Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

Samenvatting

Interacties van transcriptiefactoren (TFs) met de RNA-polymerase worden meestal bestudeerd met behulp van keuze assays. We passen een Biolayer interferometrie (BLI) technologie toe om de interactie van GrgA met de chlamydiale RNA-polymerase te karakteriseren. Vergeleken met keuze assays, bli detecteert real-time associatie en dissociatie, biedt een hogere gevoeligheid, en is zeer kwantitatief.

Samenvatting

Een transcriptiefactor (TF) is een eiwit dat de genexpressie reguleert door interactie met de RNA-polymerase, een andere TF-en/of template-DNA. Grga is een roman transcriptie Activator die specifiek is gevonden in de verplicht intracellulaire bacteriële pathogeen chlamydia. Eiwit keuze assays met behulp van affiniteits kralen hebben aangetoond dat grga bindt twee σ factoren, namelijk σ⁶⁶ en σ²⁸, die verschillende sets van promoters voor genen waarvan de producten zijn differentieel vereist in ontwikkelingsstadia te erkennen. We hebben BLI gebruikt om de interacties te bevestigen en verder te karakteriseren. Bli toont verschillende voordelen ten opzichte van keuze: 1) het onthult real-time associatie en dissociatie tussen bindende partners, 2) het genereert kwantitatieve kinetische parameters, en 3) het kan bindingen detecteren die keuze assays vaak niet detecteren. Deze kenmerken hebben ons in staat gemaakt om de fysiologische rollen van GrgA in genexpressie regulering in Chlamydiaen mogelijke gedetailleerde interactie mechanismen te afleiden. We voor ogen dat deze relatief betaalbare technologie kan zeer nuttig zijn voor het bestuderen van transcriptie en andere biologische processen.

Inleiding

Transcriptie, die RNA moleculen produceert met behulp van DNA als template, is de allereerste stap van genexpressie. Bacteriële RNA-synthese begint na de binding van het RNA polymerase (rnap) holoenzym aan een doel promotor^1,2. Het RNAP-holoenzym (RNAPholo) bestaat uit een katalytische kern met meerdere subeenheden (RNAPcore) en een σ-factor, die nodig is voor het herkennen van de volgorde van de organisator. Transcriptie Activators en repressors, gezamenlijk genoemd TFs, reguleren de genexpressie door de bindende componenten van de RNAPcore, σ factoren, en/of DNA. Afhankelijk van het organisme kan een aanzienlijk deel van het genoom worden gewijd aan TFs die transcriptie reguleren in reactie op fysiologische behoeften en omgevings aanwijzingen³.

Chlamydia is een verplicht intracellulaire bacterie die verantwoordelijk is voor een verscheidenheid aan ziekten bij mensen en dieren^4,5,6,7,8. Chlamydia trachomatis is bijvoorbeeld aantoonbaar het nummer één seksueel overdraagbare pathogeen bij mensenwereld wijd, en een leidende oorzaak van blindheid in sommige onderontwikkelde landen^4,5. Chlamydia heeft een unieke ontwikkelingscyclus die wordt gekenmerkt door twee alternerende cellulaire vormen die het elementaire lichaam (EB) en Reticulate Body (RB)⁹worden genoemd. Terwijl EBs in een extracellulaire omgeving kan overleven, zijn ze niet in staat tot proliferatie. EBs Voer cellen in door middel van endocytose en differentiëren in grotere RBs in een vacuole in het host cytoplasma binnen uur na inoculatie. Niet langer infectieuze, RBs prolifereren door binaire splijting. Rond 20 h, ze beginnen te differentiëren terug naar de EBs, die de gastheer cellen rond 30-70 h verlaten.

Progressie van de chlamydiale ontwikkelingscyclus wordt gereguleerd door transcriptie. Overwegende dat een overgrote meerderheid van de bijna 1.000 chlamydiale genen wordt uitgedrukt tijdens de midcyclus waarin RBs actief repliceert, slechts een klein aantal genen wordt direct na de invoer van EBs in de gastheer cellen getranscribeerd om de omzetting van EBs in RBs, en een andere kleine reeks genen worden getranscribeerd of steeds getranscribeerd om de differentiatie van RBs in EBs^10,11mogelijk te maken.

Het chlamydiale genoom codeert drie σ-factoren, namelijk σ⁶⁶, σ²⁸ en σ⁵⁴. σ⁶⁶, die gelijkwaardig is aan de huishoudservice σ⁷⁰ van E. coli en andere bacteriën, is verantwoordelijk voor het herkennen van promotors van vroege en mid-Cycle genen en sommige late genen, terwijl σ²⁸ en σ⁵⁴ nodig zijn voor de transcriptie van bepaalde late genen. Er zijn verschillende genen waarvan bekend is dat ze zowel een σ⁶⁶-afhankelijke promotor als een σ²⁸-afhankelijke promotor¹²dragen.

Ondanks een ingewikkelde ontwikkelingscyclus is er slechts een klein aantal TFs gevonden in Chlamydiae¹³. GrgA (eerder geannoleerd als een hypothetisch proteïne CT504 in c. trachomatis Serovar D en CTL0766 in c. trachomatis L2) is een Chlamydia-specifieke TF die aanvankelijk wordt herkend als een activator van σ⁶⁶-afhankelijke genen¹⁴. Affiniteit keuze assays hebben aangetoond dat grga hun transcriptie activeert door zowel σ⁶⁶ als DNA te binden. Interessant is dat het later werd gevonden met die GrgA ook co-precipiteert met σ²⁸, en activeert transcriptie van σ²⁸-afhankelijke promotors in vitro¹⁵. Om te onderzoeken of GrgA vergelijkbare of verschillende affiniteiten heeft voor σ⁶⁶ en σ²⁸, hebben we gebruik gemaakt van bli. BLI assays hebben aangetoond dat GrgA samenwerkt met σ⁶⁶ met een 30-voudige hogere affiniteit dan met σ²⁸, wat suggereert dat grga differentiële rollen kan spelen in σ⁶⁶-afhankelijke transcriptie en σ²⁸-afhankelijke transcriptie ¹⁵.

BLI detecteert het interferentiepatroon van wit licht dat reflecteert van een laag geïmmobiliseerd eiwit op de punt van een biosensor en vergelijkt het met die van een interne referentielaag¹⁶. Door de analyse van deze twee interferentie patronen kan BLI waardevolle en real-time informatie verschaffen over de hoeveelheid eiwit gebonden aan de punt van de biosensor. Het eiwit dat wordt geïmmobiliseerd tot de punt van de biosensor wordt aangeduid als de ligand, en is over het algemeen geïmmobiliseerd met behulp van een gemeenschappelijk antilichaam of epitoop tag (bijvoorbeeld, een poly-his-of Biotine-tag) die affiniteit heeft voor een bijbehorend deeltje (zoals NTA of Streptavidine) op de punt van de biosensor. De binding van een secundair eiwit, aangeduid als de analyt, met de ligand aan de punt van de biosensor creëert veranderingen in de ondoorzichtigheid van de biosensor en resulteert daarom in veranderingen in interferentie patronen. Indien herhaald over verschillende concentraties van de analyt, kan BLI niet alleen kwalitatieve, maar ook kwantitatieve informatie verschaffen over de affiniteit tussen de ligand en de analyt¹⁶.

Naar het beste van onze kennis, waren we de eersten die BLI gebruiken om eiwit-eiwit interacties te karakteriseren in transcriptie¹⁵. In deze publicatie tonen we aan dat een GrgA-fragment, dat voorheen vereist was voor σ²⁸-binding, inderdaad de binding bemiddelt. Dit manuscript richt zich op stappen van de BLI-assays en het genereren van BLI-grafieken en parameters van bindende kinetiek. Methoden voor de productie (en zuivering) van liganden en analyten worden hier niet behandeld.

Protocol

1. bereiding van eiwitten

1. Gebruik een dialyse zakje (met een passende cut-off maat) om elk eiwit te gebruiken dat moet worden gebruikt voor BLI-assays (inclusief de zijn-gelabelde ligand en de analyt) tegen 1.000 volumes van de BLI-buffer (25 mM tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl₂ , 0,1 mM DTT, pH 8,0, voorgekoeld tot 4 °C) bij 4 °C gedurende 4 uur.
   Opmerking: BLI assays vereisen dat de ligand aanwezig is bij concentraties die de bindingsplaatsen op de biosensor en de analyt verzachtend zijn om zeer gezuiverd te worden, zodat de molaire concentraties van de analyt die met de ligand reageren bekend zijn. Methodologieën voor de expressie en zuivering van zijn-en STREP-gelabelde eiwitten worden hier niet behandeld, maar zijn te vinden in eerdere publicaties^14,15. Hoewel dit systeem niet vereist dat de ligand zich in zeer gezuiverde vorm bevindt, is het essentieel om zelfs ongezuiverde liganden naar de BLI-buffer te dialyseren om verschuivingen in witte-licht interferentie patronen te minimaliseren die worden veroorzaakt door buffer veranderingen tijdens de test.
2. Schakel over naar de verse BLI-buffer en ga verder met de dialyse voor nog eens 4 uur.

2. biosensor hydratatie en testopstelling

1. Pipetteer ongeveer 10 minuten vóór het begin van een test de BLI-buffer met 200 μL in een PCR-buis.
2. Verwijder een ni-NTA-biosensor uit de originele verpakking door het brede deel van de biosensor met een hand gehandschoven te houden.
3. Plaats de biosensor over de PCR-buis zodanig dat alleen het glazen uiteinde van de biosensor wordt ondergedompeld in de BLI-buffer.
4. Houd de biosensortip ten minste 10 minuten ondergedompeld om volledige hydratatie te garanderen.
   1. Controleer of de glazen punt van de ni-NTA-biosensor tijdens de bovenstaande stap niets anders dan de BLI-buffer raakt.
      Opmerking: dit protocol maakt gebruik van een ni-NTA-biosensor in combinatie met een ligand met zijn tags. Indien nodig kan een SA-streptavidin-biosensor worden gebruikt in combinatie met een biotinyleerd ligand in plaats daarvan als: (i) zowel de ligand als de analyt dragen een zijn tag of (II) geen van beide doet.
5. Schakel de BLItz-machine in.
6. Zorg ervoor dat het apparaat is aangesloten op de computer via een USB-poort voor gegevensuitvoer aan de achterzijde van het apparaat.
7. Open de bijbehorende software (bijvoorbeeld BLItz Pro) op de computer en klik op Geavanceerde kinetiek aan de linkerkant van het scherm.
8. Op de software, typt u alle relevante informatie over het experiment (met inbegrip van de naam van het experiment, beschrijving, monster-ID en eiwitconcentratie) onder elke respectieve kop.
9. Klik op type biosensor en kies ni-NTA in het vervolgkeuzemenu.
   1. Controleer onder de kop instellingen uitvoeren of de Shaker is ingesteld op inschakelen.
   2. Onder de kop van de stap type , controleert u of er 5 items in de lijst: initiële basislijn, laden, basislijn, koppeling en dissociatie.
      Opmerking: de duur van elke stap kan worden gewijzigd van standaard indien nodig. Gebruik voor optimale resultaten minimaal 30 sec. voor initiële baseline en Baseline; en 120 s voor vereniging en dissociatie. De duur van de laad stap (variërend van 120 tot 240 s) zal afhangen van de concentratie van de ligand en affiniteit van de his-epitope tag op de ligand aan de ni-NTA-biosensor.
10. Verwijder de gehydrateerde ni-NTA-biosensor uit de PCR-buis en bevestig deze aan de biosensor-bevestiging op de machine door het brede gedeelte van de biosensor op de steun te schuiven.
    Opmerking: laat de biosensor niet uitdrogen tijdens het experiment.
11. Plaats een zwarte microcentrifuge buis van 0,5 mL in de buis houder van de machine en Pipetteer 400 μL van de BLI-buffer erin.
12. Controleer of de schuifregelaar van de machine zodanig is geplaatst dat de buis houder zich voor de zwarte pijl op het apparaat bevindt.
13. Sluit de afdekking van de machine zodanig dat de punt van de biosensor in de buffer in de microcentrifuge buis wordt ondergedompeld.
14. Klik op volgende op de software om te beginnen met het opnemen van de initiële basislijn.

3. laden van ligand op biosensor

1. Nadat de eerste basislijn stap klaar is met opnemen, opent u de cover van de machine.
2. Verplaats de schuifregelaar naar rechts zodat de druppel houder (in plaats van de buis houder) zich voor de zwarte pijl bevindt.
3. Pipetteer 4 μL van een gedialyseerde ligand (vanaf stap 1,1) op de druppel houder en sluit de afdekking van de machine.
   Opmerking: de optimale concentratie van de te gebruiken ligand kan per eiwit verschillen. Een concentratie tussen 1,0 en 2,0 mg/mL is meestal voldoende om de NTA te verzaderen bij de punt van de biosensor in 240 s.
4. Klik op de software op volgende om te beginnen met laden.

4. extra ligand wegspoelen

1. Nadat de laad stap klaar is met opnemen, opent u de cover van de machine.
2. Verplaats de schuifregelaar naar links zodat de buis houder opnieuw voor de zwarte pijl ligt.
3. Sluit de deksel van de machine en zorg ervoor dat de punt van de biosensor wordt ondergedompeld in de BLI-buffer van de buis in de buis houder.
4. Klik nogmaals op volgende op de software om te beginnen met het opnemen van de basislijn.

5. vereniging van analyt aan ligand

1. Nadat de basislijn stap klaar is met opnemen, opent u de cover van de machine.
2. Verwijder de druppel houder en reinig deze door elk eiwit te pipetteren en te spoelen met dubbel gedeïoniseerd water (ddH₂O) voor een totaal van 5 keer.
   1. Reinig het oppervlak van de druppel houder na het wassen met een tissue doekje.
3. Plaats de druppel houder terug op de machine.
4. Verplaats de schuifregelaar op de machine naar rechts, zodat de druppel houder zich weer voor de zwarte pijl bevindt.
5. Pipetteer 4 μL van een gedialyseerde analyt (vanaf stap 1,1) op de druppel houder en sluit de afdekking van de machine.
6. Klik op de software op volgende om de koppeling te starten.

6. dissociatie van de analyt van ligand

1. Nadat de koppelings stap klaar is met opnemen, opent u de cover van de machine.
2. Beweeg de schuifregelaar op de machine naar rechts, zodat de buis houder zich weer voor de zwarte pijl bevindt.
3. Klik op de software op volgende om te beginnen met dissociatie.
4. Nadat de dissociatie stap is voltooid, opent u de cover van de machine.
5. Verwijder de druppel houder en de buis houder.
6. Spoel beide met ddH₂O grondig af om elk eiwit weg te spoelen.
7. Verwijder de biosensor en gooi deze veilig weg.

7. herhaalde interacties met verschillende concentraties

1. Herhaal stap 2-7 voor hetzelfde ligand-analyt paar met verschillende analyt concentraties.
   Opmerking: de concentratie van de analyt moet mogelijk worden aangepast over verschillende runs voordat het verkrijgen van optimale resultaten. In onze ervaring is een ratio van 1:5:10 analyt concentraties, beginnend met 75 nM, meestal voldoende.

8. analyseren van de gegevens met behulp van de software

1. Zodra alle uitvoeringen zijn voltooid, slaat u de gegevens op de software op door te klikken op bestand en vervolgens experiment opslaan als aan de linkerkant van het scherm.
2. Selecteer stap correctie en fitting (1:1) onder de kop gegevens uitvoeren en klik op analyseren om kinetische gegevens te genereren.
3. Als u de kwantitatieve gegevens in een werkblad wilt uitpakken en grafieken wilt genereren, klikt u op exporteren naar CSV en slaat u de opgenomen gegevens op als CSV-bestand. Open het CSV-bestand met spreadsheet software.
   1. Om de associatie-en dissociatie kinetiek op de meest effectieve wijze weer te geven, verwijdert u alle plot punten vóór de basislijn stap en normaliseert u alle volgende plot punten van de uiteindelijke basislijnwaarde.

Resultaten

Via BLI assays hebben we eerder vastgesteld dat binding van GrgA aan σ²⁸ afhankelijk is van een middelste regio met 28 aminozuren (residuen 138-165) van grga¹⁵. Dienovereenkomstig, in vergelijking met N-terminaal zijn-Tagged volledige lengte GrgA (NH-GrgA), een GrgA verwijdering constructie ontbreekt deze regio (NH-GrgAΔ 138-165) had een verminderde associatie rate en een verhoogde dissociatie percentage, wat leidde tot een 3.000.000-fold verlies van de totale affiniteit (tabel ...

Discussie

Eiwit-eiwit interacties zijn cruciaal voor de regulering van transcriptie en andere biologische processen. Ze worden meestal bestudeerd via keuze assays. Hoewel keuze assays relatief eenvoudig uit te voeren zijn, zijn ze slecht kwantitatief en kunnen ze zwakke maar biologisch zinvolle interacties niet detecteren. In vergelijking, door het detecteren van real-time associatie en dissociatie tussen een ligand en een analyt, biedt BLI associatie-en dissociatie percentage constanten, evenals, algemene affiniteit.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BLItz machine	ForteBio	45-5000
Dialysis tubing cellulose membrane	MilliporeSigma	D9652
Dip and Read Ni-NTA biosensor tray	ForteBio	18-5101	Klaar-voor-gebruik Ni-NTA biosensoren voor poly-His-gelabelde Eiwitten
Drop holder	ForteBio	45-5004
PCR tubes (0.2 mL)	Thomas Scientific	CLS6571
Microcentrifuge tubes (black)	Thermo Fisher Scientific	03-391-166
Kimwipes	Thermo Fisher Scientific	06-666A
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
EDTA	MilliporeSigma	E6758
MgCl2	MilliporeSigma	M8266
NaCl	MilliporeSigma	S9888
Tris-HCl	GoldBio	T095100