Methodenartikel

Een semi-kwantitatieve drug affiniteit responsieve doel stabiliteit (DARTS) assay voor het bestuderen van Rapamycine/mTOR interactie

DOI:

10.3791/59656

⸱

27 augustus 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center, 2Department of Cell Biology, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie hebben we de mogelijkheden voor gegevensanalyse van het DARTS experiment verbeterd door de veranderingen in de eiwit stabiliteit te monitoren en de affiniteit van eiwit-ligand interacties te schatten. De interacties kunnen in twee krommen worden uitgezet: een Proteolytische curve en een Dosisafhankelijkheid. We hebben mTOR-rapamycine interactie gebruikt als een voorbeeldige zaak.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drug Affinity responsieve doel stabiliteit (DARTS) is een robuuste methode voor de detectie van nieuwe kleine molecuul eiwit targets. Het kan worden gebruikt om bekende kleine molecuul-eiwit interacties te controleren en om potentiële eiwit doelen voor natuurlijke producten te vinden. In vergelijking met andere methodes gebruikt DARTS native, ongewijzigde, kleine moleculen en is eenvoudig en eenvoudig te bedienen. In deze studie hebben we de mogelijkheden voor gegevensanalyse van het DARTS experiment verder verbeterd door de veranderingen in de eiwit stabiliteit te monitoren en de affiniteit van eiwit-ligand interacties te schatten. De eiwit-ligand interacties kunnen in twee krommen worden uitgezet: een Proteolytische curve en een dosis-afhankings curve. We hebben de interactie mTOR-rapamycine gebruikt als een voorbeeldige Case voor de totstandkoming van ons protocol. Uit de Proteolytische curve zagen we dat de proteolyse van mTOR door pronase werd geremd door de aanwezigheid van rapamycine. De dosis-afhankelijkheids curve stelde ons in staat om de bindingsaffiniteit van rapamycine en mTOR te schatten. Deze methode is waarschijnlijk een krachtige en eenvoudige methode voor het nauwkeurig identificeren van nieuwe doel eiwitten en voor de optimalisatie van de betrokkenheid van het doel van de drug.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificeren van kleine molecule doelwit eiwitten is essentieel voor het mechanistische begrip en de ontwikkeling van potentiële therapeutische geneesmiddelen1,2,3. Affiniteits chromatografie, als een klassieke methode voor het identificeren van de doel eiwitten van kleine moleculen, heeft goede resultaten opgeleverd4,5. Echter, deze methode heeft beperkingen, in die chemische modificatie van kleine moleculen resulteert vaak in verminderde of veranderde bindende specificiteit of affiniteit. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn onlangs verschillende nieuwe strategieën ontwikkeld en toegepast om de kleine molecuul doelen te identificeren zonder chemische modificatie van de kleine moleculen. Deze directe methoden voor de identificatie van het label vrij kleine moleculen omvatten responsieve doel stabiliteit (DARTS)6, stabiliteit van eiwitten uit oxidatiemiddelen (sprox)7, cellulaire thermische verschuiving assay (cetsa)8 ,9, en thermische Proteoom profilering (TPP)10. Deze methoden zijn zeer voordelig omdat ze natuurlijke, ongewijzigde kleine moleculen gebruiken en alleen op directe bindende interacties vertrouwen om doel eiwitten11te vinden.

Onder deze nieuwe methoden, darts is een relatief eenvoudige methodologie die gemakkelijk kan worden overgenomen door de meeste Labs12,13. DARTS is afhankelijk van het concept dat ligand-gebonden eiwitten een gemodificeerde gevoeligheid voor enzymatische afbraak ten opzichte van ongebonden eiwitten aantonen. Het nieuwe doeleiwit kan worden gedetecteerd door onderzoek van de veranderde band in SDS-PAGE gel door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS/MS). Deze aanpak is met succes geïmplementeerd voor de identificatie van eerder onbekende doelwitten van natuurlijke producten en geneesmiddelen14,15,16,17,18, 19. het is ook krachtig als middel om te schermen of te valideren binding van verbindingen met een specifiek eiwit20,21. In deze studie presenteren we een verbetering van het experiment door het monitoren van de veranderingen in de eiwit stabiliteit met kleine moleculen en het identificeren van eiwit-ligand bindende verwantschappen. We gebruiken mTOR-rapamycine interactie als voorbeeld om onze aanpak te demonstreren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Verzamel en lyse cellen

  1. Groeien 293T cellen met behulp van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum, 2 mM glutamine en 1% antibiotica. Incuberen culturen bij 37 °C onder 5% CO2.
    Opmerking: de groei toestand van de cellen kan de stabiliteit van volgende experimenten beïnvloeden.
  2. Vouw cellen in cultuur tot 80 \ u201290% samenvloeiing bereikt.
  3. Meng 345 μL cellysisreagens (Zie de tabel met materialen) met 25 μl van een cocktail van 20 x proteaseremmers, 25 μl Natriumfluoride van 1 M, 50 μl van 100 mm β-glycerine fosfaat, 50 μl 50 mm natrium pyrofosfaat en 5 μl 200 mm natrium orthovanadaat. Houd de lysisbuffer gekoeld op ijs.
    Opmerking: andere lysisbuffers met verschillende detergenten (bijv. Triton X-100 of NP-40) kunnen met DARTS worden gebruikt zolang ze niet denaturering zijn. Membraan eiwitten of nucleaire eiwitten kunnen worden geëxtraheerd door 0,4% Triton X-100 of 0,4% NP-40 toe te voegen aan het cellysaat.
  4. Was de cellen tweemaal met Cold fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
  5. Gebruik een celscraper om de cellen in een geschikte hoeveelheid cellysisbuffer te verzamelen en breng de lyserende cellen over in een tube van 1,5 mL.
    Opmerking: het aantal cellen dat nodig is voor elk DARTS experiment varieert afhankelijk van hoeveel eiwitten uit verschillende cellijnen kunnen worden geëxtraheerd. In het algemeen is de eiwitconcentratie van het gebruikte lysaat tussen 4 \ u20126 μg/μL. 1 10 cm plaat van 293T cellen bij 85 \ u201290% confluency, gelyseerd met 300 μL lysisbuffer resulteert meestal in een lysaat met een eiwitconcentratie van ~ 5 μg/μL.
  6. Meng de lysisbuffer/lyserende cellen goed en inbroed de buis op ijs gedurende 10 minuten.
  7. Centrifugeer de buis bij 18.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
  8. Breng het supernatant over in een nieuwe buis van 1,5 mL en houd gekoeld op ijs.
  9. Voer een BCA-test uit om de eiwitconcentratie van lysaten te benaderen.

2. incuberen eiwithoudende lysaten met de kleine molecule

  1. Verdeel 99 μL van de lysaten in twee buisjes van 1,5 mL.
  2. Maak een beginvoorraad concentratie van 10 mM klein molecuul. Bij het uitvoeren van DARTS kan men beginnen met een hogere concentratie van het kleine molecuul (5 \ u201210x de EC50-waarde) om een optimale binding te garanderen.
    1. Voeg 1 μL oplosmiddel toe dat het kleine molecuul oplosbaar is in of 1 μL kleine molecuul voorraadoplossingen voor elk aliquot lysaat. Incuberen cellysaat met de oplossingen voor 30 \ u201260 min bij kamertemperatuur met schudden.
  3. Op ijs, seriële verdunningen (1:200, 1:400, 1:800 en 1:1600) van de vers ontdooide pronase-oplossing in 1x TNC (voor 1 mL 10x TNC-buffer, Meng 300 μL ultrapuur water met 100 μL van 5 M natriumchloride, 100 μL van 1 M calciumchloride en 500 μL van 1 M Tris-HCl, pH 8,0).
  4. Bestudeer een breed scala aan pronase: eiwit verhoudingen (bijvoorbeeld van 1:100 tot 1:2000) om de observabiliteit van het Step-Wise effect van pronase op doel (en) te garanderen.
    NB: om de pronase concentraties te berekenen (voorbeeld): 5 μg/μL eiwitconcentratie x 20 μL monster = 100 μg eiwit. Voor een pronase: eiwit ratio van 1:100 hebben we 0,5 μg/μL (100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL) oplossing nodig. Dit experiment moet mogelijk meerdere malen worden herhaald om een geschikt bereik van pronase te verkrijgen: eiwit verhoudingen.

3. proteolyse uitvoeren

Opmerking: voor proteolyse worden de stappen bij kamertemperatuur uitgevoerd, tenzij anders vermeld

  1. Verdeel elk aliquot na incubatie met het kleine molecuul in 20 μL monsters.
  2. Voeg met specifieke intervallen (elke 30 s) 2 μL van het bereik van de pronase-oplossingen in elk monster toe. Gebruik een gelijk volume van 1x TNC-buffer om een niet-verteerd controlemonster vast te stellen.
  3. Na 5 \ u201220 min, stoppen met de spijsvertering via toevoeging van 2 μL koude 20x proteaseremmers cocktail elke 30 s. Meng goed en incuberen op ijs gedurende 10 minuten.
  4. Verdun monsters met het juiste volume van 5x SDS-PAGE laad buffer en kook gedurende 5 minuten bij 95 °C.
  5. Voer het volgende deel van het experiment uit of bewaar het eiwit monster bij − 80 °C.

4. kwantificering en analyse

  1. Voer na het DARTEN Coomassie Blue-kleuring uit volgens het eerder gepubliceerde protocol22.
  2. De gebrandschilderd eiwit bands moeten zeer duidelijk na ontkleuring. Giet de gebruikte laat oplossing en voeg verse 1% azijnzuur oplossing toe om de gel te bedekken. Plaats de gel onder het licht om de banden te observeren met significante verschillen tussen groepen met (monstergroep) of zonder (controlegroep) de kleine molecule.
  3. Snijd de twee corresponderende banden uit de gel met een steriel instrument en voer LC-MS/MS onmiddellijk uit.
    Opmerking: LC-MS/MS moet zo snel mogelijk worden gedaan, omdat de eiwitten in de gel continu afnemen.
  4. Verdubbel de bands, extract peptiden en voer LC-MS/MS-analyse23uit.
    1. Om LC-MS/MS-gegevens te analyseren, moet u eerst alle eiwitten in de individuele band identificeren. Ten tweede, gebruik Peptide spectrum match (PSM) om de overvloed van elk eiwit te vertegenwoordigen.
      Opmerking: het PSM biedt het totale aantal geïdentificeerde peptide sequenties voor het eiwit, met inbegrip van die redundant geïdentificeerd. In het algemeen, hoe vaak een peptide wordt geïdentificeerd/gesequenced kan worden gebruikt als een ruwe schatting van hoe overvloedig het eiwit in het monster. Eiwitten die zijn verrijkt in de monstergroep over de controlegroep zijn eiwitten van belang.
  5. De primaire antilichamen van de geselecteerde eiwitten aanschaffen. Voer Western Blot uit om te controleren of het kleine molecuul direct kan binden aan de potentiële doel eiwitten24.
    1. Laad gelijke hoeveelheden eiwitten in de putjes van een 8% SDS-PAGE gel, samen met een geschikte moleculair gewicht marker. Voer de gel gedurende 30 minuten uit op 80 V, stel de spanning in op 120 V en ga verder met 1 \ u20122 h.
  6. Kwantificeer de verschillende doel proteïne-bands met behulp van beeldverwerkings-en analyse software (Zie de tabel met materialen).
  7. Analyseer de gegevens en teken de curven.
    1. Bepaling van de Proteolytische curve voor een doel proteïne
      1. De pronase: eiwit verhouding is gevarieerd bij het uitvoeren van proteolyse. Normaliseer gegevens uit beeldanalyse door de band intensiteitswaarden te schrijven die overeenkomen met de niet-verteerde banden tot 100%.
      2. Gebruik niet-lineaire regressieanalyse van de statistische analyse en tekensoftware om een curve van genormaliseerde gegevens te tekenen voor de relatieve band intensiteit en pronase: eiwit verhoudingen.
      3. Open eerst de software, selecteer het type tabel en grafiek als XY en laat 3 waarden repliceren in Side-by-side subkolommen. Voer vervolgens de corresponderende gegevens in de ruimte onder x en y in. Onder x, voer de getallen 0, 1, 2, 3, 4, 5 (als plaats houders overeenkomstige pronase: eiwit verhoudingen).
      4. Voer in de kolom y de genormaliseerde gegevens voor relatieve band intensiteiten in. Voer "niet-lineaire regressie" uit en implementeer een "dosis-respons-stimulatie" met behulp van de vergelijking "log (agonist) versus respons — variabele helling (vier parameters)".
      5. Converteer de annotaties van de X-as in de curve naar de corresponderende pronase: eiwit verhoudingen.
    2. Bepaling van de dosis-afhankelijkheid curve voor een doel proteïne
      Opmerking: voor de dosis-afhankelijkheid analyse, de molariteit van het kleine molecuul is verschafeld over monsters. De stabiele pronase: eiwit verhouding moet worden geïnformeerd door analyse van de proteolyse gegevens. De pronase: eiwit ratio die gedurende de Proteolytische curve een maximaal verschil in doel proteïne-intensiteit vertoonde, moet worden gebruikt voor het dosis-afhankelijkheid experiment.
      1. Kwantificeer de verschillende doel proteïne-bands met behulp van een beeldanalyse software. Als in de generatie van de curve van de dosis-afhankelijkheid, normaliseren van gegevens uit beeldanalyse door het toeschrijven van de band intensiteit waarden overeenkomt met de minst verteerde band tot 100%.
      2. De niet-lineaire regressieanalyse in de statistische analyse en tekensoftware toepassen op de genormaliseerde gegevens. Open eerst de software, selecteer het type tabel en grafiek als XY, en voer 3 repliceer-waarden in naast elkaar subkolommen.
      3. Voer vervolgens de corresponderende gegevens in de ruimte onder x en y in. Voor de variabele ' x ', input verschillende concentraties van de kleine molecule; ' y ' bevat de corresponderende genormaliseerde gegevens voor de relatieve band intensiteit.
      4. Transformeer x-waarden met behulp van X = log (X). Gebruik ten slotte niet-lineaire regressie en implementeer een dosis-respons stimulatie met behulp van de vergelijking ' log (agonist) versus respons — variabele helling (vier parameters) '.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het stroomschema van het experiment wordt beschreven in Figuur 1. Het resultaat van Coomassie Blue-kleuring wordt weergegeven in Figuur 2. Incubatie met het kleine molecuul verleent bescherming tegen proteolyse. Drie bands die lijken te worden beschermd door incubatie met rapamycine over de controle van het voertuig worden gevonden. De verwachte resultaten van het Proteolytische curve-experiment worden weergegeven in Figuur 3. Als b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DARTS maakt het mogelijk om kleine molecuul doelen te identificeren door het beschermende effect van eiwitbinding tegen afbraak te benutten. DARTS vereist geen chemische modificatie of immobilisatie van het kleine molecuul26. Hierdoor kunnen kleine moleculen worden gebruikt om hun directe bindende eiwit doelen te bepalen. Standaard beoordelingscriteria voor de klassieke Darts methode zijn onder meer gelkleuring, massaspectrometrie en Western blotting12,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd deels gesteund door NIH Research Grants R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, en een DOD Research Grant W81XWH-16-1-0482.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100X Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340Verdunn tot 20X met ultrapuur water
293T cellijnATCCCRL-3216DMEM medium met 10% FBS
AzijnzuurSigma-AldrichA6283
BCA Protein Assay KitThermo Fisher23225
CalciumchlorideSigma-AldrichC1016
Cell scraperThermo Fisher179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining SolutionBio-Rad1610436
Dimethylsulfoxide(DMSO)Sigma-AldrichD2650
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersie 6.0statistische analyse- en tekensoftware
ZoutzuurSigma-AldrichH1758
ImageJNational Institutes of HealthVersie 1.52beeldverwerkings- en analysesoftware
M-PER Cell Lysis ReagentThermo Fisher78501
Fosfaatbuffer met zout (PBS)CorningR21-040-CV
PronaseRochePRON-RO10 mg/ml
NatriumchlorideSigma-AldrichS7653
NatriumfluorideSigma-AldrichS7920
NatriumorthovanadateSigma-Aldrich450243
NatriumpyrofosfaatSigma-Aldrich221368
Trizma baseSigma-AldrichT1503aanpassen tot pH 8,0
β-glycerofosfaatSigma-AldrichG9422

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
  2. O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
  3. McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
  4. Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
  5. Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
  6. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  7. Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
  8. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  9. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  10. Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784(2014).
  11. Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
  12. Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
  13. Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
  14. Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454(2018).
  15. Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438(2018).
  16. Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
  17. Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
  18. Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
  19. Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
  20. Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
  21. Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
  22. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  23. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  24. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
  25. Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
  26. Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
  27. Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
  28. Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EiwitstabiliteitProteolytische curveDosis responscurvemTOR rapamycine interactieWestern blotBCA assayPronase digestieCellyseSDS PAGE gel

Gerelateerde artikelen