Bouw van CRISPR Plasmids en detectie van knock-out efficiëntie in zoogdiercellen door middel van een Dual Luciferase Reporter System

Summary

Hier presenteren we een protocol dat een gestroomlijnde methode beschrijft voor het efficiënt genereren van plasmiden die zowel het CRISPR-enzym als het bijbehorende single guide RNA (sgRNAs) uitdrukken. Co-transfectie van zoogdiercellen met deze sgRNA / CRISPR vector en een dubbele luciferase reporter vector die dubbelstreng breuk reparatie onderzoekt maakt evaluatie van knock-out efficiëntie.

Abstract

Hoewel zeer efficiënt, wijziging van een genomic site door de CRISPR enzym vereist de generatie van een sgRNA uniek voor de doelsite (s) vooraf. Dit werk beschrijft de belangrijkste stappen die leiden tot de bouw van efficiënte sgRNA-vectoren met behulp van een strategie die het mogelijk maakt de positieve kolonies efficiënt te detecteren door PCR voorafgaand aan DNA-sequencing. Aangezien een efficiënte genoombewerking met behulp van het CRISPR-systeem een zeer efficiënte sgRNA vereist, is een voorselectie van kandidaat-sgRNA-doelen noodzakelijk om tijd en moeite te besparen. Een dubbele luciferase reporter systeem is ontwikkeld om knock-out efficiëntie te evalueren door het onderzoeken van double-strand break reparatie via single strand annealing. Hier gebruiken we dit reportersysteem om het gewenste xCas9/sgRNA-doel op te pikken van kandidaat-sgRNA-vectoren voor specifieke genbewerking. Het geschetste protocol biedt binnen 10 dagen een voorkeur sgRNA/CRISPR enzymvector (te beginnen met de juiste ontworpen oligonucleotiden).

Introduction

De CRISPR sgRNAs bestaan uit een 20-nucleotide sequentie (de protospacer), die complementair is aan de genomische doelvolgorde^1,2. Hoewel zeer efficiënt, vereist het vermogen van het CRISPR/Cas-systeem om een bepaalde genomische site te wijzigen de generatie van een vector die een efficiënte sgRNA draagt die uniek is voor de doellocatie(s)². Dit artikel beschrijft de belangrijkste stappen in het genereren van die sgRNA-vector.

Voor succesvolle genoombewerking met behulp van het CRISPR/Cas-systeem is het gebruik van zeer efficiënte sgRNAs een cruciale voorwaar....

Protocol

1. sgRNA oligonucleotide ontwerp

1. Ontwerp sgRNAs met behulp van online tools zoals de Cas-Designer online tool (http://www.rgenome.net/cas-designer/). De PAM-sequentie is belangrijk op basis van de Cas9 die wordt gebruikt. Voor xCas9 zijn de relevante PAM-sequenties NG en kan de voormalige verwezen Cas-Designer online tool xCas9 relevante sgRNAS genereren.
   1. Gebruik sgRNA-ontwerptools die algoritmen omvatten voor on- en off-target voorspelling (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)¹¹. Een score van 0,2 of hoger heeft de voorkeur.
2. Selecteer maximaal 3 genbewerkingsdoelen voor....

Results

De in dit protocol beschreven methoden zijn voor de bouw van sgRNA- en xCas9-expressievectoren en vervolgens voor de optimalisatiescreening van sgRNA-oligo's met relatief hogere gentargeting-efficiëntie. Hier tonen we een representatief voorbeeld van 3 sgRNA doelen aan schapen DKK2 exon 1. SgRNA en xCas9 uitdrukken vectoren kunnen worden gebouwd door het voorverteren van de vector ruggengraat (Figuur 2) gevolgd door het ligating in een reeks van korte double-streng DNA fragmenten do.......

Discussion

De sgRNA vector klonen procedures die we hier hebben beschreven vergemakkelijkt een efficiënte productie van sgRNAs, met de meeste van de kosten afgeleid van de oligonucleotide bestellen en vector sequencing. Hoewel de geschetste methode is ontworpen om gebruikers in staat te stellen sgRNAs te genereren voor gebruik met CRISPR/Cas9, kan het protocol eenvoudig worden aangepast voor gebruik met Cas9-orthologues of andere RNA-geleide endonucleases zoals Cpf1, waarbij kleine wijzigingen worden aangebracht in de vectorbackbon.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A new generation of full touch screen gradient PCR instrument	LongGene	A200	Target gene amplification
AscI restriction enzymes	New England Biolabs	R0558V	Cutting target vectors
BbsI restriction enzyme	New England Biolabs	R0539S	Cutting target vectors
Clean workbench	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment
DH5α Competent Cells	TaKaRa	K613	Plasmid vector transformation
Dual-Luciferas Reporter Assay System	Promega	E1910	Dual-luciferas reporter assay
Electric thermostatic water bath	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Heating reagent by constant temperature in water bath
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Control voltage, current, etc.
Eppendorf Reference 2	Eppendorf China Ltd.	Reference 2	Accurately draw and transfer traces of liquid
Gel imaging analyzer	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	For the analysis of electrophoresis gel images
GloMax 20/20 Luminometer	Promega	E5311	Detect dual luciferase activity
High speed refrigerated centrifuge	BMH	sigma 3K15	Nucleic acid extraction and purification
Intelligent biochemical incubator	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment
LB Broth Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	For the cultivation of E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit	Thermo Fisher	L3000015	DNA Transfection
SalI restriction enzymes	New England Biolabs	R3138V	Cutting target vectors
SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit	Sangon Biotech	B518131-0050	Recycling DNA fragments
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit	Sangon Biotech	B518191-0100	Extraction of plasmid DNA
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202V	Link DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0	TaKaRa	9761	DNA purification
Vertical pressure steam sterilizer	JIBIMED	LS-50LD	High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment
Water bath thermostat	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	SHZ-82	Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.