Een Bevriezings methode voor het bereiden van Chitosan-poly (vinyl alcohol) hydrogels zonder dwars verbindingsmiddelen en Diflunisale vrijgave studies

Samenvatting

De vriesontdooi methode wordt gebruikt voor de productie van Chitosan-poly (vinyl alcohol) hydrogels zonder dwars verbindingsmiddelen. Voor deze methode is het belangrijk om de Vries condities (temperatuur, aantal cycli) en polymeer verhouding te overwegen, wat de eigenschappen en toepassingen van de verkregen hydrogels kan beïnvloeden.

Samenvatting

Chitosan-poly (vinyl alcohol) hydrogels kunnen worden geproduceerd door middel van de Freeze-Thawing-methode zonder gebruik te maken van giftige crosslinking-agenten. De toepassingen van deze systemen worden beperkt door hun kenmerken (bijv. porositeit, flexibiliteit, zwelling capaciteit, drugs belasting en geneesmiddelafgifte capaciteit), die afhangen van de Vries condities en de aard en verhouding van polymeren. Dit protocol beschrijft hoe u hydrogels van Chitosan en poly (vinyl alcohol) bereiden op 50/50 w/w% van de polymeer samenstelling en de vriestemperatuur variëren (-4 °C,-20 °C,-80 °C) en vries dooi cycli (4, 5, 6 Vries cycli). FT-IR spectra, SEM Microscoop en porosimetrie gegevens van hydrogels werden verkregen. Ook werden de zwelling capaciteit en drug laden en vrijlating van bifenylstructuur beoordeeld. Resultaten van SEM micro Foto's en porosimetrie tonen aan dat de poriëngrootte afneemt, terwijl de porositeit toeneemt bij lagere temperaturen. Het zwelling percentage was hoger bij de kleine vriestemperatuur. De afgifte van bifenylstructuur uit de hydrogels is bestudeerd. Alle netwerken handhaven de drug vrijlating voor 30 h en geconstateerd is dat een eenvoudige diffusie mechanisme regelt de bifenylstructuur vrijlating volgens korsmeyer-peppas en Higuchi modellen.

Inleiding

Onlangs hebben hydrogels veel interesse in het biomedische gebied, omdat het driedimensionale netwerken zijn met een hoog watergehalte en zacht en flexibel zijn, zodat ze natuurlijke weefsels gemakkelijk kunnen nabootsen¹. Ook, ze niet oplossen in waterige medium op fysiologische temperatuur en pH maar presenteren een grote zwelling². Hydrogels kunnen fungeren als tissue engineering steigers, hygiëne producten, contactlenzen en wondverbanden; omdat ze kunnen vangen en vrijgeven van actieve verbindingen en drugs, ze worden gebruikt als drug delivery Systems³. Afhankelijk van hun toepassing kunnen hydrogels worden gemaakt van natuurlijke of synthetische polymeren, of een combinatie van beide, om de beste eigenschappen te verkrijgen⁴.

De eigenschappen van hydrogels zijn een gevolg van vele fysische en chemische factoren. Op fysiek niveau zijn hun structuur en morfologie afhankelijk van hun porositeit, poriegrootte en porie verdeling⁵. Op chemisch en moleculair niveau zijn het polymeer type, de hydrofiele groepsinhoud in de polymeer keten, het kruiskoppelings punt type en de kruislings verbindende dichtheid de factoren die de zwelling capaciteit en de mechanische eigenschappen^6,7bepalen.

Volgens het type crosslinking-middel dat wordt gebruikt om het netwerk te vormen, worden de hydrogels geclassificeerd als chemische hydrogels of fysische hydrogels. Chemische hydrogels worden samengevoegd met covalente interacties tussen hun ketens, die worden gevormd door UV-en gamma-bestraling of met behulp van een crosslinking-agent^7,8. Chemische hydrogels zijn meestal sterk en resistent, maar in het algemeen is de crosslinking-agent giftig voor de cellen en de verwijdering ervan is moeilijk, dus de toepassing ervan is beperkt. Aan de andere kant vormen fysische hydrogels door de aansluiting van de polymeerketens door niet-covalente interacties, waarbij het gebruik van crosslinking-agenten^4,9wordt vermeden. De belangrijkste niet-covalente interacties in het netwerk zijn hydrofobe interacties, elektrostatische krachten, complementaire en waterstof grenzen⁷.

Poly (vinyl alcohol) (PVA, Figuur 1a) is een synthetisch en in water oplosbaar polymeer met uitstekende mechanische prestaties en biocompatibiliteit die kunnen worden van cross link agent-Free hydrogels door middel van de Freeze-Thawing methode^10,11. Dit polymeer heeft de capaciteit om geconcentreerde zones van waterstofbindingen te vormen tussen-OH-groepen van hun ketens (kristallijne zones) wanneer ze¹²bevriezen. Deze kristallijne zones fungeren als crosslinking-punten in het netwerk en worden gepromoot door twee gebeurtenissen: het naderen van de polymeerketens wanneer het kristalwater zich uitbreidt en de PVA-conformationele veranderingen van isotactiek naar syndiotactische PVA tijdens Freeze¹³. Door het vriesdrogen worden de waterkristallen gesublimeerd, waardoor er leegte ruimten zijn die de poriën in de hydrogel¹⁴zijn. Om hydrogels met betere eigenschappen te verkrijgen, kan PVA gemakkelijk worden gecombineerd met andere polymeren.

In die zin vormt Chitosan een optie omdat het het enige biopolymeer is van natuurlijke bronnen met positieve ladingen. Het wordt verkregen door de deacetylering van chitine en het bestaat uit willekeurige combinaties van β-1, 4 gekoppelde D-glucosamine (deacetylated Unit) en N-acetyl-D-glucosaminehoudende (geacetoneerde eenheid)^15,16 (Figuur 1b). Chitosan is biologisch afbreekbaar door menselijke enzymen en het is biologisch compatibel. Ook, door zijn kationische aard, het kan communiceren met de negatieve lading van het celoppervlak, en deze eigenschap is geassocieerd met zijn antimicrobiële activiteit¹⁷. Dit polymeer is eenvoudig te verwerken; echter, hun mechanische eigenschappen zijn niet voldoende en sommige materialen zijn toegevoegd aan het vormen van complexen met betere kenmerken.

Gezien de specifieke kenmerken van Chitosan en PVA, is de succesvolle vervaardiging van hydrogels bereikt met de Vries-ontdooiing methode^2,18 om het gebruik van toxische crosslinking-agenten te voorkomen. In Chitosan-PVA-hydrogels worden de kristallijne zones van PVA ook gevormd, en Chitosan ketens worden doorgedrongen en vormen eenvoudige waterstofbindingen met-NH₂ groepen en-Oh groepen in PVA. De laatste Chitosan-PVA hydrogel is mechanisch stabiel, met hoge frequenties van zwelling en lage toxiciteit, en met antibacteriële werking¹⁸. Afhankelijk van de Vries condities die in het preparaat worden gebruikt (temperatuur, tijd en aantal cycli), kunnen de uiteindelijke eigenschappen echter veranderen. Sommige studies melden dat het verhogen van het aantal bevriezings cycli vermindert de zwelling graad en verhoogt de treksterkte^19,20. Om het netwerk te versterken, zijn andere middelen, zoals gamma-en UV-straling en chemische reologie, aanvullend gebruikt na de Vries ontdooide voorbereiding^21,22,23. Hydrogels met een hogere Chitosan verhouding hebben een meer poreus netwerk en een hoge zwelling capaciteit, maar minder sterkte en thermische stabiliteit. In deze context is het belangrijk om de bereidings voorwaarden te overwegen om geschikte hydrogels te verkrijgen voor hun doeltoepassing.

Het doel van dit werk is om gedetailleerd te presenteren hoe de Vries condities (temperatuur van bevriezing en aantal cycli) van invloed zijn op de uiteindelijke kenmerken van CS-PVA-hydrogels. FT-IR spectra, morfologische en porositeit eigenschappen en zwelling capaciteit werden geëvalueerd, evenals drug loading en release capaciteit. In de release studies werd bifenylstructuur (Figuur 1c) gebruikt als model medicijn, vanwege de grootte die geschikt is voor de hydrogel structuur.

Protocol

1. bereiding van Chitosan-PVA-hydrogels

1. Bereid 2% (w/w) Chitosan en 10% (w/w) PVA-oplossingen voor. Los 0,2 g Chitosan op in 10 mL 0,1 M CH₃COOH-oplossing (eerder gefilterd) bij kamertemperatuur en houd 's nachts continu mechanisch roeren. Los 1 g PVA op in 10 mL gedistilleerd water en roer gedurende 1 uur bij 80 °C.
2. Meng beide oplossingen 1:1 met behulp van een magnetische roerder tot ze homogeen zijn bij kamertemperatuur, en giet de mengsels op Petri schalen. Laat de monsters 2 uur bij atmosferische druk op Degas.
3. De hydrogels bevriezen bij-4 °C,-20 °C of-80 °C gedurende 20 uur en 4 cycli (monsters CP4-4, CP4-20 en CP4-80, respectievelijk). Vries nog een hydrogel in bij-80 °C gedurende 20 uur met 5 of 6 Vries cycli (monsters CP5-80 en CP6-80). Na de derde Vries cyclus was de hydrogels met gedeïoniseerd water. Op het einde, bevriezen-droog de hydrogels bij-46 °C voor 48 h en opslaan voor verdere karakterisering (methodologie aangepast uit²).

2. FT-IR-karakterisering

1. Plaats een klein stukje hydrogel (1 mm x 2 mm) in de FT-IR-spectrometer in de ATR-modus. Neem de FT-IR spectra van 4000 tot 600 cm^-1 (2 cm^-1 van resolutie en gemiddelde van 32 scans).

3. zwelling van de assays

1. Knip schijven (13 mm in diameter en 10 mm hoog) uit de hydrogel en weeg ze af. Incuberen de schijven in 50 mL gedeïoniseerd water met schudden bij 25 °C. Herhaal dit drie keer.
2. Elke 30 min Verwijder het monster van het medium, Blotter om het overtollige water te elimineren en weeg. Bereken de zwelling graad met behulp van de vergelijking 1 en bereken de evenwichtstoestand van zwelling,, bij 24 h met behulp van de vergelijking 2.
   )
   Waar is het gewicht van de droge hydrogel en is het gewicht van de natte hydrogel.
   

4. elektronische microscopie

1. Bedek een klein stukje hydrogel met een dunne gouden laag (30 s en 10 mA) in een sputteren coater.
2. Steek het monster in een scanning elektronen microscoop (SEM). Analyseer de monsters onder vacuüm bij 20 kV en neem de beelden met een vergroting van 500x en 1500x.

5. porosimetrie

1. Plaats schijven met een diameter van 15 mm en een gewicht van ongeveer 0,26 g in de penetratie (een massieve penetratie, met een bulk volume van 0,3660 ml en 5,7831 ml van het stam volume). Analyseer de porositeit en poriegrootte door kwik inbraak porosimetrie (MIP).
2. Voer het experiment uit in de hysterese-modus (inbraak-extrusie). Meet het totale inbraak volume (mL/g), het totale porie gebied (m²/g), porie diameter (μm), porositeit (%), permeabiliteit (mDarcy) en tortuositeit. Herhaal dit twee keer.

6. drug laden en vrijgeven

1. Voor het laden, bereid 4 L van 15 mg/L diflunisale oplossing en roer 's nachts. Bevestig de concentratie van de oplossing met UV-VIS-spectroscopie (initiële concentratie). Inderdaad, zwellen 400 mg gevriesdroogde monsters van hydrogel in 6 mL gedistilleerd water voor 24 h.
2. Vul voor het laden een kolf met 50 mL diflunisale oplossing en houd bij 25 °C constant roeren. Dompel de hydrogel in de kolf.
   1. Neem op verschillende tijdstippen aliquots van de resterende diflunisale oplossing (2 mL) om de plateau regio van de curve te bepalen, bijvoorbeeld: 3, 6, 24, 27, 30 en 48 u. Na 24 h de oplossing vervangen door een nieuwe.
3. Meet de extinctie op 252 nm van elk aliquot en bepaal de concentratie diflunisale die aanwezig is in de oplossing met behulp van een ijkcurve van diflunisaal. Bereken de hoeveelheid bifenylstructuur die in de hydrogel wordt vastgehouden bij 24 en 48 uur, als het verschil tussen de initiële en de eindconcentratie, rekening houdend met het totale volume (56 ml).
   1. Bepaal de inkapings efficiëntie (EE) met behulp van de vergelijking 3.
      
   2. Vries de geladen hydrogels bij-80 °C en lyophilize bij-50 °C.
4. Voor de afgifte van geneesmiddelen, submerge 300 mg gevriesdroogde diflunisale geladen hydrogels in 50 mL fosfaatbuffer (pH 7,4) bij 25 ° c. Blijf constant roeren. Zuig aliquots van 2 mL op verschillende tijdstippen op en vervang het met vers medium om een constant volume te behouden.
   1. Bepaling van de diflunisale die spectrofotometrisch is vrijgegeven bij 252 nm, volgens een ijkcurve.
5. Afleiden van de overheersende drug release mechanisme in de hydrogels aanpassen van de drug release gegevens die overeenkomen met de eerste 60%, naar de Korsmeyer-Peppas model (vergelijking 4), om de kinetische (k) en de diffusie (n)-constanten te verkrijgen. De n waarden geven het mechanisme van drug release^24,25. Dan, n waarden dicht bij 0,5 zijn gerelateerd aan fickian Diffusion, ondertussen waarden van 0.5-1.0 voor afwijkend transport, waar zijn betrokken diffusie en ontspannings ketens, en ten slotte, waarden van 1,0 zijn gerelateerd aan Case II transport.
   
   1. Als u de resultaten wilt bevestigen, gebruikt u de wiskundige modellen Higuchi, first order en Zero order (vergelijkingen 5 tot en met 7) en selecteert u de betere pasvorm.
   2. 
      
      
      waarbij t de vrijgavetijd vertegenwoordigt, MT de hoeveelheid geneesmiddel die op een gegeven moment wordt afgeleverd, en M_∞ de totale hoeveelheid geneesmiddel die aan het einde van het proces wordt afgeleverd.

Resultaten

Voorbereiding van hydrogels
Chitosan-PVA-hydrogels werden verkregen bij-4 °C,-20 °C en-80 °C met 4 Vries cycli en bij-80 °C met 5 en 6 Vries cycli door de eerder gemelde bevriezings methode². Alle hydrogels waren homogeen, semi-transparant, flexibel en bestand tegen manipulatie.

FT-IR-karakterisering
De FT-IR spectra zijn weergegeven in Figuur 2...

Discussie

De Freeze-Thawing-methode is een geschikt proces om biocompatibele hydrogels te bereiden die zich concentreren op biomedische, farmaceutische of cosmetische toepassingen^34,35,36. Het belangrijkste voordeel van deze methode, in vergelijking met andere bekende methoden om hydrogels voor te bereiden, is dat crosslinking-agent gebruik wordt vermeden, wat een ontstekingsreactie of nadelige effecten in het menselijk lichaam kan veroor...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materials:
Chitosan medium moleculair gewicht	Sigma-Aldrich	448877	Mw bepaald door capillaire viskometrie (637.000 Da) en deacetyleringsgraad van 70%
Diflunisal (2'-4'-difluoro-4-hydroxy-3-bifenyl-carboxylazuur)	Merck
IJsazijn	Sigma-Aldrich	1005706
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	341584	Mw 89.000-98.000, 99+% gehydrolyseerd
Equipment:
Cressington Sputter Coater 108 auto	TED PELLA INC
Cryodos lyofilisaat	Telstar
Falcon buisjes	Thermo Fisher Company
FT-IR spectroscopie	Nicolet iS50	in ATR-modus
Lyofilisaat	LABCONCO
Micromeritics Autopore IV 9500	Micromeritics
Scanning elektronenmicroscoop	Pemtron SS-300LV
UV-zichtbaar spectrofotometer	Agilent 8453