Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker

Samenvatting

We tonen een methode voor obductie en dissectie van muizen prostaatkanker modellen, gericht op prostaat tumor dissectie. Een stap-voor-stap protocol voor het genereren van muis prostaat tumor organoïden wordt ook gepresenteerd.

Samenvatting

Methoden op basis van homologe recombinatie om genen te wijzigen hebben aanzienlijk bevorderd biologisch onderzoek. Genetisch gemanipuleerde Muismodellen (GEMMs) zijn een strenge methode om de ontwikkeling en ziekte van zoogdieren te bestuderen. Ons laboratorium heeft verschillende GEMMs van prostaatkanker (PCa) ontwikkeld die geen expressie van één of meerdere tumor suppressor genen hebben met behulp van het sitespecifieke CRE-loxP of systeem en een prostaat-specifieke promotor. In dit artikel beschrijven we onze methode voor obductie van deze PCa GEMMs, voornamelijk gericht op dissectie van muis prostaattumoren. Nieuwe methoden die de afgelopen tien jaar zijn ontwikkeld, hebben de cultuur van epitheel afgeleide cellen vergemakkelijkt om orgel systemen in vitro in drie dimensies te modelleren. We ook detail een 3D-cel cultuur methode voor het genereren van tumor organoïden van muis PCa GEMMs. Pre-klinisch kankeronderzoek is gedomineerd door 2D celcultuur en cellijn-afgeleide of patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is modellen. Deze methoden ontbreken tumor micro Environment, een beperking van het gebruik van deze technieken in pre-klinische studies. Gemms zijn fysiologisch relevant voor het begrijpen van tumorvorming en kanker progressie. Tumor organoïde cultuur is een in vitro modelsysteem dat tumor architectuur en cellineage kenmerken aan. Bovendien, 3D-celkweek methoden zorgen voor groei van normale cellen voor vergelijking met tumor celculturen, zelden mogelijk met behulp van 2D-celkweek technieken. In combinatie heeft het gebruik van GEMMs en 3D-celcultuur in preklinische studies het potentieel om ons begrip van Kankerbiologie te verbeteren.

Inleiding

Sinds de late jaren 1980, de mogelijkheid om genen te veranderen door homologe recombinatie heeft sterk gevorderd de studie van biologische systemen¹. Indusgebonden, weefsel-, of cel-specifieke promotor systemen en sitespecifieke recombinases, zoals CRE-loxp, heeft geavanceerde genetische studies door het faciliteren van controle over genetische modificaties zowel temporeel als ruimtelijk^{2,3, 4}. De combinatie van deze genetische strategieën heeft een breed scala aan experimentele modelsystemen^5,6,7gecreëerd.

Genetisch gemanipuleerde Muismodellen (GEMMs) zijn een integraal instrument om te beoordelen hoe individuele genen of groepen van genen van invloed zijn op de ontwikkeling en ziekte van zoogdieren. In preklinisch kankeronderzoek zijn GEMMs de meest fysiologisch relevante en rigoureuze methode om kankerontwikkeling, progressie en behandeling⁸te bestuderen. Ons laboratorium is gespecialiseerd in het genereren en karakteriseren van kanker GEMMs.

De hoogst gediagnosticeerde niet-cutane kanker onder mannen in de Verenigde Staten is prostaatkanker (PCa). De meerderheid van de patiënten met PCa heeft een ziekte met een laag risico en een hoge overlevingskans, maar de overlevingskansen dalen drastisch wanneer ziekte wordt gediagnosticeerd in gevorderde stadia of als gerichte hormonale therapie progressie induceert naar agressieve, niet-curabele PCa subtypen^9,10. Ons laboratorium heeft GEMMs ontwikkeld die gebruik maken van floxed allelen van één of meer tumor suppressor genen. Recombinatie en verlies van tumor suppressor genexpressie komt specifiek voor in de prostaat omdat we een transgen hebben geïntroduceerd met CRE of downstream van de probasin Promoter geactiveerd alleen in prostaat epitheelcellen^{11, 12}. we hebben ook onze gemms gefokt om een CRE reporter transgen genaamd MT/mg, die induceert tomaat fluorescerende eiwit expressie in cellen ontbreekt CRE en groene fluorescerende proteïne (GFP) expressie in cellen met CRE¹³. Terwijl de presentatie van deze methode en onze representatieve resultaten tonen GEMMs we studeren in ons laboratorium, dit protocol kan worden gebruikt voor het genereren van prostaatkanker organoïden van elke muismodel. Echter, zoals uitvoerig besproken in onze representatieve resultaten sectie, we hebben geconstateerd dat bepaalde tumor kenmerken zijn optimaal voor prostaatkanker organoïde generatie.

In het afgelopen decennium, nieuwe methoden voor het kweken van cellen uit weefsels van epitheliale oorsprong heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in ons vermogen om te modelleren orgel systemen in vitro^14,15. De term "3D-celcultuur" is toegeschreven aan de technieken die betrokken zijn bij het tot stand brengen en onderhouden van organoïden, die in het algemeen kunnen worden gedefinieerd als structuren die bestaan uit cellen die secundaire architectuur assembleren, aangestuurd door Orgaanspecifieke cellineage kenmerken¹⁶. Deze nieuwe methoden zijn verschillend van de klassieke 2D-celcultuur in die cellen vereisen geen transformatie of vermoralisatie voor langetermijngroei; Zo kunnen 3D-culturen van normale cellen worden vergeleken met zieke cellen. Dit is vooral waardevol bij kankeronderzoek waarbij normale celcontrole culturen meestal niet beschikbaar zijn. Daarnaast vormen organoïden spontaan secundaire weefsel architecturen met geschikte gedifferentieerde celtypen, waardoor ze een beter modelsysteem zijn om kanker in vitro te begrijpen dan 2D cellijnen¹⁷. Ons laboratorium heeft 3D organoïde lijnen gemaakt van tumor probleem geïsoleerd van onze PCA gemms om onze in vivo gegevens aan te vullen en experimenten uit te voeren die niet haalbaar zijn in gemms.

In dit artikel presenteren we geschreven en visuele protocollen voor de volledige obductie van PCa GEMMs, inclusief dissectie van verschillende muizen prostaat lobben en gemetastaseerde laesies. We beschrijven en tonen een stap-voor-stap methode voor het genereren van organoïden van muizen prostaattumoren op basis van een protocol eerder gepubliceerd door Drost et al. voor het afleiden van organoïden van normale muis prostaat epitheelweefsel¹⁸.

Protocol

De hier beschreven dier procedures zijn uitgevoerd met de goedkeuring van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) op het departement laboratorium dierlijk materiaal, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York.

Opmerking: Mannelijke muizen om te worden ontleed om te isoleren van prostates of prostaattumoren voor het genereren van organoïden moet ten minste de leeftijd van seksuele volwassenheid hebben bereikt-over 8-10 weken van leeftijd. Specifieke leeftijden van muizen kunnen variëren tussen studies. Sommige factoren om te overwegen bij het kiezen van leeftijd zijn leeftijdsafhankelijke veranderingen in prostaat celpopulaties, leeftijdsafhankelijke expressie van specifieke door de promotor gestuurde CRE-transgenen, en de mate van progressie van de prostaat tumor in een bepaalde GEMM.

1. dissectie en beeldvorming van muis ProstateTumor en gemetastaseerde tumoren

1. Preparaten
   1. Verkrijg noodzakelijke steriele dissectie gereedschappen. Stage dissectie gebied op schoon steriel oppervlak met een 15 cm liniaal, precisie balans, analytische balans, spray fles met 70% ethanol, fosho-gebufferde zoutoplossing (PBS), en papieren handdoeken.
   2. Bereiding van fixatieve oplossingen voor viscerale organen en botten die niet gebruikt kunnen worden voor organoïde opwekking
      1. Voor viscerale organen: bereid 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS. Maak voor één muis 20 mL 4% PFA, ALIQUOT in 2 15 mL conische buizen en bewaar deze op kamertemperatuur tot het gebruik.
      2. Voor lange botten: aliquot 10 mL vooraf gemaakte 10% neutrale gebufferde formaline (NBF) in 1 15 mL conische buis en bewaren op kamertemperatuur tot gebruik.
   3. Het verkrijgen van onbehandelde 10 cm gerechten en vullen met niet-steriele PBS-deze zullen dienen als tijdelijke containers voor organen tijdens fijne dissectie met behulp van een dissectie Microscoop.
      Opmerking: Steriele gereedschappen worden gebruikt voor het ontleden van weefsels voor het genereren van organoïden. Niet-steriele gereedschappen worden gebruikt voor de initiële incisie en dissectie van de achterpoten.
2. Euthanasie en initiële incisies
   1. Euthanaseren de muis door co₂ verstikking met behulp van een 2,0 L/min stroomsnelheid gedurende 5 min. Verwijder de muis uit de kooi en voer cervicale dislocatie. Gebruik de precisie balans om het lichaamsgewicht en de opname van de muis te meten.
   2. Plaats de muis boven op een papieren handdoek en oriënteer op het dissectie-oppervlak ventrale kant omhoog met het hoofd van de muis naar de weg van de onderzoeker. Bevestig de muis aan het bord door de ledematen uit te strekken en elk van de voorpoten en achterpoten met één wegwerp naald door te prikken.
   3. Met behulp van een spray fles, blus de vacht van de muis met 70% ethanol. Gebruik niet-steriele dissectie schaar en rechte Tang, knijp net boven de penis van de muis en maak een kleine incisie door de vacht alleen.
   4. Ga door met de incisie middenlijn tot aan de nek van de muis door de vacht. Maak bilaterale incisies vanaf het punt van de initiële incisie door het ventrale vlak van de muis door de vacht.
   5. Pak de vacht en trek hem voorzichtig weg van de huid van de muis. Speld de vacht aan het bord om toegang te geven tot zowel de abdominale als de thoracale Holten.
3. Extractie van mannelijke urogenitale systeem en bloc
   1. Met behulp van steriele dissectie schaar en rechte Tang, zorgvuldig snijden door de huid over 0,75 cm boven het rectum. Voortzetting van de incisie middellijn tot de ribbenkast zonder het verstoren van organen in de buikholte. Trek de huid voorzichtig weg en speld aan het bord om de hele buikholte bloot te leggen.
      Opmerking: Sta niet toe dat deze instrumenten de buitenkant van de muis of een oppervlak in de staging-ruimte aanraken, omdat deze weefsels zullen worden gebruikt om organoïden te genereren.
   2. Ontleden het urogenitale systeem en andere organen volgens het diagram in Figuur 1A, met getallen die de volgorde aangeven dat de organen van de muis worden verwijderd.
   3. Zoek de blaas, pak dan de vetpad aan de linker-of rechterkant en trek omhoog om de testikel bloot te leggen. Zorgvuldig ontleden de testikel uit de rest van de urogenitale regio en opzij gezet. Doe dezelfde procedure aan de andere kant.
      Opmerking: Het bereiken van de optimale weefsel kwaliteit en gedetailleerde tumor karakterisering van prostaattumoren vereist dat de gehele urogenitale regio worden verwijderd uit de muis en bloc¹⁹. Het wordt aanbevolen de urogenitale regio eerst te verwijderen (Figuur 1A).
   4. Pak de blaas en trek voorzichtig omhoog zodat de urogenitale regio samen liften, bloot de urethra eronder. Houd de blaas, oriënteer de schaar, zodat ze tegen de onderzijde van de rugprostaat en snijd de urethra. De gehele urogenitale regio zal dan vrijkomen uit de buikholte.
   5. Zet de urogenitale regio in een 10 cm schaal gevuld met PBS. Als nog steeds gevuld met urine, drain de blaas door het maken van een kleine incisie. Weeg het urogenitale systeem met behulp van de analytische balans en neem het op.
4. Extractie van bekken lymfeklieren, milt, lever, nier, Long, tibia en dijbeen
   1. Het verwijderen van het urogenitale systeem onthult de bekken lymfeklieren, geplaatst direct achter het urogenitale systeem (Figuur 1A) en aan weerszijden van de wervelkolom. De lymfeklieren zullen alleen zichtbaar zijn als ze gemetastaseerde laesies bevatten of als er lokale ontsteking is. Oriënteer de rechte Tang onder de lymfeklier en trek omhoog om de lymfeklier te verwijderen. Doe dezelfde procedure aan de andere kant.
   2. Pak het rectum met de rechte Tang en snijd. Trek aan het rectum om de gehele dikke darm en de dunne darmen te ontrafelen, op zoek naar gemetastaseerde laesies in de mesenterische lymfeklieren. Wanneer het hele ileum wordt verwijderd, blijven trekken op de twaalfvingerige darm om de maag bloot. Snijd de slokdarm om volledig te verwijderen van de maag en gooi. Als er gemetastaseerde laesies in de lymfeklieren worden waargenomen, ontleden ze voorzichtig weg van de darm en slaan ze op in een 10 cm schaal van PBS.
   3. Het blootstellen en verwijderen van de maag zal de milt uit de rugzijde van de buik trekken (Figuur 1A). Verwijder de milt en plaats deze in 4% PFA. De milt fungeert als een kleuring controle voor hemotoxylin als het zeer cellulaire.
      Opmerking: Viscerale weefsels die niet voor de organoïde generatie worden gebruikt, worden 's nachts vastgesteld in 4% PFA, gewassen met PBS, en vervolgens in 70% ethanol geplaatst.
   4. Verwijder de lever in het bovenste deel van de buik (Figuur 1A). Op basis van de gemetastaseerde belasting in de lever kunnen individuele lobben worden ontleed, of kan de gehele lever worden verwijderd door voorzichtig langs het diafragma te snijden. (Knip niet door het diafragma op dit moment). Plaats de lever in een 10 cm schaal van PBS.
   5. Het verwijderen van de lever zal volledig bloot de nieren aan weerszijden van de wervelkolom (Figuur 1A). Verwijder de nieren — samen met de nierlymfe klieren, als de knooppunten gemetastaseerde laesies hebben — door de rechte Tang onder de nier te plaatsen en omhoog te trekken. Doe dezelfde procedure voor de andere kant.
   6. Om de thoracische holte bloot te leggen, snijdt u voorzichtig het diafragma langs de ribcage. Door het diafragma te laten prikken, wordt de negatieve druk in de thoracische holte vrijgegeven en wordt het hart en de longen blootgesteld (Figuur 1A).
   7. Pak het borstbeen en trek omhoog om de thoracische holte verder te openen. Observeer het ventrale gezicht van de thoracische holte langs de ribbenkast voor gemetastaseerde laesies in de thoracische lymfeklieren en ontleden, indien aanwezig.
   8. Terwijl u het borstbeen nog vasthoudt, moet u de ventrale ribkooi wegknippen om toegang te krijgen tot het hart en de longen. Pak het hart, trek omhoog en snijd onder de longen. Om het hart en de longen volledig te verwijderen en bloc, snijd alle anterieure bloedvaten en de luchtpijp. Plaats het weefsel in PBS en verwijder het hart voorzichtig zonder beschadiging van het longweefsel of Long metastaserende laesies.
   9. Neem de niet-steriele rechte Tang en ontsnij schaar en snijd de achterpoot aan de kop van het dijbeen. Pak voorzichtig het dijbeen en verwijder de achterpoot van de vacht.
   10. Leg de achterpoot op een papieren handdoek en pak de achterpoot. Gebruik de single Edge scheermesje om alle spieren en bindweefsel van het scheenbeen en het dijbeen te schrappen/weg te knippen. Verwijder het dijbeen van de Tibia door het achterste aan de Patella te snijden en de Tibia te verwijderen door de achterpoot te verwijderen. Plaats de tibia en dijbeen in 10% NBF. Doe dezelfde procedure aan de andere kant.
       Opmerking: Voor het onderzoeken van de lange botten van de muis voor gemetastaseerde laesies hoeft het kuitbeen niet intact te zijn. De lange botten zullen worden vastgesteld in 10% NBF voor een week, dan ontkalkt met behulp van neutrale EDTA-oplossing²⁰. Na drie weken zullen de botten worden overgebracht naar 70% ethanol.
   11. Na het verwijderen van de achterpoten, neem een oor of staart snijden voor toekomstige genotypering. Gooi het karkas van de muis weg en al het weefsel niet vast te stellen of gebruikt te worden voor organoïde vorming.
5. Dissectie van prostaat tumor
   Opmerking: Dissectie van muis prostaat lobben kan alleen worden bereikt met behulp van een ontleed Microscoop¹⁹. Echter, de prostaat tumor belasting kan zo hoog zijn dat individuele lobben niet kunnen worden onderscheiden, en dissectie kan worden uitgevoerd zonder een microscoop. Niettemin wordt hieronder het volledige protocol voor dissectie van individuele prostaat lobben beschreven.
   1. Plaats de urogenitale regio in een 10 cm schaal van PBS onder een ontleed Microscoop en oriënteer de ventrale kant op met de blaas en zaadblaasjes die weg zijn van de onderzoeker. Alle manipulatie van de urogenitale regio moet gebeuren met behulp van steriele instrumenten.
   2. Beoordeling van de algemene fenotype van de prostaat tumor-hoogstwaarschijnlijk, ofwel een vloeistof gevulde of vaste tumor zal worden waargenomen in PCa GEMMs (Figuur 2a, B).
      Opmerking: Met vloeistof gevulde tumoren bevinden zich vaak in de anterieure prostaat regio (Figuur 2A). Vloeistof gevulde tumoren zijn opgebouwd uit voornamelijk bindweefsel met schaarse epitheliale componenten-dus deze tumoren zijn niet optimaal voor organoïde generatie vanwege het lage aantal tumor Epitheelcellen, zoals zal worden besproken in de representatieve resultaten Sectie.
   3. Als vloeistof gevulde tumoren aanwezig zijn, porren een klein gaatje in de tumor. Plaats de urogenitale regio in een nieuwe 10 cm schaal van PBS.
   4. Neem een paar rechte Tang in de niet-dominante hand en gebogen Tang in de dominante hand. Draai de urogenitale regio om het ruggezicht. Zoek naar de proximale prostaat regio (Figuur 1B), die kan worden geïdentificeerd door de roze/rode kleur van de urethra. Pak de urethra en houd stevig vast om het urogenitale weefsel met de gebogen Tang te manipuleren.
      Opmerking: Neem tijdens de prostaat dissectie altijd kennis van de locatie van de blaas, omdat dit de eenvoudigste manier is om de individuele prostaat lobben te lokaliseren (Figuur 1B).
6. Verwijdering van niet-prostaatweefsel uit de urogenitale regio
   1. Terwijl je nog steeds op het ruggezicht van de urogenitale regio zit, vind je de basis van het zaadblaasje. Verwijder voorzichtig het zaadblaasje en gooi het weg. Voer dezelfde procedure uit aan de andere kant.
      Opmerking: Vermijd het prikken van het zaadblaasje, als dat zal vrijgeven kleverige en ondoorzichtige secretoire vloeistof die interfereert met prostaat dissectie. Als het zaadblaasje wordt doorgeprikt, breng dan de overgebleven urogenitale regio over naar een nieuwe 10 cm schaal met verse PBS.
   2. Verwijder en gooi de vas-deferens en zoveel mogelijk vet en bindweefsel weg met behulp van de gebogen zijde van de Tang.
   3. Terwijl u nog steeds stevig de urethra/proximale prostaat regio vasthoudt, gebruik dan een paar fijne, puntige schaar om de blaas uit de urethra te verwijderen.
7. Isolatie van individuele prostaat lobben
   1. Zoek de anterieure prostaat (Figuur 1B). Zorg ervoor dat de proximale prostaat regio/urethra stevig vast te houden met de rechte Tang. Verwijder het voorste prostaat gebied door het weefsel direct te grijpen met de gebogen zijde van de Tang en het stevig uit de blaas en de rest van de prostaat te trekken. Plaats het weefsel in PBS.
      Opmerking: Voor alle prostaat gebieden kan het ontleden van een schaar nodig zijn om het weefsel te verwijderen, afhankelijk van de grootte van de tumor.
   2. Zoek de ventrale prostaat regio (Figuur 1B). Verwijder de ventrale prostaat regio op dezelfde manier als in stap 1.5.7.
   3. Op dit punt in het dissectie moeten alleen de laterale en dorsale prostaat gebieden aanwezig zijn, terwijl het proximale prostaat gebied nog steeds wordt gegrepen door de rechte Tang. Beoordeel de laterale en dorsale prostaat gebieden (Figuur 1B). Als de laterale regio kan worden onderscheiden van de rugstreek, verwijder de laterale prostaat regio zoals beschreven in stap 1.5.7. Doe dezelfde procedure aan de andere kant.
   4. Verwijder de dorsale prostaat regio zoals beschreven in stap 1.5.7. Plaats het proximale prostaat gebied in 4% PFA, omdat de structuur binnen het spierweefsel van de urethra het ongeschikt maakt voor organoïde generatie.

2. generatie van 3D Organoïden van prostaat tumor weefsel

Opmerking: Figuur 3 toont een picturale beschrijving van de procedure voor het genereren van tumor organoïden.

1. Voorbereiding
   1. Bereid de muis prostaat organoïde media volgens Drost et al.¹⁸ met de volgende wijzigingen. Gebruik geconditioneerd medium in plaats van recombinante eiwitten voor Noggin en R-Spondin en gebruik een uiteindelijke concentratie van 1% (v/v), in plaats van 10%, voor zowel Noggin-als R-Spondin-geconditioneerd medium.
      Opmerking: HEK293 cellen die stabiel zijn getransfunteerd met HA-Mouse Noggin-FC of HA-Mouse Rspo1-FC worden gebruikt om respectievelijk Noggin-of R-Spondin-geconditioneerd medium te produceren. Deze cellijnen waren een geschenk van het Calvin Kuo Laboratory aan de Stanford University.
   2. Bereid de digestie oplossing in een buis van 15 mL door het verdunen van 20 mg/mL Collagenase II met geavanceerde DMEM/F12 (+ + +) media tot een uiteindelijke concentratie van 5 mg/mL. Voeg Y-27632-Rotsremmer toe aan de Collagenase II-oplossing in een uiteindelijke concentratie van 10 μM.
      Opmerking: De verhouding van de spijsvertering buffer tot weefsel is 1 mL tot 50 mg, die we gebruiken volgens Drost et al.¹⁸.
2. Het hakken en de vertering van tumorweefsel
   1. In de cel cultuur kap, plaats prostaat tumorweefsel in een steriele 10 cm cultuur schotel, ontleden en gooi necrotisch weefsel.
   2. Mince het overgebleven prostaat tumorweefsel in 1 mm³ blokjes door de weefsel stukken met de steriele gebogen Tang te houden en te snijden met dissectie schaar.
   3. Plaats de gehakte tumor stukjes in de buis van 15 mL met de digestie buffer door ze te spotten met de gebogen zijde van de Tang. Verteren het tumorweefsel bij 37 °C met schudden voor 1,5 tot 2 uur. Controleer de voortgang van de spijsvertering elke 20 min.
      Opmerking: Op dit moment, neem ten minste 2 mL matrix van-20 °C opslag en ontdooien op ijs. 1 mL aliquots van matrix duurt ongeveer 3 uur om te ontdooien.
   4. Na weefsel vergisting, centrifugebuis bij 175 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c om een celpellet te vormen.
   5. Verwijder het supernatant, veeg de buis om de celpellet los te maken, en respendeer de celpellet in 1 mL voorverwarmde trypsine aangevuld met 10 μM Y-27632-Rotsremmer. Plaats de buis gedurende 5 minuten in een waterbad van 37 °C.
   6. Pipetteer na incubatie 5 keer op en neer met een standaard P1000 tip. Retourneer de buis tot 37 °C waterbad voor nog eens 5 min en herhaal stap 2.2.6.
      Opmerking: Verwarm op dit moment in de procedure een steriele 6-well celkweek schaal door deze in een incubator van 55 °C te zetten.
3. Telcellen en resuspensie in matrix
   1. Was de cellen door 9 mL koude AdDMEM/F12 (+ + +) toe te voegen en centrifugeer de buis bij 175 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
   2. Verwijder na het centrifugeren het supernatant, veeg de buis om de pellet los te maken en spoel de cellen opnieuw door 10 mL koude AdDMEM/F12 (+ + +) toe te voegen. Centrifugeer de buis bij 175 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
   3. Na centrifugeren, verwijder het supernatant, veeg de buis om de pellet los te maken, regeer de cellen in 1 mL AdDMEM/F12 (+ + +), en Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer volgens de standaardprocedure.
   4. Zeven-tot-acht Domes passen in een put van een 6-put als organoïden via een drop-Wise mode in matrix worden geplateerd. Ongeveer 200 μL matrix zal 7-8 koepels produceren. Bepaal hoeveel putten van organoïden nodig zijn voor toekomstige experimentele doeleinden en bereken het vereiste volume van de matrix. Bereken vervolgens het volume van de cel-bevattende oplossing die nodig is om een eindconcentratie van 1,0 x 10⁶ cellen/ml matrix te hebben.
   5. Na het tellen van cellen, centrifugeer bij 175 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Verwijder het supernatant, veeg de buis om de pellet los te maken en rebreng de cellen in het volume van de matrix, berekend in stap 2.3.4.
      Opmerking: Matrix blijft in vloeibare vorm alleen bij 4 °C; Houd matrix voorraad buizen en matrix-celoplossingen te allen tijde op ijs.
4. Plating matrix koepels en toepassing van media
   1. Meng matrix-celoplossing met een P200 pipet om de cellen gelijkmatig te verdelen zonder bellen te introduceren. Haal het 6-well kweek gerecht uit de 55 ° c incubator.
   2. Pipetteer 200 μL matrix-celoplossing zorgvuldig en laat de oplossing snel in een put vallen om koepels te maken.
   3. Herhaal stap 2.4.2. totdat het volume van de matrix-cel-oplossing wordt besteed. Laat de koepels gedurende 2 min bij kamertemperatuur stollen.
   4. Draai het 6-well gerecht ondersteboven en zet het gerecht in een incubator van 37 °C om gedurende 20 minuten te stollen.
   5. Na incubatie, voeg 2 ml muis prostaat organoïde media toe aan elk goed. Voeg synthetische androgeen R1881 toe aan elk goed voor een uiteindelijke concentratie van 1 nM en Y-27632-Rotsremmer tot een eindconcentratie van 10 μM. Meng voorzichtig en plaats de plaat in een incubator van 37 °C voor kweek.
      Opmerking: Organoïde kweekmedia moeten worden aangevuld met 10 μM Y-27632-Rotsremmer gedurende slechts 1 week na de organoïde generatie.

Resultaten

Representatieve obductie beelden van een muis met een grote vloeistof gevulde primaire prostaat tumor in de voorste prostaat regio worden weergegeven in Figuur 2a. Figuur 2Bdaarentegen vertoont representatieve obductie beelden van een muis met een grote vaste primaire prostaat tumor waarvoor individuele prostaat gebieden niet te onderscheiden zijn. Fluorescerende dissectie beelden tonen dezelfde solide prostaat tumor uit

Discussie

Kritische stappen binnen het protocol voor prostaat tumor dissectie en organoïde generatie
Verwijdering van niet-prostaatweefsel en fijne dissectie van de muis prostaat tumor is cruciaal voor de optimale generatie van kanker organoïden omdat zowel niet-prostaat epitheelcellen en normale prostaat epitheelcellen organoïden zullen genereren. Voor vaste prostaattumoren specifiek, het is cruciaal om te isoleren gebieden van levensvatbare tumor te verwijderen van besmetting met necrotisch weefsel dat het aa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA	Sigma	25-053
1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles	Becton Dickinson	Z192430
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
32% paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	15714
A83-01	MedChemExpress	HY-10432
Advanced DMEM/F12+++	Gibco	12634
Analytical balance	Mettler Toledo	30216623
B27 (50x)	Gibco	17504044
Collagenase II	Gibco	17101015
Dissecting Board	Thermo-Fisher	36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10	Manufactured by Trevigen	Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory	Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix
HEPES (1 M)	Sigma	25-060
human recombinant Epidermal growth factor (EGF)	PeproTech	AF-100-15
L-glutamine (200 mM)	Sigma	25-005
N-Acetyl-L-Cysteine	Sigma	A9165
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Precision balance	Mettler Toledo	30216561
Scalpel #23	World Precision Instruments	504176
Scalpel Handle #7, 16 cm	World Precision Instruments	500238
Single-edge carbon razor blade	Fisherbrand	12-640
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight	World Precision Instruments	14393
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated	World Precision Instruments	15915
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated	World Precision Instruments	504489
Y-276632 (Rock Inhibitor)	APExBIO	A3008