 mL CyTOF vlekken buffer toe aan elke buis na de incubatie om de cellen te wassen, draai de buis bij 350 x g voor 5 min bij 4 °c.
- Herhaal stap 2,12 voor een totaal van twee wasbeurten.
- Bereid een verse 1,6% formaldehydeoplossing van de 16% voorraad ampul. Verdun 1 deel van de voorraad formaldehyde met 9 delen van 1x PBS.
- Zorgvuldig aspireren de bovendrijvende en de pellet opnieuw op te schorten met 1 mL verse 1,6% FA oplossing. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
- Draai de buis bij 800 x g voor 5 min bij 4 °c.
- Zorgvuldig aspireren de bovendrijvende en opnieuw op te schorten de cel pellet met 125 nM tussenvoeging oplossing in 1 mL Fix/Perm buffer.
- Incubeer het monster in tussenvoeging oplossing overnachting bij 4 °C.
3. bereid cellen voor CyTOF acquisitie
- Draai en draai de cellen zachtjes op 800 x g voor 5 min bij 4 °c.
- Cellen wassen door toevoeging van 2 mL CyTOF kleuring buffer, spin cellen bij 800 x g voor 5 min bij 4 ° c en verwijder de bovendrijvende door aspiratie.
- Hersuspendeer de cellen in 1 mL diH2O. Reserveer een klein volume (ongeveer 10 µ l) van elke buis om cellen te tellen.
- Spin cellen bij 800 x g voor 5 min bij 4 °c.
- Herhaal stap 3,3 en 3,4.
- Zorgvuldig aspireren de bovendrijvende en laat de cellen in de pellet. De BM-cellen zijn nu klaar voor herschorsing van de concentratie van 1 x 106 cellen/ml voor CyTOF acquisitie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 wordt gepresenteerd als een voorbeeld resultaat van CyTOF experimenten. Op deze tSNE plot de cellen over meerdere muis weefsels werden geclusterd in deelverzamelingen op basis van de gelijkenis van hun oppervlakte marker expressieprofielen gemeten door een 33-parameter CyTOF paneel. Cellen met meer vergelijkbare eigenschappen werden automatisch gegroepeerd, zoals de neutrofielen, macrofagen, of de DCs gebaseerd op de expressie van de 33 markers op elke cel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In de afgelopen decennia, fluorescentie-based flow Cytometry werd gebruikt als de belangrijkste methode om cellulaire lineages en heterogeniteit1,2,3studie. Hoewel flow Cytometry heeft multi-dimensionale gegevens, deze methode is beperkt door keuzes van parameters en spectrale overlap. Om de zwakheid van Stroom Cytometry te overwinnen namen wij voordeel van CyTOF, die zware metaal isotopen in plaats van fluorophores gebruikt om ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen graag de LJI flow Cytometry core bedanken voor hulp bij de massa Cytometry procedure. Dit werk werd gesteund door NIH verleent R01HL134236, P01HL136275, en R01CA202987 (allen aan C. C. H) en ADA7-12-MN-31 (04) (aan C.C.H. en Y. P. Z).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set |
Referenties
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
- Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
- Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).
- Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
