Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van tumor Microenvironment van metastasen doorway-gemedieerde vasculaire permeabiliteit geassocieerd met kanker cel verspreiding met behulp van Intravital beeldvorming en vaste weefsel analyse

8.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59633

⸱

26 juni 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven twee methoden voor het beoordelen van voorbijgaande vasculaire permeabiliteit geassocieerd met tumor micro omgeving van metastasen (tmem) deuropening functie en kankercel intravasatie met behulp van intraveneuze injectie van hoog-moleculair gewicht (155 kDa) dextran bij muizen. De methoden omvatten intravital beeldvorming in levende dieren en vaste weefsel analyse met behulp van immunofluorescentie.

Samenvatting

De meest voorkomende oorzaak van kanker gerelateerde sterfte is metastase, een proces dat de verspreiding van kankercellen van de primaire tumor naar secundaire sites vereist. Onlangs hebben we vastgesteld dat kankercel verspreiding in primaire borstkanker en bij gemetastaseerde plaatsen in de longen alleen bij deuropeningen wordt genoemd tumor micro omgeving van metastasen (TMEM). Tmem deuropening nummer is prognostisch voor verre herhaling van gemetastaseerde ziekte bij borstkankerpatiënten. TMEM-deuropeningen bestaan uit een kankercel die het actine-regulerend eiwit Mena in direct contact met een perivasculaire, proangiogene macrofaag, dat een hoog gehalte aan TIE2 en VEGF uitdrukt, waarbij beide cellen strak gebonden zijn aan een bloed het schip endotheliale cel. Kankercellen kunnen intravaseren door middel van tmem doorgangen als gevolg van voorbijgaande vasculaire permeabiliteit georkestreerd door de gezamenlijke activiteit van de tmem-geassocieerde macrofaag en de tmem-geassocieerde Mena-uitdrukken kanker cel. In dit manuscript beschrijven we twee methoden voor de beoordeling van TMEM-gemedieerde voorbijgaande vasculaire permeabiliteit: intravital Imaging en vaste weefsel immunofluorescentie. Hoewel beide methoden hun voor-en nadelen hebben, kan het combineren van de twee de meest complete analyses van TMEM-gemedieerde vasculaire permeabiliteit en micromilieuvereisten voor TMEM-functie bieden. Aangezien het metastatische proces bij borstkanker, en mogelijk andere vormen van kanker, de verspreiding van kankercellen via tmem deuropeningen impliceert, is het essentieel om goed gevestigde methoden te gebruiken voor de analyse van de tmem deuropening activiteit. De twee methoden die hier worden beschreven, bieden een alomvattende benadering van de analyse van tmem deuropening-activiteit, hetzij bij naïeve of farmacologisch behandelde dieren, wat van het allergrootste belang is voor preklinische onderzoeken van agenten die kankercellen voorkomen verspreiding via TMEM.

Inleiding

Recente vooruitgang in ons begrip van kanker metastasen hebben blootgelegd dat epitheliale-naar-mesenchymale overgang (EMT) en de inductie van een migratie/invasieve kankercel subpopulatie niet, op zichzelf, voldoende zijn voor hematogene verspreiding 1. inderdaad, er werd eerder gedacht dat metastaserende kankercellen intravasaat door het geheel van kanker-geassocieerde endotheel als de tumor neovasculature wordt vaak gekenmerkt door lage pericyte dekking, en als zodanig, is zeer permeabel en unstable2,3,4. Hoewel zeer suggestief van defecte functies binnen de tumor, vasculaire modificaties tijdens carcinogenese leveren geen bewijs per se dat tumorcellen kunnen doordringen van de bloedvaten gemakkelijk en op een ongecontroleerde manier. Inzichten van intravital Imaging (IVI) studies, waarin tumorcellen zijn fluorescerende-gelabeld en de vasculatuur wordt gelabeld via de intraveneuze injectie van fluorescerende sondes (zoals dextran of Quantum dots), tonen aan dat, terwijl de tumor vaten zijn uniform permeabel tot laag moleculair gewicht dextranen (bv. 70 KD), hoog moleculair gewicht dextranen (155 KD) en tumorcellen kunnen alleen het endotheel oversteken op gespecialiseerde plaatsen van intravasatie die bij voorkeur op vasculaire tak punt5zijn gelegen, 6 , 7. Immunohistochemical (IHC) analyses met behulp van dierlijke modellen en menselijke patiënt afgeleide materialen hebben aangetoond dat deze sites zijn "deuropeningen" die gespecialiseerd zijn in het reguleren van vasculaire permeabiliteit, lokaal en transitief, het verstrekken van een kort venster van kans op migratie/invasieve kankercellen om de circulatie te betreden. Deze deuropeningen worden "tumor micro-omgeving van metastasen" of "tmem" genoemd, en, heel expectedly, de dichtheid correleert met een verhoogd risico op het ontwikkelen van gemetastaseerde ziekte bij borstkankerpatiënten8,9, 10.

Elke tmem deuropening bestaat uit drie verschillende soorten cellen: een perivasculaire macrofaag, een tumor cel die de actin-regulatoire proteïne zoogdier ingeschakeld (Mena) en een endotheelcel in direct fysiek contact met elkaar uitdrukt 5,9,10,11,12,13. De belangrijkste gebeurtenis voor de functie van tmem als een intravasatie deuropening is de gelokaliseerde afgifte van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) op het onderliggende vat door de perivasculaire macrofaag14. VEGF kan homotypische kruisingen tussen endotheel cellen15,16,17,18,19, een fenomeen dat resulteert in voorbijgaande vasculaire lekkage verstoren, ook bekend als "barsten" permeabiliteit zoals beschreven in IVI studies 5. Tmem macrofagen is aangetoond dat de tyrosine kinase receptor TIE2 uitdrukken, die nodig is voor VEGF-gemedieerde tmem functie en homing van deze macrofagen aan de perivasculaire niche5,20,21 , 22. naast het reguleren van de verspreiding van kankercellen en metastase zijn TIE2+ macrofagen centrale regulatoren van tumor angiogenese21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Als zodanig, TIE2+ macrofagen vertegenwoordigen een kritische bestanddeel van de tumor micro omgeving en de belangrijkste regulator van de gemetastaseerde Cascade.

Om de TMEM-gemedieerde vasculaire permeabiliteit beter te kunnen conceptualiseren (d.w.z. "barsten"), is het zeer belangrijk om het te onderscheiden van andere vormen van vasculaire permeabiliteit die niet zijn geassocieerd met het oplossen van endotheliale celcelknooppunten. In een intact endotheel (waarvan de nauwe en aanhankings knooppunten niet verstoord zijn), zijn er drie hoofdtypen van vasculaire permeabiliteit: (a) Pinocytose, die kan, of kan niet, worden gekoppeld aan transcytose van het ingezoomde materiaal; b) vervoer van materiaal via endotheel fenestrae; en (c) transport van materiaal via de paracellulaire route, die wordt gereguleerd door endotheliale strakke knooppunten15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. Hoewel gedereguleerd in veel tumoren, zijn de bovengenoemde vormen van vasculaire permeabiliteit meestal beschreven in de context van normale weefsel fysiologie en homeostase, waarvan de uitersten weefsels zijn met ofwel beperkte permeabiliteit ( bijvoorbeeld, bloed-hersen barrière, bloed-testis barrière), of overvloedige permeabiliteit (bijvoorbeeld, fenestrated capillairen van het nierglomerulaire apparaat)34,35,36,37.

Met behulp van multiphoton intravital beeldvorming en Multiplexed immunofluorescentie microscopie, we zijn in staat om onderscheid te maken tussen TMEM-gemedieerde vasculaire permeabiliteit ("barsten") en andere vormen van vasculaire permeabiliteit in borsttumoren. Om dit te bereiken, voeren we een enkelvoudige intraveneuze injectie van een hoog-moleculair gewicht, fluorescently-gelabelde sonde in muizen. Spontane uitbarstende gebeurtenissen kunnen vervolgens worden vastgelegd met intravital imaging in levende muizen; of als alternatief kan extravasatie van de sonde worden gekwantificeerd door co-lokalisatie studies met bloedvasculatuur (bijv. CD31+ of Endomucin+) en tmem-deuropeningen met behulp van immunofluorescentie microscopie. De hier gepresenteerde protocollen beschrijven beide technieken, die zelfstandig of in combinatie met elkaar kunnen worden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met levende dieren moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en verordeningen inzake dieren gebruik en-verzorging. De in deze studie beschreven procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de nationale instituten voor gezondheidsvoorschriften met betrekking tot de verzorging en het gebruik van proefdieren en met de goedkeuring van het Albert Einstein College voor geneeskunde dierenverzorging en-gebruik Comité (IACUC).

1. evaluatie van "barsten permeabiliteit" met behulp van levende dierlijke beeldvorming

  1. Transplantatie van syngene borsttumoren in muis hosts met fluorescerende macrofagen
    1. Het genereren van stukjes tumorweefsel geschikt voor transplantatie.
      1. Het genereren van fluorescerende-gelabelde tumoren in muizen borstkanker modellen door het passeren van de spontane, autochtone, genetisch gemanipuleerde muis borstkanker model mmtv-pymt muizen met transgene muizen uitdrukken fluorescerende verslaggevers38, 39 [bijv. verbeterde groene fluorescerende eiwitten (EGFP), verbeterde cyaan fluorescerende eiwitten (ecfp), of Dendra2].
      2. Laat MMTV-PyMT muizen met fluorescently gelabelde tumoren groeien tot een grootte van niet groter dan 2 cm (ongeveer 10-12 weken oud).
      3. Euthanaseer de tumor lager MMTV-PyMT muizen door ze in een kamer te plaatsen met 5% Isofluraan tot 30 seconden nadat alle ademhaling is stopgezet.
      4. Een cervicale dislocatie uitvoeren.
      5. Verwijder het haar uit de buik van de euthanarerende muis met behulp van een topische Ontharingscrème.
      6. Plaats een Petri schaaltje met DMEM/F12 celkweekmedium op ijs.
      7. Plaats de muis en Petri schaal op ijs in de afzuigkap.
      8. Sanitize de buik van de muis met 70% ethylalcohol.
      9. Gebruik steriele handschoenen en chirurgische gereedschappen (gesteriliseerde schaar, Tang en mes) Verwijder de tumoren en plaats ze in de Petri schaal.
      10. Snijd de tumor in kleine stukjes (~ 2 mm x 2 mm x 2mm in grootte), het verwijderen van eventuele necrotische porties, terwijl ze in de Petri schaal.
    2. Transplantatie van de tumor stukken in ontvangende hosts.
      1. Verhoog muizen met genetisch gemanipuleerde fluorescently-gelabelde macrofagen, bijvoorbeeld MacGreen40 of macblue 41 muizen (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ecfp)
      2. Laat de FVB-muizen met fluorescently gelabelde macrofagen groeien tot een leeftijd van ~ 4-6 weken).
      3. Anesthetiseer de FVB-muizen met fluorescently gelabelde macrofagen in een kamer met 5% Isofluraan met zuurstof als draaggas.
      4. Verminder de anesthesie tot ~ 3% Isofluraan en breng oftalmische zalf aan op de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen.
      5. Verwijder het haar van over de 4th borstklier van de muis.
      6. Reinig de huid met Betadine. Het is belangrijk om gedurende de rest van de procedure steriele omstandigheden te behouden. Dit omvat het gebruik van gesteriliseerde instrumenten en reagentia.
      7. Maak een kleine incisie ~ 2-3 mm net inferieur aan de 4e tepel.
      8. Ontleden totdat het borst vet pad wordt blootgesteld.
      9. Neem een tumor stuk uit de Petri schaal en vacht in een kunstmatige extracellulaire matrix.
      10. Transplantatie tumoren onder de 4th borst Fat pad.
      11. Sluit de incisie met Cyanoacrylaat lijm.
      12. Voortdurend bewaken van het dier totdat het volledig herstelt van anesthesie en is in staat om borstbeen recumbency te handhaven. Ook, niet om het dier terug te keren naar het gezelschap van andere dieren tot volledig herstel.
      13. Om infecties te minimaliseren, voeg 1 mL 100 mg/mL enrofloxacine antibioticum toe aan de drinkwater fles van het dier (8 fl oz).
      14. Laat tumoren groeien tot voelbaar (~ 5 mm; ~ 4 weken).
      15. Afhankelijk van het experiment, wijs de muizen toe aan behandelingsgroepen en voer de bijbehorende behandelingen uit, indien van toepassing.
  2. Instellen voor intravital Imaging
    1. Schakel de twee-Photon-Laser en detectoren van Microscoop in.
    2. Zet de verwarmings kast aan en verwarm de x-y-fase van de Microscoop.
    3. Plaats de op maat gemaakte stage Insert42 in de x-y-fase.
  3. Voorbereiding van Imaging Window
    1. Voorafgaand aan de installatie voor Imaging, autoclaaf het op maat gemaakte cirkel beeldvormings venster frame42.
    2. Gebruik een pipet of een insulinespuit om een dun laagje Cyanoacrylaat lijm op het raamkozijn te plaatsen en bevestig een 8 mm rond afdekglas.
      Opmerking: 1) het is belangrijk om te voorkomen dat er residu wordt op het duidelijke diafragma van het afdekglas. 2) het is belangrijk om het afdekglas ten minste 1 uur voor gebruik voorbeeld vorming aan het raamkozijn te hechten.
    3. Reinig elke overmaat cyanoacrylaat voorzichtig op het heldere diafragma van het afdekglas met behulp van een laboratorium doekje bevochtigd met een kleine hoeveelheid aceton.
  4. Bereiding van de staart ader katheter voor toediening van vloeistoffen en fluorescerende kleurstoffen tijdens beeldvorming
    1. Snijd een stukje polyethyleen buis van 30 cm om een staart ader katheter te construeren.
    2. Maak het naald gedeelte van een 30 G naald los van de Luer taper door de naald zachtjes heen en weer te buigen totdat deze breekt.
      Opmerking: de naald moet dicht bij de Luer taper worden gehouden en niet de naaldpunt. Dit kan worden uitgevoerd met een tang of pincet om de naald te grijpen om prik letsel te voorkomen.
    3. Steek het stompe uiteinde van de naald in één uiteinde van de polyethyleen slang.
    4. Steek het scherpe uiteinde van een andere 30 G naald, waarbij de Luer taper bevestigd blijft, naar het tegenovergestelde uiteinde van de slang.
    5. Vul een 1 cc spuit met fosfaatgebufferde zoutoplossing, bevestig deze aan Luer taper van de gemonteerde katheter, en spoel de staart ader katheter ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in het systeem.
    6. Voor vasculaire labeling vult u een 1 cc spuit met 100 μL van 10 mg/kg 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine (TMR) of Quantum dots.
  5. Voorbereiding van de muis voorbeeld vorming
    1. Anesthetiseer de muis in een kooi eronder (~ 1 voet hieronder) een warmte lamp met behulp van 4%-5% Isofluraan vermengd met 100% zuurstof ingesteld op een stroom van 1.5-2 L per min.
    2. Schakel warmte lamp in over het chirurgische werkgebied. Deze stap is van cruciaal belang voor het handhaven van de kern van de fysiologische lichaamstemperatuur van de muis tijdens de operatie.
    3. Plaats de muis onder het warmte lampje en verlaag de anesthesie tot 2%-3% voor de duur van de operatie.
      Opmerking: Zorg ervoor dat u het warmte lampje op een veilige afstand (~ 1 voet) van de muis houdt om oververhitting te voorkomen.
    4. Plaats oftalmische zalf op de ogen van de muis om het drogen van de ogen en blindheid te voorkomen.
    5. Test dat de muis wordt verdoiliseerd door het uitvoeren van Teen-pinch test. Als het dier terugtrekt, verhoging van de dosering van Isofluraan door 1% en opnieuw te testen in 1-2 min.
    6. Steek de staart ader katheter in het meest distale punt op de staart mogelijk.
    7. Bevestig de staart ader katheter aan de staart met een klein stukje labtape dat rond de staart wikkelt en aan de naald kleeft om te verzekeren dat het niet wordt afgekeurd.
    8. Injecteer 50 μL per h PBS via de staart ader katheter om voldoende hydratatie te bieden. Het is van cruciaal belang om te voorkomen dat teveel vocht wordt injecteren (niet meer dan 200 μL per h) of bubbels in de katheter omdat dit fataal kan zijn voor de muis.
    9. Verwijder haar op de buik over de 4e en 5th borstklieren met behulp van onthardings crème.
    10. Reinig de huid met Betadine en laat de huid drogen.
    11. Maak een longitudinale middellijn incisie meteen superieur aan de geslachtsdelen en draag de incisie tot het niveau van het superieure aspect van de 4th borstklier.
    12. Draag de incisie dwars naar het superieure aspect van de 4th borstklier. Het is van cruciaal belang om te voorkomen dat de bloedtoevoer op dit moment compromitteren.
    13. Dissect de borst vet pad uit het peritoneum het creëren van een weefsel flap met behulp van steriele Tang en schaar.
      Opmerking: huid flap Imaging is vatbaar voor significante bewegings artefacten en weefsel uitdroging. Deze worden vermeden, zoals eerder beschreven43,44, door het aanbrengen van een stijf stukje rubber achter de huid zijde van de flap (om het zachte weefsel te verstijven en te isoleren van de rest van het lichaam) en vervolgens de tumor in een ondiepe beeldvorming te plaatsen venster om de hydratatie te behouden. Dit is van cruciaal belang voor stabiele beeldvorming, omdat de tumor en het omringende weefsel in deze setting zeer compliant zijn.
    14. Stabiliseer de huid flap door het aanbrengen (met Cyanoacrylaat lijm) een klein stukje stijf rubber dat 2 cm x 2 cm aan de huid zijde van de flap wordt gemeten. De tumor moet in het midden van het gebied worden gestabiliseerd door het rubber.
    15. Houd blootgestelde weefsel gehydrateerd met druppels PBS.
    16. Breng een kleine film cyanoacrylaat aan op de buitenste rand van het op maat gemaakte beeldvormings venster.
    17. Breng een kleine druppel PBS (~ 10 – 20 μL) aan op het midden van het afdekglas.
    18. Droog het omringende flap weefsel met een laboratorium doekje. Het is essentieel om ervoor te zorgen dat de cyanoacrylaat op het raam frame niet in aanraking komt met de PBS op het glas, omdat dit de cyanoacrylaat kan polymeriseren en voortijdig instellen.
    19. Bevestig het kleine beeldscherm aan de weefsel flap met de tumor in het midden van het heldere diafragma.
    20. Verwijder de verwarmings kast uit het werkgebied.
    21. Breng de verdoofd muis en staart ader katheter over naar de Microscoop fase. Gebruik uiterste voorzichtigheid om ervoor te zorgen dat de staart ader katheter niet uit valt.
    22. Plaats de muis op het werkgebied in de liggende positie.
    23. Plaats de neuskegel van Isofluraan over de snuit om het onderhoud van de anesthesie te garanderen.
    24. Plaats het venster in de boring op de aangepaste x-y-podium plaat.
    25. Plaats de verwarmings kast weer op het podium om een fysiologische temperatuur te behouden.
    26. Bewaak de vitale functies van het dier door een puls-Oximeter sonde te bevestigen via een clip sensor naar de achterste poot.
    27. Langzaam verminderen Isofluraan tot 0,5%-1% om voldoende doorbloeding te handhaven en te voorkomen dat de muis anesthetiseert.
  6. Intravital Imaging
    Opmerking: de beeldvorming die we beschrijven in deze sectie werd uitgevoerd op een op maat gebouwde twee-Laser multiphoton Microscoop die eerder beschreven5,39,45. Kort, een femtosecondelaser laser wordt gebruikt voor het genereren van 90 femtosecondelaser gepulseerd laserlicht gecentreerd op 880 nm. Fluorescentielicht wordt gedetecteerd met drie van de vier gelijktijdig verwerven van detectoren (blauw = 447/60, groen = 520/65, en rode 580/60; centrale golflengte/bandbreedte) na scheiding van het excitatie licht door een dichroïde (chroma, Z720DCXXR). De Microscoop-standaard bevat een objectief objectief van 25x, 1,05 NA (numeriek diafragma) lange werkafstand (2 mm). Het is belangrijk op te merken dat, hoewel we een op maat gemaakte Microscoop hebben gebruikt, het hieronder beschreven protocol ook kan worden uitgevoerd op elke commercieel verkrijgbare multiphoton-Microscoop.
    1. Plaats een druppel gedistilleerd water tussen de 25x, 1,05 NA Microscoop doelstelling en het afdekglas van het venster om optisch contact te maken.
    2. Gebruik het oculair van de Microscoop om zich te concentreren op gebieden met fluorescerende tumorcellen in de buurt van het oppervlak van het venster.
    3. Vind vloeiende bloedvaten en gelabelde macrofagen. Het is van cruciaal belang om vloeiende bloedvaten te hebben om de dynamiek van de vasculatuur te beoordelen.
    4. Schakel de Microscoop in de multiphoton-modus.
    5. Stel de boven-en ondergrenzen van een z-serie, die ongeveer 50 μm meet.
      1. Stel de bovengrens van de z-serie in door de focus-Adjuster te gebruiken om de doelstelling naar de gewenste startlocatie te verplaatsen, op de meest oppervlakkige positie, en deze positie als nul te markeren in de software door op de knop Z-positie boven te klikken.
      2. Stel de ondergrens van de z-serie die het doel verplaatst naar de diepste laag (meestal 50-70 μm vanaf de bovenkant voor kleinere tumoren) en klik op de Z-positie onderste knop.
      3. Stel de grootte van de z-stap in op 5 μm.
    6. Klik op de knop time-lapse panel en stel het tijdsinterval tussen acquisities in op ten minste 10 sec. om voldoende tijd te geven om het water boven de objectief lens aan te vullen. Dit gebeurt handmatig met een knijp pipet op het doel tijdens de lange timelapse.
    7. Verwijder de spuit met PBS in de staart ader katheter en vervang deze door een andere spuit met de 155 kDa dextran-TMR (tetramethyl Rhodamine).
    8. Injecteer 100 μL 155 kDa dextran-TMR via de staart ader katheter.
    9. Na de injectie de TMR-spuit vervangen door de PBS-spuit.
    10. Verkrijg een z-stack time-lapse Imaging door op de Z-stack en time-lapse buttons te klikken en vervolgens op de opnameknop te klikken.
    11. Injecteer elke 30-45 min 50 μL PBS om een adequate hydratatie van het dier te behouden. Vermijd het injecteren van meer dan 200 μL op het moment, omdat dit kan leiden tot overbelasting van de vloeistof.
  7. Euthanasie
    1. Verhoog de Isofluraan tot 5% en houd het dier onder 5% Isofluraan met neuskegel op zijn plaats tot 30 s nadat de ademhaling is gestaakt.
    2. Verwijder de muis uit het werkgebied.
    3. Uitvoeren van cervicale dislocatie.
  8. Beeldverwerking
    1. Laad alle afbeeldingen in ImageJ en formatteren ze in een 5-dimensionale Hyper stack (x, y, z, t en Color Channel).
    2. Uitvoeren van scheiding van spectrale overlapping (d.w.z.: GFP en GVB) en eliminatie van x-y drift van de Hyper stacks met behulp van gevestigde methoden38.
    3. Gebruik de aanpassing helderheid en contrast om het witte niveau van het bloed kanaal te verhogen, zodat het achtergrond signaal zichtbaar wordt.
    4. Inspecteer voor elk z-segment elke film zorgvuldig op tekenen van voorbijgaande vasculaire lekkage (een "burst"). Het uitvoeren van films op snelle frame rates (40 fps) kan deze identificatie helpen.
    5. Zodra een burst is geïdentificeerd, retourneert u de helderheid voor dit kanaal naar een normaal niveau en snijdt u de Hyper stack in deze regio en z-slice.

2. evaluatie van extravasculaire dextran met behulp van vaste weefsel analyse

  1. Tumor en monstervoorbereiding
    Opmerking: het 2ND deel van dit protocol gaat ervan uit dat borsttumoren zijn geoogst van een orthotopic transplantatie muismodel van borst carcinoom (D.W.Z. de Mmtv-PyMT). Dit model kan hetzelfde zijn als in het 1St -deel van het Protocol, hoewel fluorescently-gelabelde tumoren op dit punt niet nodig zijn.
    1. Na de beëindiging van de experimentele pijpleiding (d.w.z. medicamenteuze behandelingen, enz.), voert u een staart-ijdele injectie van 100 μL van 10 mg/mL 155 kDa dextran-tetramethyl Rhodamine, 1 h voor het opofferen van de muizen.
    2. Offer de muizen en oogst de borsttumoren.
    3. Los tumoren op in 10% formaline voor 48-72 h en ga verder met paraffine-inbedding.
    4. Snijd met behulp van een microtoom twee sequentiële dia's van 5 μm dik van de formalin-Fixed paraffine-ingesloten (FFPE) weefsels. Een dia wordt gebruikt voor het vlekken op de dextran, terwijl de andere wordt gebruikt voor het uitvoeren van TMEM Triple-IHC, ter referentie.
      Opmerking: het protocol TMEM Triple-immunohistochemie is elders beschreven 10.
  2. ALS vlekken en scannen voor de eerste van de twee opeenvolgende secties
    1. Dia's indienen bij een standaard-de-paraffinisatie-protocol. Dit omvat twee daaropvolgende onderdompeling in xyleen (10 min elk), gevolgd door uitdroging in sereen verdunde alcohol oplossingen (100%, 95%, 70%, en 50% EtOH in H2O gedurende 2 min elke onderdompeling).
    2. Antigeen opvraging uitvoeren door verhitting (dicht bij het kookpunt) de secties ondergedompeld in citraat (pH 6,0-aangepast) gedurende 20 min.
    3. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur voor 15-20 min en was vervolgens wassen in PBS 3x voor 2 min elke was.
    4. Blok voor 60-90 min in blokkerende buffer (10% FBS; 1% BSA; 0,0025% vis huid gelatine; 0,05% PBST, d.w.z. PBS met 0,05% Tween-20).
    5. Inbroed monsters met een mengsel van primaire rat en konijnen antilichamen die respectievelijk gericht zijn op Endomucin en TMR, en vervolgens wassen in PBST 3x, 2 min elk.
    6. Inbroed monsters met een mengsel van secundaire ezel antilichamen tegen rat IgG (geconjugeerd aan Alexa-647) en konijn IgG (geconjugeerd met Alexa-488), en was vervolgens in PBST 3x 2 min elk.
    7. Voer een routinematige DAPI-kleuring uit (d.w.z. onderdompeling in DAPI-oplossing voor 5-6 min), Monteer de dia's met behulp van een glycerol-vrij "hard" bevestigings medium en bewaar ze op een donkere plaats tot het scannen.
    8. Voor optimale resultaten scant u de dia's op een digitale scanner voor hele dia's.
  3. Beeldanalyse
    1. Leg 10 High Power Fields (HPFs) per geval vast met behulp van alle software die geschikt is voor digitale pathologie.
    2. Sla de kanalen Endomucin (rood) en TMR (groen) afzonderlijk op als TIFF.
    3. Upload de TIFF-bestanden met ImageJ en converteer ze naar 8-bits afbeeldingen.
    4. Drempelwaarde de 8-bits afbeeldingen op het niveau van de negatieve controle en genereren van twee in afbeeldingen, met de endomucin en TMR "maskers".
    5. Selecteer in de binaire gereedschappen de optie gaten vullen op het masker endomucin.
    6. Genereer en bewaar de volgende vijf gebieden van belang: 1) de thresholded dextran afbeelding als "dextran ROI" (ROI1), 2) de thresholded endomucin beeld als "vasculaire ROI" (ROI2), 3) het omgekeerde endomucin beeld als "Extravasculaire ROI" (ROI3), 4) de doorsnede " Extravasculaire ROI "en" dextran ROI "afbeelding (ROI1 ∩ ROI3) als" Extravasculaire dextran ROI "(ROI4), en 5) de gehele afbeelding als" tumor ROI "(ROI5).
    7. Verdeel het ROI4 gebied door het ROI5 gebied en vermenigvuldig met 100 om het percentage gebied te genereren dat de extravasculaire dextran beslaat in de gehele tumor.
    8. Herhaal het proces voor 10-20 HPFs per geval (afhankelijk van de beschikbaarheid van weefsel) en Genereer een gemiddelde Extravasculaire dextran (%-gebied) voor elk geval.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De in dit protocol beschreven experimentele procedures worden kort samengevat en geïllustreerd in Figuur 1A-C.

Om de TMEM-gemedieerde vasculaire permeabiliteit ("barsten activiteit") te meten en om experimenteel geluid te verminderen van andere vormen van vasculaire permeabiliteit (d.w.z. transcellulaire en paracellulaire, zoals uitgelegd in de inleiding), voerden we intraveneuze (i.v.) injectie van hoogmoleculair gewichts voelers, zoals 155 kDa d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier schetsen we twee protocollen die kunnen worden toegepast om een specifiek type vasculaire permeabiliteit te visualiseren en te kwantificeren dat aanwezig is op TMEM-deuropeningen en wordt geassocieerd met de verstoring van vasculaire strakke en aanhekings knooppunten. Dit type vasculaire permeabiliteit is van voorbijgaande aard en wordt gecontroleerd door het tripartiete TMEM-celcomplex, zoals hierboven beschreven5. De mogelijkheid om TMEM-geassocieerde vasculaire permeabiliteit te identifice...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs maken geen belangenconflicten bekend.

Dankbetuigingen

We willen de analytische Imaging Facility (AIF) bedanken in het Albert Einstein College of Medicine voor Imaging support. Dit werk werd gesteund door subsidies van de NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 en CA216248), de SIG 1S10OD019961-01, het Gruss-Lipper Biophotonics Center en zijn geïntegreerde beeldvormings programma, en Montefiore ' s Ruth L. Kirschstein T32 opleidings subsidie van chirurgen voor de studie van de tumor micro Environment (CA200561).

GSK schreef het manuscript samen, voerde Imaging uit voor figuur 1c en 3B, ontwikkelde een protocol voor de analyse van vaste weefsels en analyseerde en interpreteerde alle gegevens; Jmp schreef het manuscript samen en voerde de chirurgie en intravital Imaging uit voor figuur 1b, 2C en 3a; LB & AC voerde de operatie uit en intravital beeldvorming voor figuur 2b; RJ voerde de operatie uit en intravital beeldvorming voor Figuur 2a; JSC schreef het manuscript samen en analyseerde en interpreteerde alle gegevens; MHO schreef het manuscript samen en analyseerde en interpreteerde alle gegevens; en de voerde de operatie en intravital beeldvorming voor figuur 2D, co-schreef het manuscript, ontwikkelde vaste weefsel analyse en intravital Imaging protocollen, en geanalyseerd en geïnterpreteerd alle gegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-rabbit IgG (Alexa 488)Life Technologies CorporationA-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647)Life Technologies CorporationA-21247
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CitrateEng Scientific Inc9770
Cover Glass SlipsElectron Microscopy Sciences72296-08
Cyanoacrylate AdhesiveHenkel Adhesive1647358
DAPIPerkin ElmerFP1490
Dextran-Tetramethyl-RhodamineSigma AldrichT1287
DMEM/F12Gibco11320-033
Endomucin (primary antibody)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
EnrofloxacinBayer84753076 v-06/2015
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442
Fish Skin GelatinFisher ScientificG7765
Insulin SyringeBecton Dickinson309659
IsofluoraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
MatrigelCorningCB40234Kunstmatige extracellulaire matrix
Needle (30 G)Becton Dickinson305128
Phosphate Buffered SalineLife Technologies CorporationPBS
Polyethylene TubingScientific Commodities IncBB31695-PE/1
Pulse OximeterKent ScientificMouseOx
Puralube Vet OintmentDechraNDC 17033-211-38
Quantum DotsLife Technologies CorporationQ21561MP
RubberMcMaster Carr1310N14
TMR (primary antibody)InvitrogenA6397
Tween-20MP BiologicalsTWEEN201
XyleneFisher Scientific184835

Referenties

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42(2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112(2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75(2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271(2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042(2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

TMEM doorgangimmunofluorescentie van gefixeerd weefselhoogmoleculair dextraanendomucine kleuringTMR dextraanlabelingextravasculaire dextraananalyse
Beoordeling van tumor Microenvironment van metastasen doorway-gemedieerde vasculaire permeabiliteit geassocieerd met kanker cel verspreiding met behulp van Intravital beeldvorming en vaste weefsel analyse
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.