Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen

Samenvatting

Dit protocol maakt gebruik van een sonde-gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), een sulforhodamine B (SRB) Assay, 3 ' onvertaalde gebieden (3 ' UTR) klonen, en een plaats assay om de doel genen van een Mirna van belang te controleren en om de functies van miRNAs te begrijpen.

Samenvatting

MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine regelgevende Rna's die worden erkend voor het moduleren van talrijke intracellulaire signalering trajecten in verschillende ziekten, waaronder kankers. Deze kleine regelgevende Rna's communiceren voornamelijk met de 3 ' onvertaalde gebieden (3 ' UTR) van hun doel Messenger RNAs (Mrna's), wat uiteindelijk resulteert in de remming van decoderings processen van Mrna's en de augmentatie van doel mRNA-degraderingen. Op basis van de uitdrukkings niveaus en intracellulaire functies zijn miRNAs in staat om te dienen als regelgevende factoren van oncogene en tumor suppressieve Mrna's. Identificatie van bonafide doel genen van een miRNA tussen honderden of zelfs duizenden computationeel voorspelde doelen is een cruciale stap om de rollen en elementaire moleculaire mechanismen van een miRNA van belang te onderscheiden. Verschillende miRNA target Voorspellings Programma's zijn beschikbaar om te zoeken naar mogelijke interacties van miRNA-mRNA. De meest uitdagende vraag is echter hoe je directe doel genen van een miRNA van belang moet valideren. Dit protocol beschrijft een reproduceerbare strategie van belangrijke methoden om miRNA-doelen te identificeren die verband houden met de functie van een miRNA. Dit protocol presenteert een praktische gids over stapsgewijze procedures om miRNA-niveaus,-functies en gerelateerde doel-Mrna's te achterhalen met behulp van de sonde-gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), sulforhodamine B (SRB)-assay na een miRNA-nabootsen transfectie , dosis-responscurve generatie, en plaats assay samen met het klonen van 3 ' UTR van een gen, die nodig is voor een goed begrip van de rollen van individuele miRNAs.

Inleiding

MicroRNAs (miRNAs) zijn de kleine regelgevende Rna's die voornamelijk het proces van vertaling en afbraak van boodschapper Rna's (Mrna's) moduleren door te reageren op de 3 ' onvertaalde gebieden (3 ' UTR) in bonafide doel genen¹. De expressie van miRNAs kan worden gereguleerd door transcriptionele en post-transcriptionele mechanismen. De onevenwichtigheid van dergelijke regelgevende mechanismen brengt ongecontroleerde en onderscheidende miRNAs-uitdrukkings niveaus in tal van ziekten, waaronder kanker². Eén enkele miRNA kan meerdere interacties met diverse Mrna's hebben. Dienovereenkomstig kan een individuele mRNA worden bestuurd door verschillende Mirna's. Daarom, intracellulaire signalering netwerken worden ingewikkeld beïnvloed door duidelijk uitgedrukt miRNAs waardoor fysiologische aandoeningen en ziekten kunnen worden geïnitieerd en verslechterd^{2,3,4, 5 , 6}. Hoewel de veranderde expressie van miRNAs is waargenomen in verschillende soorten kankers, zijn de moleculaire mechanismen die de manieren van kankercellen in combinatie met miRNAs moduleren nog steeds grotendeels onbekend.

Accumulerend bewijsmateriaal toont aan dat de oncogene of tumor suppressieve rollen van miRNAs afhangen van de soorten kanker. Door bijvoorbeeld te richten op Forkhead Box O3 (FOXO3) bevordert miR-155 de celproliferatie, metastase en chemoresistance van colorectale kanker^7,8. Daarentegen wordt de beperking van glioom celinvasie geïnduceerd door miR-107 via de regulatie van neurogene Locus notch homo Protein 2 (NOTCH2) expressie⁹. De beoordeling van miRNA-target interacties in verband met miRNA-functies is een onmisbaar onderdeel om beter te begrijpen hoe miRNAs verschillende biologische processen regelt in zowel gezonde als zieke Staten¹⁰. Bovendien kan de ontdekking van het bonafide doelwit (en) van miRNAs verder een nauwkeurig afgestemde strategie bieden voor een op miRNA gebaseerde therapie met verschillende anti-kankergeneesmiddelen. De belangrijkste uitdaging op het gebied van miRNAs is echter de identificatie van directe targets van miRNAs. Hier worden gedetailleerde methoden gepresenteerd als reproduceerbare experimentele benaderingen voor de doelbepaling van het miRNA-doelwit. Succesvol experimenteel ontwerp voor de doel identificatie miRNA omvat verschillende stappen en overwegingen (Figuur 1). Vergelijking van volwassen miRNA-niveaus in tumorcellen en normale cellen kan een van de gebruikelijke procedures zijn om een miRNA van belang te selecteren (Figuur 1a). De functionele studie van een geselecteerde miRNA om de effecten van een miRNA op celproliferatie op te sporen is belangrijk om de lijst van de beste potentiële kandidaatdoelen van een miRNA van belang te verfijnen (Figuur 1b). Op basis van de experimenteel gevalideerde functies van miRNAs is een systematische beoordeling van literatuur en database in bedrijf met een miRNA target Voorspellings programma vereist om de meest relevante informatie over genfuncties te doorzoeken (figuur 1c). De identificatie van reële doel genen van een Mirna van belang kan worden bereikt door het uitvoeren van experimenten zoals de plaats-assay samen met het klonen van 3 ' UTR van een gen, real-time PCR en Western blotting (figuur 1d). Het doel van het huidige protocol is om uitgebreide methoden te bieden voor belangrijke experimenten, de op sonde gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay na een nabootsen van de miRNA-transactie, het genereren van dosis-responscurve, en plaats assay samen met het klonen van 3 ' UTR van een gen. Het huidige protocol kan nuttig zijn voor een beter begrip van de functies van individuele miRNAs en de implicatie van een miRNA bij kankertherapie.

Protocol

1. volwassen MicroRNA (miRNA) expressie analyse

1. Volwassen miRNA complementaire DNA (cDNA) synthese
   1. Voeg 254 ng totaal RNA en 4,5 μL deoxyribonuclease I (DNase I)-mengsels toe en voeg vervolgens ultrapuur water toe aan PCR-strip buizen om tot 18 μL (Figuur 2a) te maken. Bereid de reactie voor elk totaal RNA-monster gezuiverd uit verschillende cellijnen met voldoende hoeveelheid DNase I-mengsels op basis van het totale aantal reacties.
      Opmerking: DNase I-mengsels zijn samengesteld uit DNase I (1,8 μL), ribonuclease-remmer (0,3 μL) en 25 mM MgCl₂ (2,4 μl). Om totaal RNA reproduceerd te verkrijgen, werd een op kolom gebaseerde extractiemethode gebruikt in plaats van een fenol-chloroform gebaseerde extractiemethode. Er werd gemeld dat de extractieopbrengst van sommige mirna's kan worden gevarieerd afhankelijk van het aantal cellen bij het gebruik van een fenol-chloroform gebaseerde extractiemethode^11,12.
   2. Inincuberen van de buizen in een thermische cycler. Voer de buizen gedurende 10 min bij 37 °C en verwarm de DNase I door 5 minuten incubatie bij 90 °C. Leg de buisjes na incubatie onmiddellijk op het ijs.
   3. Breng 7,1 μL DNase I behandeld totaal RNA over in 2 sets nieuwe buisjes en voeg vervolgens 1,5 μL antisense primers toe voor het Glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) gen (Figuur 2b).
      Opmerking: De hoeveelheid totaal RNA voor cDNA synthese wordt 100 ng bij deze stap. De voorraad concentratie van GAPDH antisense primers is 10 μM. het toevoegen van GAPDH antisense primers is voor het genereren van GAPDH cDNAs met behulp van een genspecifieke primer methode.
   4. Inincuberen van de buizen met behulp van een thermische cycler. Begin bij 80 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door de reactie bij 60 °C gedurende 5 min. plaats de buisjes onmiddellijk na incubatie op ijs.
   5. Voeg in elke reactie (Figuur 2b) 3,4 μL omgekeerde transcriptie (RT)-enzym mengsels toe. RT-enzym mengsels zijn samengesteld uit 100 mM deoxyribonucleotide-trifosfaten (0,15 μL), 10x RT-buffer (1,5 μL), ribonuclease-remmer (0,75 μL) en reverse transcriptie-enzym (1 μL). Bereid voldoende hoeveelheid mengsels op basis van het totale aantal reacties.
   6. Voeg 3 μL 5x RT primers toe voor een specifieke miRNA in elke reactie (Figuur 2b).
      Opmerking: Het totale volume is 15 μL voor elke reactie.
   7. Voer de buizen met behulp van een thermische cycler. Start bij 16 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door de reactie bij 42 °C gedurende 30 minuten, en tot slot bij 85 °C gedurende 5 min. Houd bij 4 °C gedurende de resterende tijd (Figuur 2b). Enkel gestrande Cdna's worden in deze stap gegenereerd voor zowel een specifiek miRNA-als een GAPDH-gen in dezelfde buis.
2. Real-time polymerase kettingreactie (PCR) en data-analyse
   1. Verdun elke cDNA met ultrapuur water bij een verhouding van 1:49.
   2. Bereid de reactie mengsels voor op een specifieke miRNA en GAPDH (tabel 1). Voor de detectie van een specifieke Mirna en gapdh, instellen van drievoud reacties voor elk cDNA monster.
   3. Voer de real-time PCR en data-analyse uit (figuur 2c). Analyseer gegevens met behulp van de vergelijkende C_T methode^13,14.

2. MicroRNA (miRNA) MimicTransfection

Opmerking: Mirna-107 is geselecteerd uit stap 1. Aangezien miRNA-107 is down-gereguleerd in tumorcellen in vergelijking met normale cellen, het kan worden gespecbeerd dat miRNA-107 is een tumor suppressieve miRNA. In het geval van een miRNA die up-gereguleerd is in tumorcellen in vergelijking met normale cellen (bijv.mirna-301), kan antisense oligonucleotiden tegen mirna-301 worden toegepast voor de stappen 2, 3 en 4.

1. Tel de cellen met een telkamer apparaat en plaat de cellen in een 96-goed plaat. Celdichtheid is 2 x 10³ cellen/100 μL voor elke put. Gebruik geen celkweek media die penicillaire-streptomycine (P/S) bevatten omdat P/S de transfectie-efficiëntie kan verminderen.
2. Bereid een set transfectie mengsels om de cellen te transfect bij verschillende eindconcentraties miRNA Control nabootsen en miRNA-107 na te bootsen op de volgende dag (Figuur 3).
   1. Van de voorraad (25 μM-concentratie) miRNA-controle nabootsen of miRNA-107 nabootsen, verdunnen en toevoegen van overeenkomstige hoeveelheid controle nabootsen of miRNA-107 nabootsen in de gereduceerde serum Media samen met een transfectiereagens met behulp van microcentrifuge buizen (Figuur 3a). Meng de oligo bevattende mengsels zachtjes met behulp van een micro pipet. De totale hoeveelheid oligos (miRNA nabootsen Control + miRNA-107 nabootsen) moet in elk goed hetzelfde zijn. Lege putten omvatten 100 μL celkweek media en gereduceerde serum media die een transfectie-reagens zonder cellen bevatten.
3. Meng na een incubatie van 10 minuten in een celcultuurkap zachtjes de oligo die mengsels bevat en voeg vervolgens 50 μL van de mengsels toe aan elk goed. Bewaar de cellen in een celkweek incubator. Vervang het transfectiereagens met media met de verse celkweek media die zowel foetaal runderserum (FBS) als P/S na 6-12 h incubatie bevatten. Verdere incuberen de cellen voor 72 h. De totale behandelingsduur van miRNA nabootsen is 96 uur.

3. sulforhodamine B (SRB) test

1. Celfixatie
   1. Verwijder de celkweek media in elke put van de plaat en vul snel 100 μL van 10% Trichloorazijnzuur (TCA) in elke put. Aspiraat de celkweek media van elk goed om celbeschadiging en loslating van de bodem te voorkomen.
      Opmerking: Bereid 40% TCA voor door 20 g TCA poeder toe te voegen aan 50 mL gedistilleerd water. Van 40% TCA, maken 10% TCA door verdunning 40% TCA met gedestilleerd water met een 1:3 verdunningsverhouding.
   2. Bewaar de plaat met 10% TCA in een koelkast (4 °C) gedurende 1 uur.
   3. Was de plaat meerdere malen door in het water bad te smelten en te drogen. Verwijder overtollig water uit de putjes door op de plaat te tikken totdat er geen water meer in de putjes zit. Laat de plaat op een laboratorium Bank drogen voordat u naar de volgende stap gaat.
2. Celkleuring
   1. Pipetteer 50 μL van 0,4% SRB-oplossing in elk putje inclusief lege putten. Schud de plaat zachtjes tot 0,4% SRB-oplossing de bodem van putten consequent bedekt.
      Opmerking: Bereid en gebruik 0,4% SRB-oplossing door 0,4 g SRB-poeder toe te voegen aan 100 mL van 1% azijnzuur. Schud de oplossing voorzichtig om deze te mengen. Wikkel de fles van 0,4% SRB-oplossing in een licht beschermend materiaal zoals aluminiumfolie. Bewaar 0,4% SRB-oplossing in een koelkast.
   2. Na incubatie 40 min tot 60 min, was de plaat door het spoelen met 1% azijnzuur. Was de plaat totdat de ongebonden kleurstof volledig is weggewassen (Figuur 3b).
   3. Laat de plaat op een laboratorium Bank drogen voordat u naar de volgende stap gaat.
      Opmerking: De plaat moet volledig worden gedroogd voordat u naar stap 3,3 gaat.
3. Extinctie meting
   1. Pipetteer 100 μL tris-basisoplossing (10 mM) in de bijbehorende putten, inclusief lege putten. Houd de plaat 10 min op een shaker. meet de extinctie op 492 nm.

4. genereren van een dosis-respons curve

1. Analyseer de SRB-testgegevens in een spreadsheet. Trek de blanco extinctie af van de extinctiewaarden van elke groep en bereken het gemiddelde (AVE) en de standaarddeviatie (STD) van de extinctiewaarden van elke groep.
2. Bereken het percentage van de gemiddelde extinctie (AVE%) en die van de standaarddeviatie (STD%) van elke groep met absorptie waarden van de SRB-test.
   Opmerking: De AVE% van miRNA Control nabootsen behandelde groep is 100%. Bereken de STD% met behulp van de volgende formule: STD% = (STD van elke groep/AVE-absorptie van besturingselement nabootsen behandelde groep) x 100.
3. Importeer de onbewerkte gegevens inclusief behandelings concentraties, AVE% en STD% in de software door deze gegevens verticaal te uitlijnen. Aangezien log 0 niet is gedefinieerd, stelt u de eerste concentratie van de X-as in op een waarde die dicht bij0 ligt (bijvoorbeeld 0,01).
4. Klik op het tabblad grafiek maken en kies eenvoudige Scatter-Error bars. Selecteer werkblad kolommen als symbool waarden en klik op volgende. Selecteer in het deelvenster gegevensindeling XY-paren en klik op volgende. Selecteer corresponderende gegevenskolommen in het deelvenster gegevens selecteren. Klik op de knop Voltooien om het plot te maken.
   Opmerking: De X-as vertegenwoordigt de concentraties, de Y-as geeft het percentage van de gemiddelde extinctie van elke concentratie aan (AVE%), en de foutbalken wijzen op het percentage van de standaarddeviatie van elke concentratie (STD%).
5. Dubbelklik op de X-as om het type schaal en het schalen van de as te wijzigen. Wijzig het type schaal van lineair in logboek. Wijzig het begin-en eindbereik nummer in respectievelijk 0,01 en 200.
6. Klik met de rechtermuisknop op een spreidings plot, kies curve fit en ga naar de door de gebruiker gedefinieerde subcategorie. Selecteer dosis-responscurve, klik op volgende knoppen en klik vervolgens op afwerking knop. De dosis-responscurve wordt nu samen met een rapporttabblad gegenereerd (figuur 4a).
   1. Als u vergelijking 1 in de software wilt invoeren voor het genereren van een dosis-responscurve, klikt u op het tabblad analyse en selecteert u regressie wizard. Ga naar door de gebruiker gedefinieerde in de vergelijkings categorie en klik vervolgens op de knop Nieuw . Voeg vergelijking 1, variabelen, initiële parameters en beperkingen in de corresponderende lege vakken in (figuur 4b, C). Klik op toevoegen als knop en stel de naam van de vergelijking in als dosis-responscurve. De vergelijkings naam wordt nu gegenereerd in de subcategorie die door de gebruiker is gedefinieerd in de vergelijkings categorie. f geeft het percentage van de levensvatbaarheid van de cel (% levensvatbaarheid van de cel) aan in vergelijking 1.

Vergelijking 1

7. Ga naar het tabblad rapport en controleer de n-, k-en R-waarden.
   Opmerking: y0 geeft 100% cellevens vatbaarheid van Mirna Control nabootsen behandelde groep, n geeft de Hill-type coëfficiënt aan (de helling van een perceel), k geeft de concentratie aan van mirna-107 nabootsen die een 50% van het maximale effect van de mirna-107 nabootsen (de helft de maximale remmende concentratie, IC₅₀) en R geeft de residuele onaangetast fractie (de weerstands Fractie)¹⁵aan. De vergelijking die wordt gebruikt om een dosis-responscurve te genereren, herkent het bereik van y0 tot R-waarde (indien van belang) als 100% (figuur 4a). Daarom is het noodzakelijk om de aangepaste waarde k (IC₅₀) te verwerven die wordt berekend op basis van het bereik van y0 tot een waarde van nul (figuur 4a). Aangepaste k (IC₅₀) samen met andere ICX-waarden (bijv.IC₁₀ tot en met IC₉₀) kan worden verkregen met behulp van vergelijking 2, die is afgeleid van vergelijking 1. De afleiding van vergelijking 2 van vergelijking 1 is aangegeven in aanvullend figuur 1.

Vergelijking 2

8. Dubbelklik op de linkermuisknop in de cel waarin vergelijking 2 wordt toegepast. Met behulp van vergelijking 2 en parameters van de gegenereerde dosis-responscurve, is het beschikbaar voor het berekenen van de gecorrigeerde waarden van ICx, variërend van IC₁₀ tot IC₉₀ (figuur 4D).
9. Voer het gelijkteken in, gevolgd door de formule die begint met een haakje in de cel. Wanneer u de formule invoert, repareert u de waarde van n, k en R als absolute celverwijzingen door het dollarteken toe te voegen aan de corresponderende kolom en rij, zodat deze vaste waarden niet worden gewijzigd wanneer de formule automatisch wordt gevuld tot de rijen (figuur 4D). Als alternatief kunnen aangepaste waarden handmatig worden berekend met behulp van vergelijking 2.
   Opmerking: IC₉₀ -waarde wordt niet bepaald omdat de R-waarde groter dan 10 is. Bovendien, als R-waarde hoger is dan 20, wordt de waarde van IC₈₀ ook niet bepaald (figuur 4D).

5. verificatie van het directe doel gen van een MicroRNA van belang

Opmerking: Na het uitvoeren van het functionele experiment, zoals de SRB-test, wordt miRNA-107 bevestigd als een tumor suppressieve miRNA en is het zeer mogelijk dat miRNA-107 zich rechtstreeks richt op oncogenen. Controleer de lijst met alle voorspelde doel genen met een miRNA target Voorspellings programma zoals Target scan (http://www.targetscan.org/vert_71/) en Verfijn vervolgens de potentiële kandidaatdoelen op basis van de functie van een gen in databases, waaronder PubMed en GeneCards.

1. Primer ontwerp voor het klonen van 3 ' onvertaalde regio (UTR)
   1. Zet de naam van een gen in GeneCards (https://www.genecards.org/) en klik op het symbool van een gen. Beoordeel ENSEMBL genoome browser door op ENSEMBL id van een gen te klikken en klik vervolgens op transcriptsid in de transcript tabel. Klik daarna op Exonen bestonden in de lijst op transcript gebaseerde weergaven aan de linkerkant.
   2. Kopieer de nucleotide sequenties van de 3 ' UTR en plak deze in het primer ontwerpprogramma. Kopieer de reeksen opnieuw vanuit dit programma en plak deze in een tekstverwerker. Controleer de aanwezigheid van miRNA bindende sequenties evenals de aanwezigheid van restrictie enzymen sites gebruikt voor het klonen.
      Opmerking: Als er geen restrictie-enzym herkennings locaties binnen de 3 ' UTR zijn, kunnen de voor het klonen geselecteerde beperkings enzymen worden gebruikt voor de volgende stap.
   3. In de primer ontwerpprogramma, accepteer de 3 ' UTR sequenties en beginnen met het ontwerpen van de voorwaartse en omgekeerde primers met de volgende voorwaarde. Lengte: 20-30 nucleotiden, TM: 45-58 °C, GC%: 40-60%. Het verschil tussen de TM-waarden van de twee primers moet lager zijn dan 5 °C. De primer sequenties die in deze studie worden gebruikt, zijn beschikbaar in aanvullende figuur 2. Voeg restrictie-enzym herkennings sequenties en 4 willekeurige nucleotiden toe aan de ontworpen primers.
2. Verloop PCR
   1. Bereid 25 μL PCR-reactie mengsels, inclusief ontworpen primers per één gloeien temperatuur (tabel 2). Bereid voldoende hoeveelheid mengsels op basis van het totale aantal reacties. Meng de oplossing door Pipetteer en voeg 25 μL reactie mengsels toe aan elke buis. Centrifugeer de buizen enkele seconden.
   2. Voer 35-40 PCR-cycli uit van denaturatie stap tot uitbreidings stap. Stel de PCR-cyclus in als de volgende stappen: 98 °C gedurende 1 minuut (1 cyclus, polymerase activatie stap), 95 °C gedurende 10 sec. (denaturatie stap), 45 °C-68 °C gedurende 30 sec. (gloei stap), 68 °C (uitbreidings stap, 10 s-1 min per 1000 BP), 68 °C gedurende 3 min (beëindigings stap) en afkoelen tot 4 °C.
   3. Voer de PCR-producten uit en controleer de banden op een 1% agarose-gel met DNA-ladders. Zoek de beste gloeien temperatuur (figuur 5a). Versterk 3 ' UTR van een gen opnieuw met de beste gloeien temperatuur voor de volgende stap.
3. Dubbele spijsvertering
   1. Maak de reactie mengsels met inbegrip van twee restrictie enzymen, XhoI (of AsiSI) en NotI, in een buis (tabel 3). Inbroed de mengsels voor 3-4 uur met behulp van een waterbad (37 °C).
   2. Voer de dubbel verteerde producten uit op een 1% agarose gel en snijd de banden vervolgens onder UV-licht. In het geval van plaats vectoren, voordat u op een gel draait, reageren dubbele verteerde vectoren met 10 U alkalische fosfatasen voor nog eens 1 h om een recirculatie tijdens de ligatie stap te voorkomen.
   3. Reinig de dubbel verteerde PCR-producten en plaats-vectoren uit de bekrachtigd bands.
4. Ligatie van PCR-producten in de plaats-vectoren
   1. Breng 20 μL ligatie-reactie mengsels met inbegrip van de DNA-ligase (tabel 4).
      Opmerking: De molaire verhouding van PCR-product (insert) tot plaats vector kan 3:1 zijn. 1:1 of 2:1.
   2. Centrifugeer de buis kort voor 10-15 s en incuberen bij 16 °C 's nachts met behulp van een thermische cycler.
      Opmerking: Als alternatief kan de buis gedurende 2-3 dagen bij 4 °C worden geïnineerd voor de ligatie. In deze stap wordt de PCR-insert gekloond in de regio die stroomafwaarts van een renilla reporter-gen (Figuur 5b) wordt geplaatst. De binding van miRNAs aan de gekloonde 3 ' UTR van een gen kan afnemen in de renilla-activiteit. Firefly plaats is voor de normalisering van renilla expressieniveaus.
5. Transformatie en kolonie PCR
   1. Voeg de ligatie mengsels (3-5 μL) toe aan de buis die de bevoegde cellen bevat. Tik zachtjes op de buis en houd deze op ijs (20 min).
      Opmerking: Ontvries bevoegde cellen op ijs voordat u de ligatie mengsels toevoegt.
   2. Breng de buis snel en voorzichtig over naar een warmte blok. Na een hitteschok (42 °C gedurende 30 s-1 min), plaatst u de buis op ijs gedurende 20 minuten.
   3. Verdeel de competente cellen op de Luria-Bertani (LB) agar plaat. Kweek de competente cellen in een incubator (37 °C) 's nachts.
      Opmerking: Ampicillaire (50-100 μg/mL) is opgenomen in de agar-plaat.
   4. Kies een individuele kolonie en resubreng E. coli in een van de 8-stroken buizen met ultrapuur water. Herhaal deze stap om E. coli te hervatten uit willekeurig geselecteerde 4-8 kolonies (figuur 5c).
   5. Breng 25 μL E. coli suspensie over in een andere set van 8-stroken buizen. Nu, er zijn 2 sets van buizen van E. coli schorsing.
      Opmerking: Eén buis is voor kolonie PCR en een andere is voor inoculatie. E. coli suspensie voor inoculatie kan tijdelijk worden bewaard bij 4 °C (figuur 5c).
   6. Voer de kolonie PCR uit met behulp van E. coli suspensie. Deze stap is om te bepalen of de kolonies een insert bevatten. Selecteer de beste kolonies voor het inoculeren en isoleren van plaats vectoren harkotteren 3 ' UTR van een gen (figuur 5c).
      Opmerking: Herhaal stap 5.1-5.5 voor elke 3 ' UTR van geselecteerde genen. Volg de toestand van de PCR-reactie in tabel 2 door het GENOMISCHE DNA te vervangen door E. coli suspensie.
6. Luciferase-test
   1. Bereid een 24-goed bord. Gebruik 1-2 x 10⁴ cellen in 500 μL celkweek media voor elke put. Gebruik geen celkweek media die P/S voor de transfectie bevatten, omdat het gebruik van P/S de transfectie-efficiëntie kan verminderen.
   2. Transfect 50 ng van plaats vectoren in de cellen met controle nabootsen of een specifieke Mirna nabootsen met behulp van een transfectie reagens (figuur 5d). Als het screenen van de effecten van een specifieke miRNA bij meer dan één concentratie, de totale hoeveelheid oligos dezelfde in elk goed te houden (zie stap 2).
   3. Was de binnenkant van putjes tweemaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op de volgende dag.
   4. Breng 200 μL lysisreagens in de putjes aan en voer cellysis voldoende uit voordat u de plaats-activiteit meet.
      Opmerking: Houd de plaat minstens 15 min op een schud plaat.
   5. Breng 5-10 μl cellysaat over in de nieuwe buis en voeg 100 μL reagens I. Meng de oplossing onmiddellijk door Pipetteer en lees de Firefly plaats-activiteit met behulp van een luminometer.
      Opmerking: Lees de Firefly plaats activiteit voor 10-15 s.
   6. Voeg 100 μL reagens II toe in dezelfde buis en meng door tweemaal te pipetteren. Lees de renilla plaats-activiteit voor 10-15 s met een luminometer. Herhaal stap 5.6.5 en 5.6.6 voor elk voorbeeld.
   7. Bereken de verhouding van renilla met Firefly (figuur 5e).
      Opmerking: De activiteit van Firefly vertegenwoordigt de transfectie efficiëntie van plaats constructies in de cellen.

Resultaten

Een geslaagde en nauwkeurige bevestiging van miRNA-niveaus is belangrijk voor de interpretatie van gegevens waarmee de classificatie van miRNAs mogelijk is op basis van de verwachte rollen van miRNAs in de ontwikkeling en progressie van een ziekte. De niveaus van miRNA-107 en miRNA-301 werden gemeten in drie pancreas cellijnen met behulp van de op sonde gebaseerde kwantitatieve PCR. De synthese van Cdna's van zowel een specifieke miRNA als een referentie-gen in dezelfde reactie kan de reproduceerbaarheid van gegevens ver...

Discussie

Strategieën voor de bepaling van bonafide miRNA-doelen met de functies van een miRNA van belang zijn onmisbaar voor het begrijpen van meerdere rollen van miRNAs. Identificatie van de doel genen van miRNA kan een leid waarde zijn voor het interpreteren van de cel signalering van gebeurtenissen die door miRNAs in een cel worden gemoduleerd. Een ontveiling van functioneel belangrijke doel genen van miRNAs kan de fundamentele kennis bieden om een op miRNA gebaseerde therapie in kanker te ontwikkelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mL conische buis	SPL Life Sciences	50015
24-wells plaat	Thermo Scientific	142475
50 mL conische buis	SPL Life Sciences	50050
6-wells plaat	Falcon	353046
6x DNA loading dye	Real Biotech Corporation	RD006	1 mL
8-cap strip	Applied Biosystems	N8010535	Voor cDNA synthese
8-buisjes strip	Applied Biosystems	N8010580	Voor cDNA synthese
96-wells plaat	Falcon	353072
Azijnzuur	Sigma	A6283-1L	1 L
Agarose A	Bio Basic	D0012	500 g
Alkaline fosfatase	New England Biolabs	M0290S	10.000 U/mL
Ampicilline	Bio basic Canada Inc	AB0028	25 g
AriaMx 96 buisjes strips	Agilent Technologies	401493	Voor real time PCR
AriaMx real-time PCR systeem	Agilent Technologies	G8830A	qPCR versterking, detectie en gegevensanalyse
AsiSI	New England Biolabs	R0630	10.000 units/mL
CAPAN-1 cellen	ATCC	HTB-79
Celcultuur kap	Labtech		Model: LCB-1203B-A2
Tellingkamers met V-streep	Paul Marienfeld	650010	Celteller
CutSmart buffer	New England Biolabs	B7204S	10X concentratie
DMEM	Gibco	11965-092	500 mL
DNA gel extractie kit	Bionics	DN30200	200 voorbereidingen
DNA ladder	NIPPON Genetics EUROPE	MWD1	1 Kb ladder
DNase I	Invitrogen	18068015	100 eenheden
Dual-luciferase reporter assay systeem	Promega	E1910	100 tests
Foetaal runder serum	Gibco	26140-079	500 mL
HIT competente cellen	Real Biotech Corporation(RBC)	RH617	Competente cellen
HPNE cellen	ATCC	CRL-4023
LB agar bouillon	Bio Basic	SD7003	250 g
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027	0,75 mL
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778-075	0,75 mL
Luminometer	Promega		Model: E5311
Microcentrifuge buisje	Eppendorf	22431021
Microplaat reader	TECAN		Infinite F50
miRNA controle mimic	Ambion	4464058	5 nmol
miRNA-107 mimic	Ambion	4464066	5 nmol
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	50 voorbereidingen
Mupid-2plus (elektroforese systeem)	TaKaRa		Model: AD110
NotI	New England Biolabs	R3189	20.000 units/mL
Oligo explorer programma	GeneLink		Voor primer ontwerp
Optische buisjes strip caps (8x Strip)	Agilent Technologies	401425	Voor real time PCR
Opti-MEM	Gibco	31985-070	500 Ml
PANC-1 cellen	ATCC	CRL-1469
Penicilline/streptomycine	Gibco	15140-122	100 mL
Fosfaat bufferoplossing	Gibco	14040117	1000 mL
Plasmid DNA miniprep S& V kit	Bionics	DN10200	200 voorbereidingen
PrimeSTAR GXL DNA polymerase	TaKaRa	R050A	250 eenheden
Schudler	TECAN		Schudplatform
Schudbroodbak	Labtech		Model: LSI-3016A
Sigmaplot 14 software	Systat Software Inc		Voor het genereren van dosis-responscurves
Sulforodamine B poeder	Sigma	S1402-5G	5 g
SYBR groen master mix	Smobio	TQ12001805401-3	Binding fluorescerende kleurstof voor dsDNA
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A	25.000 U
TaqMan master mix	Applied Biosystems	4324018	200 reacties, geen AmpErase UNG
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107)	Applied Biosystems	4427975	Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301)	Applied Biosystems	4427975	Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan miR RT kit	Applied Biosystems	4366597	1.000 reacties
Thermo CO2 incubator (BB15)	ThermoFisher Scientific		37 °C en 5% CO2 incubatie
Trichloroazijnzuur	Sigma	91228-100G	100 g
Trizma base	Sigma	T4661-100G	100 g
Ultrapuur water	Invitrogen	10977-015	500 mL
Veriti 96 wells thermische cycler	Applied Biosystems		Voor versterking van DNA (of cDNA)
XhoI	New England Biolabs	R0146	20.000 units/mL