Bouw van CRISPR Plasmids en detectie van knock-out efficiëntie in zoogdiercellen door middel van een Dual Luciferase Reporter System

Summary

Hier presenteren we een protocol dat een gestroomlijnde methode beschrijft voor het efficiënt genereren van plasmiden die zowel het CRISPR-enzym als het bijbehorende single guide RNA (sgRNAs) uitdrukken. Co-transfectie van zoogdiercellen met deze sgRNA / CRISPR vector en een dubbele luciferase reporter vector die dubbelstreng breuk reparatie onderzoekt maakt evaluatie van knock-out efficiëntie.

Abstract

Hoewel zeer efficiënt, wijziging van een genomic site door de CRISPR enzym vereist de generatie van een sgRNA uniek voor de doelsite (s) vooraf. Dit werk beschrijft de belangrijkste stappen die leiden tot de bouw van efficiënte sgRNA-vectoren met behulp van een strategie die het mogelijk maakt de positieve kolonies efficiënt te detecteren door PCR voorafgaand aan DNA-sequencing. Aangezien een efficiënte genoombewerking met behulp van het CRISPR-systeem een zeer efficiënte sgRNA vereist, is een voorselectie van kandidaat-sgRNA-doelen noodzakelijk om tijd en moeite te besparen. Een dubbele luciferase reporter systeem is ontwikkeld om knock-out efficiëntie te evalueren door het onderzoeken van double-strand break reparatie via single strand annealing. Hier gebruiken we dit reportersysteem om het gewenste xCas9/sgRNA-doel op te pikken van kandidaat-sgRNA-vectoren voor specifieke genbewerking. Het geschetste protocol biedt binnen 10 dagen een voorkeur sgRNA/CRISPR enzymvector (te beginnen met de juiste ontworpen oligonucleotiden).

Introduction

De CRISPR sgRNAs bestaan uit een 20-nucleotide sequentie (de protospacer), die complementair is aan de genomische doelvolgorde^1,2. Hoewel zeer efficiënt, vereist het vermogen van het CRISPR/Cas-systeem om een bepaalde genomische site te wijzigen de generatie van een vector die een efficiënte sgRNA draagt die uniek is voor de doellocatie(s)². Dit artikel beschrijft de belangrijkste stappen in het genereren van die sgRNA-vector.

Voor succesvolle genoombewerking met behulp van het CRISPR/Cas-systeem is het gebruik van zeer efficiënte sgRNAs een cruciale voorwaarde^3,4,5. Aangezien de nucleases die worden gebruikt bij genoombewerking, verschillende efficiëntieverbeteringen bij verschillende gerichte loci^1,is een voorselectie van kandidaat-sgRNA-doelstellingen noodzakelijk om tijd en moeite te besparen^6,7,8,9. Een dubbele luciferase reporter systeem is ontwikkeld om knock-out efficiëntie te evalueren door het onderzoeken van double-strand break reparatie via single strand annealing^3,10. Hier gebruiken we dit reporter systeem om een voorkeur CRISPR sgRNA doel te kiezen uit verschillende kandidaat sgRNA vectoren ontworpen voor specifieke genbewerking. Het hier vermelde protocol is de afgelopen jaren geïmplementeerd in onze groep en samenwerkende laboratoria om CRISPR-sgRNAS te genereren en te evalueren.

Het volgende protocol vat samen hoe geschikte sgRNA te ontwerpen via netwerksoftware. Zodra de geschikte sgRNAs zijn geselecteerd, beschrijven we de verschillende stappen om de vereiste oligonucleotiden te verkrijgen, evenals de aanpak voor het invoegen van de gepaarde oligonucleotiden in de pX330-xCas9 expressievector. We presenteren ook een methode voor het assembleren van sgRNA-expressing en dual luciferase reporter vectoren op basis van de ligatie van deze sequenties in een voorverterde expressie vector (stappen 2-10, Figuur 1A). Tot slot beschrijven we hoe de DNA-snijefficiëntie voor elk van de sgRNAs (stap 11-12) te analyseren.

Protocol

1. sgRNA oligonucleotide ontwerp

1. Ontwerp sgRNAs met behulp van online tools zoals de Cas-Designer online tool (http://www.rgenome.net/cas-designer/). De PAM-sequentie is belangrijk op basis van de Cas9 die wordt gebruikt. Voor xCas9 zijn de relevante PAM-sequenties NG en kan de voormalige verwezen Cas-Designer online tool xCas9 relevante sgRNAS genereren.
   1. Gebruik sgRNA-ontwerptools die algoritmen omvatten voor on- en off-target voorspelling (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)¹¹. Een score van 0,2 of hoger heeft de voorkeur.
2. Selecteer maximaal 3 genbewerkingsdoelen voor een optimale screening (bijvoorbeeld T1, T2 en T3 zijn ontworpen voor schapen DKK2 exon 1 gentargeting [Tabel 1]).

2. Wijziging van oligonucleotide

1. Om de sgRNA oligonucleotide te wijzigen, verwijdert u het aangrenzende motief 3'-NG (PAM), waarbij de protospacer-sequentie behouden blijft (bijvoorbeeld de beginreeks voor T1: TGCCTCTCTACTGGCCGC [20 nt]).
2. Voeg de pentanucleotide CACCG toe aan de 5'-einde van de oligo.
   OPMERKING: Na ligatie van het pX330-xCas9 skelet, zal deze sequentie de 3'-end van de U6-promotor bevatten die sgRNA-transcriptie motiveert. De array "CACC" garandeert dat de oligo overeenkomt met de uitsteeklengten van de BbsI-verteerde pX330-xCas9 plasmid. De basis "G" is een voorwaarde van RNA Polymerase III promotors en garandeert de effectieve opstarten van sgRNA transcriptie (bijvoorbeeld, het toevoegen van de 5'-CACCG array aan de protospacer van T1, het bereiken van T1-F: CACCGTCTGCTCCTACTGGCCGC [25 NT]). De decolleté-efficiëntie van 21 nt gRNA verschilt aanzienlijk van die van 20 nt gRNA^1,12,13,14. Het wordt over het algemeen aangeraden om 20 nt met 5'-G te gebruiken door het genereren van een kortere protospacer, als dit niet mogelijk is dan kan 21 nt met extra 5'-G worden gebruikt.
3. Maak een omgekeerde aanvulling (rc) van de protospacer sequentie.
   OPMERKING: De rc van de T1 protospacer is bijvoorbeeld GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt).
4. Toe te rekenen AAAC aan de 5'-end van de rc protospacer sequentie. Plaats een extra C aan de 3'-end van de rc protospacer.
   OPMERKING: De "AAAC" sequentie zorgt ervoor dat de oligonucleotide geschikt is om te klonen in de BbsI-verteerde pX330-xCas9 plasmide. De aanvullende "C"op de 3'end is essentieel voor annealing met de initiërende "G" voor de sgRNA transcriptie hierboven beschreven (bijvoorbeeld AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] is de laatste oligonucleotide sequentie voor T1 rc protospacer).
5. Bestel de oligonucleotiden.

3. Oligonucleotide annealing

1. Verdun lyophilized oligonucleotiden tot een uiteindelijke concentratie van 10 μM in dubbel gedestilleerd water (ddH₂O).
2. Meng oligonucleotiden naar voren en achteruit in een dunne wand-PCR-buis met een 1:1-verhouding (bijvoorbeeld 20 μL per stuk) zonder extra buffer toe te voegen.
3. Broed het mengsel gedurende 5 minuten op 95 °C en raast vervolgens 10 min naar 72 °C. Volg met een afkoelingsperiode op kamertemperatuur (RT) bestaande uit het eenvoudig verwijderen van het monster uit de PCR-machine en het plaatsen van het op RT.
   OPMERKING: Het is niet nodig om de oligonucleotidemengsels te fosforyleren om de ligatie te vergemakkelijken.

4. sgRNA/CRISPR vectorvertering

1. Verprevert 1 μg van de geselecteerde pX330-xCas9 vector met BbsI (10 enzymeenheden per 1 μg plasmide) gedurende 2 uur bij 37 °C (figuur 2). Voer de vertering van de pX330-xCas9 sgRNA expressievector uit in een totaal volume van 50 μL, met 5 μL 10x spijsverteringsbuffer en gedestilleerd water om het uiteindelijke volume te bereiken.
2. Zuiver de verteerde vector door bandextractie uit een 2% agarosegel onder 10 V/cm en zuiver vervolgens met behulp van een silicakolom met behulp van een commerciële gelextractiekit.

5. Ligatie van de geannealed sgRNA oligonucleotiden aan de expressievector

1. Meng de geannealed sgRNA oligonucleotiden (5 μL van het mengsel vanaf stap 4) met de BbsI-verteerde pX330-xCas9 vector (gezuiverd, 100 ng).
2. Voeg 1 μL ligase en 1 μL 10x ligase buffer toe.
3. Voeg gedestilleerd water toe met het juiste volume, tot 10 μL.
4. Incubeer 's nachts bij 4 °C.

6. Competente celtransformatie

1. Haal e. coli DH5α-bevoegde cellen uit de opslag bij -80 °C en ontdooi het op ijs.
2. Voeg 5 μL van het ligatiemengsel toe aan 50 μL van de bevoegde E. coli DH5α en houd het mengsel 30 minuten op ijs.
3. Verwarm het mengsel op 42 °C voor 90 s.
4. Laat het 2 minuten op ijs rusten.
5. Herstel de cultuur op een roterende shaker in 500 μL LB-media voor 1 h bij 37 °C.
6. Plaat 200 μL van de cultuur op een ampicilline weerstand LB agaroseplaat en incubatie het 's nachts bij 37 °C.

7. Identificatie van de juiste recombinant plasmiden door PCR

1. Kies 5 tot 10 bacteriële kolonies uit de LB-plaat en gebruik elk van hen om een 1,5 mL buis met 1 mL LB-media met 60 mg/mL ampicilline in te enten.
2. Broed de buizen op een roterende shaker voor 2-3 h.
3. Voer detectie uit van correcte recombinant plasmiden met behulp van specifieke primerparen voor de sgRNA oligonucleotiden [bijvoorbeeld voorwaartse primer voor T1 sgRNA expression vector constructie (T1-F): CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC, reverse primer (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, het produceren van een 287 bp amplicon (figuur 3)].
   1. Bereid het PCR-mengsel(tabel 2) voor.
   2. Gebruik de volgende PCR-fietsomstandigheden: 95 °C gedurende 5 minuten voor pre-denaturatie; 30 cycli van 95 °C voor 30 s voor denaturatie, 60 °C voor 30 s voor annealing en 72 °C voor 30 s voor uitbreiding. Na de 30 cycli zijn voltooid, voert u een laatste uitbreidingsstap uit door 5 min te verwarmen bij 72 °C.
   3. Voer het PCR-product uit op een 2% agarose gel onder de 10 V/cm. Een band op de juiste grootte [bijvoorbeeld 287 bp] wordt als positief beschouwd.

8. Valideer de volgorde van sgRNA expressie plasmide

1. Controleer de volgorde van PCR positieve kolonies door Sanger sequencing¹⁵ met behulp van de omgekeerde primer BbsI-R (zie stap 7.3). Deze primer anneals op de site stroomafwaarts van de sgRNA oligo insert. De pX330-xCas9-T1 uitdrukken sgRNA sequentie met protospacer TGCCTGCCTACTGGGG EN xCas9 werd gebouwd.
2. Gebruik de voorwaartse primer T1-F om de positieve kolonies te sequencen. De voorwaartse kon niet geven volledige sequentie informatie voor de site rond de invoeging site van de sgRNA oligo, omdat 30-50 bp fragment na de sequencing primer kon niet precies worden uitgelezen.

9. Bouw van dubbele luciferase reporter vector

1. Synthetiseer 300-500 bp DNA-fragmenten met de sgRNA-doelen en subclone het in een dubbele luciferase reporter vector door middel van dubbele spijsvertering [bijvoorbeeld, subclone 440 bp schapen DKK2 exon1 fragment in pSSA-Dual plasmid^16,17 met behulp van dubbele spijsvertering met AscI en SalI, resulterend pSSA-Dual-DKK2].
2. Synthetiseer 300-500 bp DNA fragmenten met de sgRNA doelen. Merk op dat de sequenties van de DNA-fragmenten delen van de genomische sequenties moeten zijn, die kunnen worden verkregen op de NCBI-website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) of gerelateerde referenties.
3. Selecteer een geschikte dubbele luciferase reporter vector zoals pSSA-Dual^16,17 (of twee vectoren uitdrukken firefly luciferase en renilla luciferase respectievelijk) en vervolgens verteren deze vector en de DNA-fragmenten hierboven vermeld met twee endonucleases zoals AscI en SalI.
4. Ten slotte ligate deze twee fragmenten met T4 DNA Ligase, wat resulteert in pSSA-Dual-Target. Details voor dubbele vertering en ligatie worden weergegeven in respectievelijk tabel 3 en tabel 4. Het is vermeldenswaard dat de reporter vector moet worden versterkt in stabiele bacteriën stammen (zoals Top10), die worden aanbevolen om te worden gekweekt met een lagere rotatiesnelheid (meestal niet meer dan 200 rpm), met het oog op het vermijden van DNA recombinatie.

10. Celtransfectie

1. Extract endotoxinevrije plasmiden voor vectoren hierboven vermeld. Evalueer de zuiverheid en concentratie van de plasmiden met behulp van geschikte instrumenten. Voor deze plasmiden worden een eindconcentratie van maar liefst 500 ng/μL en een zuiverheidsverhouding van 1,7-1,9 bij absorptie van 260/280 nm (A260/A280) aanbevolen.
2. Co-transfect een geschikte cellijn zoals PIEC¹⁸ met de plasmiden in gelijke verhouding (bijvoorbeeld pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, 0,5 μg plasmid voor elke duplicatie bij gebruik van 24 putplaat). Gebruik een lege vector zoals pX330-xCas9 als negatief besturingselement.
   1. Een dag voor de transfectie, plaatcellen in een 24-well kweekplaat bij een dichtheid van 2 x 10⁵ cellen/goed. Cellen zullen klaar zijn voor transfectie wanneer ze een samenvloeiing van 60-80% bereiken.
   2. Verwijder voor het transfectietijdpunt de supernatant zoveel mogelijk en voeg voorzichtig 0,5 mL verse media toe voor elke put.
   3. Verdun transfectiereagens in DMEM-media met een verhouding van 1:25 en meng goed.
   4. Bereid de mastermix van DNA voor door 0,5 μg DNA in 25 μL DMEM-media te verdunnen en voeg vervolgens 1 μL P3000-reagens toe.
   5. Voeg verdund DNA toe aan elke buis van verdund transfectiereagens (1:1-verhouding).
   6. Incubeer gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur.
   7. Voeg 50 μL DNA-lipidecomplex toe aan cellen.
   8. Incubeercellen voor 24 uur bij 37 °C. Analyseer vervolgens transfected cellen zoals in stap 11.

11. Dual-luciferase detectie

1. Bereid een voldoende hoeveelheid van de 1x passieve lyse buffer (PLB) door 1 volume van 5x PLB toe te voegen aan 4 volumes gedestilleerd water en meng goed.
2. Passieve lysis van cellen gekweekt in 24-well cultuurplaten.
   1. Verwijder het groeimedium uit de gekweekte cellen en breng voorzichtig een voldoende volume fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan om het oppervlak van het kweekvat te wassen. Draai het vat kort om losstaande cellen en restgroeimedium te verwijderen. Verwijder de spoeloplossing volledig voordat u PLB-reagens aanbrengt.
   2. Doe 100 μL 1x PLB in elke cultuur goed om de celmonolaag volledig te bedekken. Laat de cultuurplaten 20 minuten staan.
   3. Breng het lysaat over op een buis of flesje voor verdere behandeling of opslag.
3. Bereid luciferase assay reagens (LAR) voor door het voorziene lyophilized luciferase assay substraat in 10 mL van de meegeleverde luciferase testbuffer opnieuw in te dienen.
4. Bereid een voldoende volume voor om het gewenste aantal dual-luciferase reporter tests uit te voeren (100 μL reagens per test). Voeg 1 volume van 50x stopsubstraat toe aan 50 volumes stopbuffer in een glas of geconsliceerde polypropyleenbuis.
5. Dual-luciferase reporter (DLR) test
   1. Programmeer luminometers om een voorgelezen vertraging van 2 seconden te bieden, gevolgd door een meetperiode van 10 seconden.
   2. Predispense 100 μL luciferase assay reagens in het juiste aantal luminometerbuizen om het gewenste aantal DLR Assays te voltooien.
   3. Breng voorzichtig tot 20 μL cellysaat over in de luminometerbuis met LAR; meng door pipetting 2 of 3 keer. Plaats de buis in de luminometer en start met meten.
   4. Verwijder de monsterbuis van de luminometer, voeg 100 μL stopreagens toe en draaikolk kort om te mengen. Vervang het monster in de luminometer en start meten.
   5. Nota van de renilla luciferase activiteit genormaliseerd tot de firefly luciferase activiteit, namelijk de wederkerigheid van de verhouding weergegeven op het scherm.
   6. Gooi de reactiebuis weg en ga naar de volgende test.

Results

De in dit protocol beschreven methoden zijn voor de bouw van sgRNA- en xCas9-expressievectoren en vervolgens voor de optimalisatiescreening van sgRNA-oligo's met relatief hogere gentargeting-efficiëntie. Hier tonen we een representatief voorbeeld van 3 sgRNA doelen aan schapen DKK2 exon 1. SgRNA en xCas9 uitdrukken vectoren kunnen worden gebouwd door het voorverteren van de vector ruggengraat (Figuur 2) gevolgd door het ligating in een reeks van korte double-streng DNA fragmenten do...

Discussion

De sgRNA vector klonen procedures die we hier hebben beschreven vergemakkelijkt een efficiënte productie van sgRNAs, met de meeste van de kosten afgeleid van de oligonucleotide bestellen en vector sequencing. Hoewel de geschetste methode is ontworpen om gebruikers in staat te stellen sgRNAs te genereren voor gebruik met CRISPR/Cas9, kan het protocol eenvoudig worden aangepast voor gebruik met Cas9-orthologues of andere RNA-geleide endonucleases zoals Cpf1, waarbij kleine wijzigingen worden aangebracht in de vectorbackbon...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A new generation of full touch screen gradient PCR instrument	LongGene	A200	Doelgenamplificatie
AscI restrictie-enzymen	New England Biolabs	R0558V	Snijden van doelvectoren
BbsI restrictie-enzym	New England Biolabs	R0539S	Snijden van doelvectoren
Schone werkbank	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	Een gedeeltelijk zuiveringsapparaat in de vorm van een verticale laminare stroom, die een lokale hoog schone lucht omgeving creëert
DH5α Competente cellen	TaKaRa	K613	Transformatie van plasmidevector
Dual-Luciferas Reporter Assay System	Promega	E1910	Dual-luciferase reporter assay
Elektrisch thermostaat waterbad	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Verwarmen van reagens door constante temperatuur in waterbad
Elektroforese	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Regel spanning, stroom, enz.
Eppendorf Reference 2	Eppendorf China Ltd.	Reference 2	Accuraat tekenen en overbrengen van vloeistofsporen
Gel beeldanalyser	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	Voor de analyse van elektroforese gel beelden
GloMax 20/20 Luminometer	Promega	E5311	Dual luciferase activiteit detecteren
Hoge snelheid gekoelde centrifuge	BMH	sigma 3K15	Nucleinzuur extractie en zuivering
Intelligente biochemische incubator	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Zorgen voor een geschikte temperatuur omgeving voor het enzymdigestie experiment
LB Broth Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	Voor de cultivatie van E.coli
Lipofectamine 3000 Transfectie Reagens Kit	Thermo Fisher	L3000015	DNA Transfectie
SalI restrictie-enzymen	New England Biolabs	R3138V	Snijden van doelvectoren
SanPrep Column DNA Gel Extractie Kit	Sangon Biotech	B518131-0050	Recycling DNA fragmenten
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit	Sangon Biotech	B518191-0100	Extractie van plasmide DNA
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202V	DNA fragment verbinden
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Zuivering Kit Ver.4.0	TaKaRa	9761	DNA zuivering
Verticale druk stoomsterilisator	JIBIMED	LS-50LD	Hoge temperatuur en autoclaaf om bacteriën, schimmels en andere micro-organismen in laboratoriumapparatuur te doden
Waterbad thermostaat	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	SHZ-82	Laat de bacteriën blijven schudden, wat goed is voor contact met lucht.