Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en de dood in 3D sferoïde culturen van kankercellen

28.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59714

⸱

16 juni 2019

 ,  , 
1Section for Cell Biology and Physiology, Department of Biology, Faculty of Science, University of Copenhagen

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een aantal eenvoudige methoden voor de evaluatie van de levensvatbaarheid en de dood in 3D kanker cel sferoïden, die de fysisch-chemische gradiënten van in vivo tumoren veel beter dan de 2D-cultuur na te bootsen. Het sferoïde model maakt het dus mogelijk om de effectiviteit van kanker medicijnen te evalueren met een verbeterde vertaling naar in vivo omstandigheden.

Samenvatting

Driedimensionale sferoïden van kankercellen zijn belangrijke hulpmiddelen voor beide kanker geneesmiddelen schermen en voor het verkrijgen van mechanistische inzicht in kanker celbiologie. De kracht van deze voorbereiding ligt in zijn vermogen om te imiteren vele aspecten van de in vivo voorwaarden van tumoren terwijl ze snel, goedkoop, en veelzijdig genoeg om relatief high-throughput screening mogelijk te maken. De sferoïde cultuuromstandigheden kunnen recapituleren de fysisch-chemische gradiënten in een tumor, met inbegrip van de toenemende extracellulaire zuurgraad, verhoogde lactaat, en het verminderen van glucose en zuurstof beschikbaarheid, van de sferoïde periferie aan zijn kern. Ook de mechanische eigenschappen en cel-cel interacties van in vivo tumoren zijn deels nagebootst door dit model. De specifieke eigenschappen en bijgevolg de optimale groeiomstandigheden, van 3D sferoïden, verschillen sterk tussen verschillende soorten kankercellen. Voorts vereist de beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen en de dood in 3D sferoïden methodes die gedeeltelijk van die voor 2D culturen verschillen. Hier beschrijven we verschillende protocollen voor de voorbereiding van 3D sferoïden van kankercellen, en voor het gebruik van dergelijke culturen om de levensvatbaarheid van cellen en de dood te beoordelen in het kader van de evaluatie van de effectiviteit van antikanker

Inleiding

Het gebruik van multicellulaire sferoïde modellen in de Kankerbiologie is een aantal decennia oud1,2, maar heeft aanzienlijke dynamiek opgedaan in de afgelopen jaren. Voor een groot deel weerspiegelt dit meer besef hoe sterk het fenotype van kankercellen afhankelijk is van hun micromilieu en specifieke groeiomstandigheden. De micromilieu in vaste tumoren is fundamenteel verschillend van dat in overeenkomstige normale weefsels. Dit omvat fysisch-chemische voorwaarden zoals pH, zuurstof spanning, evenals interstitiële druk, concentratie gradiënten van oplosbare factoren zoals voedingsmiddelen, afvalproducten, en afgescheiden signalerende samenstellingen (groeifactoren, cytokines). Bovendien omvat het de organisatie van de extracellulaire matrix (ECM), cel-cel interacties en intercellulaire signalering, en andere aspecten van de bijzondere drie-dimensionale (3D) architectuur van de tumor3,4, 5,6. De specifieke microecologische omstandigheden waarin kankercellen bestaan, hebben een diepgaande invloed op hun genexpressie profiel en functionele eigenschappen, en het is duidelijk dat, vergeleken met die van cellen gekweekt in 2D, het fenotype van 3D sferoïden veel nauwer nabootst die van in vivo tumoren7, 8,9,10,11. 2D-modellen, zelfs als ze in dienst hypoxie, zure pH, en hoge lactaat concentraties om na te bootsen bekende aspecten van de tumor micromilieu, nog steeds niet aan de gradiënten van de fysisch-chemische parameters die ontstaan binnen tumoren, evenals hun 3D-tumor vast te leggen Architectuur. Aan de andere kant, dierlijke modellen zijn kostbaar, traag en ethisch problematisch, en in het algemeen, hebben ook tekortkomingen in hun vermogen om de menselijke tumor voorwaarden recapituleren. Bijgevolg zijn 3D sferoïden toegepast als een intermediair complexiteits model in studies van een breed scala van eigenschappen van de meeste vaste kankers9,11,12,13, 14,15,16,17.

Een veelgebruikt gebruik van 3D sferoïden is in screening assays van kankertherapie werkzaamheid9,18,19,20. De reacties van de behandeling zijn bijzonder gevoelig voor de tumor microenvironment, die zowel de invloed van de tortuosity, de beperkte verspreiding, de hoge interstitiële druk, als zure milieu pH op druglevering weerspiegelt, en de invloed van hypoxie en andere aspecten van het micromilieu op de reactie van de celdood9,17. Omdat het milieu binnen 3D sferoïden inherent al deze eigenschappen7,8,9,10,11ontwikkelt, kan het tewerkstellen van 3D cel culturen aanzienlijk verbeteren van de vertaling van de resultaten in vivo omstandigheden, maar toch een efficiënte en betaalbare high-throughput screening van de netto-groei mogelijk te maken. Echter, de grote meerderheid van de studies over de drug Response van kankercellen worden nog steeds uitgevoerd onder 2D-omstandigheden. Dit waarschijnlijk weerspiegelt dat, terwijl sommige analyses kunnen relatief gemakkelijk worden geïmplementeerd voor 3D-cel culturen, veel, zoals levensvatbaarheid assays, West-bevlekken, en immunofluorescentie analyse, zijn veel handiger gedaan in 2D dan in 3D.

Het doel van het huidige werk is het verstrekken van gemakkelijk vatbaar analyses en precieze protocollen voor analyses van het effect van de behandeling met anti-kanker medicijnen op kankercellen levensvatbaarheid en overleving in een 3D-tumor nabootsen instelling. Concreet, bieden en vergelijken we drie verschillende methoden voor sferoïde vorming, gevolgd door methoden voor kwalitatieve en kwantitatieve analyses van groei, levensvatbaarheid en drug Response.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. generatie van Sferoïden

  1. Het voorbereiden van cel opschortingen voor sferoïde vorming
    Nota:     de verschillende cel lijnen hebben zeer verschillende adhesie eigenschappen en het geschiktste sferoïde vorming protocol moet in elk geval worden gevestigd. Wij hebben geconstateerd dat MCF-7 en BxPC-3 cellen voor spontane sferoïde vorming geschikt zijn, terwijl MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 en MiaPaCa de toevoeging van opnieuw samengesteld kelder membraan vereisen om met succes sferoïden te vormen. Alleen MDA-MB-231 en BxPC-3 cellen zijn aangewend voor de opknoping drop protocol, maar andere cel lijnen zijn zeker van toepassing.
    1. Grow cellen als monolayer tot 70-80% confluentie.
    2. Was cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS, 5 mL voor een 25 cm2 of 10 ml voor een kolf van 75 cm2 ), voeg de cel dissociatie enzym (0,5 ml voor een 25 cm2 of 1 ml voor een 75 cm2 kolf) en Incubeer de cellen voor 2-5 min bij 37 °c in 5% CO2 en 95% vochtigheid.
    3. Controleer de cel detachement onder een microscoop en Neutraliseer de cel dissociatie enzym door toevoeging van groeimedium (6-10% serum afhankelijk van de cel lijn) tot een totaal volume van 5 mL in een 25 cm2 of 10 ml voor een 75 cm2 kolf.
    4. Gebruik een Bürker kamer om cellen te tellen en 8 vierkanten in de kamer per cel voorbereiding te tellen om een hoge reproduceerbaarheid van de grootte van de sferoïden te verkrijgen.
      Opmerking: Drie protocollen die elk een andere methode voor sferoïde vorming beschrijven worden hieronder voorgesteld. Protocol 1,2 en 1,3 kunnen worden gebruikt voor alle volgende analytische protocollen gepresenteerd, terwijl Protocol 1,4 is het meest geschikt voor inbedding en lysate preparaten. Afhankelijk van de cel lijn, sferoïde vorming duurt 2-4 dagen, ongeacht de gebruikte methode.
  2. Spontane sferoïde vorming
    1. Voer stappen 1.1.1-1.1.4 uit.
    2. Verdun de schorsing van de cel in een buis van 15 mL om 0,5-2 x 104 cellen/ml te verkrijgen (de optimale dichtheid van de cellen moet voor elke cel lijn worden bepaald) (Figuur 1a (II)).
    3. Vul de buitenste ring van putten met 1x PBS of groeimedium om verdamping te verminderen van de resterende putten. Breng de schorsing van de cel over in een steriel reservoir en Doseer met behulp van een multichannel pipet 200 µ L/put in ultra-lage bevestigings 96-goed ronde bodemplaten (Figuur 1a (III)).
    4. Incubeer de plaat in een incubator bij 37 °C met 5% CO2, 95% vochtigheid.
    5. Elke 2-3 dagen te verwerven licht microscopische beelden van de sferoïden.
      Opmerking: De beelden in deze paper zijn genomen op 11,5 x vergroting, die geschikt is voor de meeste sferoïden bereid met behulp van deze protocollen.
    6. Elke 2-3 dagen (na het verwerven van beelden) vervangen 100 µ L van middel (Verwijder 100 µ L van het bestede middel en vervang met 100 µ L van vers middel.
      Opmerking: Om te voorkomen dat het verwijderen van sferoïden bij het vervangen van medium, is het raadzaam om de plaat een beetje kantelen terwijl langzaam het verwijderen van het medium en Inspecteer de aanzuiging medium in de tips voor zichtbare sferoïden voordat u het weggegooid.
  3. Hervormde kelder membraan-gemedieerde sferoïde vorming.
    Opmerking:     lactose dehydrogenase verheffende virus (LDEV)-gratis verminderde groeifactor opnieuw samengesteld Basement membraan (rBM) werd gebruikt. rBM is temperatuur-gevoelig en moet altijd worden gehouden op het ijs, want het zal stollen als het bereikt 15 ° c. Ontdooi de rBM op het ijs ofwel 's nachts bij 4 ° c of 2-4 h bij kamertemperatuur (RT) voor plating.
    1. Dooi rBM op ijs (Zie lijst van materialen).
    2. Houd platen en reservoirs (indien individueel verpakt) op ijs voor gebruik.
    3. Voer stappen 1.1.1-1.1.4 uit.
    4. Vul de buitenste ring van putten met 1x PBS of groeimedium om verdamping te verminderen van de resterende putten. Verdun de schorsing van de cel in een buis van 15 mL om 0,5-2 x 104 cellen/ml te verkrijgen (de optimale dichtheid van de cellen moet voor elke cel lijn worden bepaald) (Figuur 1a (II)).
    5. Plaats de 15 mL buis met de verwaterde cel suspensie op ijs (bijv. in glas beker) (Figuur 1a (IIA)).
    6. Breng de gekoelde platen en reservoirs naar de kap. Spoel plastic containers, vul ze met ijs en breng ze in de kap zodat de platen en reservoirs worden geplaatst op ijs tijdens de gehele procedure.
    7. Hersuspendeer rBM voorzichtig om een homogene gel te garanderen.
    8. Voeg 1-2% rBM (de optimale concentratie moet voor elke cel lijn worden bepaald) aan de gekoelde schorsingen van de cel (Figuur 1a (IIB)).
    9. Omkeren van de 15 mL buis om de juiste vermenging van rBM en cel schorsing voor de afgifte van de schorsing in de plaat te waarborgen.
    10. Breng de rBM in een steriel reservoir en verdeel 200 µ L/put in gekoeld ultra-laag gehechtheid 96-goed platen met behulp van een multichannel Pipet (Figuur 1a (III)).
      Opmerking: Als het werken met verscheidene cel opschortingen (b.v., meer dan één cel lijn), is het essentieel om elke cel opschorting onmiddellijk na rBM toevoeging te afzien om voorbarige geleer te verhinderen.
    11. Centrifugeer de plaat gedurende 15 min bij 750 x g met ' Soft degelijke '/No-remmen (indien mogelijk Centrifugeer bij 4 °c om de rBM vloeistof langer te houden, maar geen vereiste voor een succesvolle sferoïde vorming), om ervoor te zorgen dat de cellen samen geclusterd worden wanneer de rBM verhardt, faciliteert de vorming van een enkele sferoïde.
    12. Incubeer de plaat in een incubator (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid).
    13. Elke 2-3 dagen te verwerven licht microscopische beelden voor de evaluatie van de sferoïde groei.
    14. Elke 2-3 dagen vervangen 100 µ L van middel (Verwijder 100 µ L en vervang met 100 µ L van vers middel).
  4. Opknoping drop sferoïden.
    1. Voer stap 1.1.1-1.1.4 uit.
    2. Verdun cellen om een geschikte verdunning te verkrijgen. Een praktische verdunning is 50.000 cellen/mL.
    3. Verwijder het deksel van een 10 cm2 Cell kweekschaal en plaats het zodat het naar boven kijkt. Voeg 6 mL 1x PBS aan de schotel toe (Figuur 1B (i)).
    4. Giet de cel schorsing in een steriel reservoir en voorzichtig plaats tot 30 druppels van 40 µ L van de cel schorsing op het deksel van de cel cultuur schotel met behulp van een multichannel Pipet (Figuur 1B (II)), wat resulteert in een concentratie van 2.000 cellen/druppel. Vermijd het plaatsen van de druppels te dicht bij de rand van het deksel als deze druppels hebben meer kans op oppervlaktespanning te verliezen bij het omkeren van het deksel in de volgende stap.
    5. Omkeren het deksel in een snelle maar gecontroleerde beweging en plaats deze op de top van de 1x PBS-bevattende cel cultuur schaal (Figuur 1B (III)).
    6. Plaats de schotel in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 en 95% vochtigheid zonder de dalingen te verstoren en laat hen groeien voor 4-6 dagen.
    7. Als om te worden gebruikt voor eiwit lysaten of inbedding, zwembad sferoïden door het verwijderen van het deksel en kantelen, om te spoelen de druppels met 1 mL verwarmde medium. Breng het resulterende medium met sferoïden naar een 1,5 mL buis en laat ze zich te vestigen op de bodem van de buis. Ga verder zoals beschreven in 4,4 en 6.2.2 voor proteïne lysaten en inbedding, respectievelijk.

2. medicamenteuze behandeling van Sferoïden

Opmerking: Lange-termijn behandeling van geneesmiddelen kan worden toegepast op de sferoïden om te screenen op effecten van een drug van belang. Alvorens de drugbehandeling in werking te stellen, is het raadzaam om een dosis reactie experiment van de drug (s) uit te voeren, om een aangewezen dosis voor de experimentele behandeling te vinden. De doses moeten worden gebaseerd op de vastgestelde IC50/Ki van de drug en variëren van ongeveer 0,2 x-10x van deze waarde.

  1. Opstelling 6-12 sferoïden per de gewenste voorwaarde zoals beschreven in 1,2 of 1,3 en plaats in de incubator (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid) 2 dagen.
  2. Op dag 2, neem licht microscopische beelden van de sferoïden.
  3. Bereid de eerste behandel doses (na het verwerven van beelden).
    Opmerking: De eerste behandeling concentratie moet tweemaal de gewenste uiteindelijke concentratie als de oplossing zal worden verdund 1:2 op aanvulling op de goed bevattende 100 µ L medium. De voorgestelde intervallen van de drugbehandeling (zullen afhangen van drug Half-Life): dag 2, 4 en 7.
  4. Met behulp van een multichannel Pipet, verwijder voorzichtig 100 µ L van medium en vervang deze door 100 µ L van drugs bevattende medium.
  5. Plaats de 96-well plaat terug in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 en 95% vochtigheid en herhaal 2,3 en 2,4 op de gekozen dagen van de behandeling, maar nu zonder verdubbeling van de dosis om de juiste uiteindelijke dosis te verkrijgen.
  6. Op de laatste dag van het protocol/behandeling schema, een of meerdere van de volgende tests kunnen worden uitgevoerd.

3. de haalbaarheidsanalyse van de cel voor Sferoïden

  1. Set up 4-6 sferoïden per de gewenste voorwaarde zoals beschreven in 1,2 of 1,3 en plaats in de incubator bij 37 ° c met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid.
    Opmerking: In dit geval werd de bepaling van de levensvatbaarheid van de cellen uitgevoerd op dag 7 of 9, nadat de sferoïde groei om de 2-3 dagen is gecontroleerd door de Lichtmicroscopie zoals hierboven beschreven (punt 1.2.5 en 1.3.13).
  2. Ontdooi de levensvatbaarheid assay reagens (Zie tabel van materialen) en laat het EQUILIBRATE naar RT voorafgaand aan het gebruik.
  3. Meng voorzichtig door het inverteren van een homogene oplossing te verkrijgen.
  4. Verwijder vóór het uitvoeren van de assay 50% van het kweekmedium uit de sferoïden (100 µ L).
  5. Voeg de levensvatbaarheid van de cel aan elk goed op een 1:3 verhouding tot de hoeveelheid medium aanwezig in de put (Figuur 2a (i)) voor een 96-well plaat, voeg 50 µ l van reagens tot 100 µ l van medium.
  6. Meng de inhoud gedurende 5 minuten krachtig om de cel lysis te induceren (Figuur 2a (II)).
  7. Incubeer gedurende 25 min bij RT om het lichtgevende signaal te stabiliseren (Figuur 2A (III)).
  8. Neem het lichtgevende signaal op (Figuur 2a (IV)).

4. het voorbereiden van eiwit lysaten voor het westelijke bevlekken van 3D sferoïde culturen

Opmerking: Bij het verzamelen van de sferoïden is het raadzaam om een P200 pipet te gebruiken en het uiteinde van de tip te knippen om een grotere opening mogelijk te maken en dus een gemakkelijker te vangen van de sferoïden zonder hun structuur te verstoren.

  1. Voor elke conditie, pool een minimum van 12, idealiter 18-24 sferoïden (afhankelijk van sferoïde grootte) in een 1,5 mL buis (Vermijd 2 mL buizen, als de volgende stappen zal moeilijker geworden als gevolg van hun minder puntige bodem).
    Opmerking: Indien de hoeveelheid medium groter is dan 1,5 mL alvorens alle sferoïden te hebben verzameld, laat de verzamelde sferoïden zich op de bodem vestigen (gebeurt zeer snel, centrifugeren niet noodzakelijk) en gooi de helft van het volume van de buis weg voordat u doorgaat met het verzamelen van de resterende sferoïden.
  2. Plaats de tubes op het ijs en laat de sferoïden zich aan de onderzijde van de 1,5 mL Tube vestigen.
  3. Verplaats van het steriele cel laboratorium naar het reguliere laboratorium.
  4. Was sferoïden tweemaal in 1 mL ijskoud 1x PBS. Laat sferoïden regelen alvorens 1x PBS tussen elke het wassen stap te verwijderen.
  5. Aspireren zo veel 1x PBS mogelijk zonder de sferoïden te storen of te verwijderen.
  6. Voeg 5 µ L van verwarmde lysis buffer (LB) toe met fosfatase-en proteaseremmers, per sferoïde (bijv. 10 sferoïden = 50 µ L LB).
  7. Herhaal intervallen van Vortex gevolgd door spin-down tot sferoïden worden opgelost. Voer een cyclus van vortexen voor 30 s, gevolgd door centrifuge (een snelle spin met behulp van een tafelblad centrifuge is voldoende) voor 10 s voor ca. 5-10 min, afhankelijk van de grootte en de compactheid van de sferoïden.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Houd de lysaten bij-20 °C tot het te werk gaan met sonication, homogenisering en eiwit bepaling zoals in een standaard 2D proteïne lysate protocol, dat door het westelijke bevlekken wordt gevolgd gebruikend standaardprotocollen.

5. Propidium jodide (PI) kleuring van Sferoïden

  1. Opstelling 3-6 sferoïden per gewenste voorwaarde zoals beschreven in 1,2 of 1,3 en plaats in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 en 95% vochtigheid.
  2. In een steriele cel cultuur Lab, warmte 1x PBS tot 37 ° c.
  3. Maak een PI oplossing van 4 µ M door verdunning voorraad oplossing in 1x PBS: Verdun een 1 mg/mL waterige voorraad van PI 1:350 in 1x PBS.
    Opmerking: Deze concentratie zal verder worden gehalveerd bij toevoeging van de oplossing voor de putten met een eindconcentratie van 2 µ M. 100 µ L van deze oplossing is nodig voor elk goed met een sferoïde.
    Let op: Propidium jodide (PI) moet worden behandeld in een rook kap en het dragen van handschoenen. PI is lichtgevoelig. Bescherm tegen licht bij het hanteren.
  4. Verwijder 100 µ L van het middel van elk goed in de 96-goed plaat zonder de sferoïden te verwijderen.
  5. Was het resterende medium door toevoeging van 100 µ L van verwarmde 1x PBS aan alle putten, gevolgd door het verwijderen van 100 µ L van de vloeistof in de putten. Herhaal deze wassen stap 3 keer.
  6. Voeg 100 µ L van de PI-oplossing voor elk goed, bedek de plaat in aluminiumfolie en plaats deze in een incubator op 37 ° c met 5% CO2 en 95% vochtigheid voor 10-15 min.
  7. Herhaal de 3 wassen stappen beschreven in 4,5 te wassen uit PI oplossing, met het oog op achtergrond signaal bij beeldvorming te verminderen.
  8. Gebruik een epifluorescence Microscoop om het beeld van de sferoïden. Om de levensvatbaarheid van cellen in de sferoïde kern te evalueren Neem z-stapels om beelden met variërende diepten van de sferoïde te krijgen.
    Opmerking: Een stapgrootte rond 18-35 µm tussen elk segment afhankelijk van sferoïde grootte is raadzaam, het geven van ongeveer 11-18 stacks per sferoïde. Z-stacks kunnen worden verwerkt in ImageJ met behulp van de z-projectiefunctie, die alle z-stacks kan combineren tot een laatste foto, wat een overzicht geeft van de kleuring in de sferoïde (voor verdere richtlijnen over het gebruik van ImageJ voor dit doel, zie (https://imagej.net/Z-functions).

6. inbedding van 3D Sferoïden

  1. Bereid de agarose gel waarin de sferoïden zijn ingebed (alleen de noodzakelijke eerste keer het uitvoeren van het Protocol).
    1. Meng 1 g bactoagar in 50 mL ddH2O.
    2. Verhit langzaam in microgolfoven tot de bactoagar is opgelost en een homogene gel gevormd. Sta niet toe dat de gel aan de kook.
    3. Houd de bactoagar warm in een waterbad bij 60 °C.
    4. Houd bij 4 °C tussen experimenten.
  2. Inbedding van sferoïden.
    1. Op dag 1, voor elke conditie, pool een minimum van 12 sferoïden in een 1,5 mL buis.
    2. Was eens met 1 mL ijskoud 1x PBS.
    3. Om de sferoïden te bevestigen, voeg 1 mL van 4% Paraformaldehyde toe.
      Opmerking: Behandeling van Paraformaldehyde moet worden uitgevoerd in een rook kap.
    4. Laat ze incuberen voor 24 uur bij RT.
    5. Op dag 2, Verwarm de agarose gel zorgvuldig door het in een met water gevulde beker in een microgolfoven te plaatsen. Zorg ervoor dat de gel niet kookt! Houd warm in een benchtop verwarmingsplaat, bij 60 °C tot het gebruik.
    6. Was sferoïden tweemaal met 1 mL ijskoud 1x PBS.
    7. Aspireren de meeste van de 1x PBS (het verlaten van ongeveer 100 µ L op dit punt is praktisch voor de behandeling van de sferoïden).
    8. Maak een pipet van 20 µ L door het pipet uiteinde te snijden op een helling om een puntiger punt te verkrijgen met een groter gat (zie illustratie).
      Opmerking: Het volgende deel moet snel worden gedaan om een optimale sferoïde overdracht te garanderen en te voorkomen dat stolling van gel te laten vallen. Als geen het verwarmen blok beschikbaar is, wordt het geadviseerd om de sferoïden eerst te vangen en dan de agarose daling (d.w.z., die de orde van punten 6.2.9 en 6.2.10) te schakelen maakt.
    9. Maak een agarose gel druppel op een Microscoop dia. Plaats de dia op een warm verwarmingsblok om agarose te verhinderen te stollen.
    10. Met behulp van de gemodificeerde pipet tip (zie 6.2.8), vangen zoveel mogelijk sferoïden in een volume van 15-20 µ L.
    11. Injecteer zorgvuldig 15-20 µ L sferoïde-bevattende 1x PBS in het centrum van de agarose gel daling zonder de Microscoop dia aan te raken.
      Opmerking: Dit is een iets moeilijk punt. De sferoïden zal verloren gaan als de pipet Tip de Microscoop schuif raakt bij het injecteren van de sferoïden in de gel druppel. Het is raadzaam om het gehele proces te praktizeren van het maken van de agarose daling en het inspuiten van sferoïden door een gekleurde vloeistof in de daling te injecteren. Dit zal visualisatie van een potentiële penetratie door de daling toestaan, aangezien de gekleurde vloeistof uit op de dia zal lekken.
    12. Laat de agarose gel laten uitharden door te broeden voor 5-10 min bij RT of bij 4 °C. Zodra de gel druppel is enigszins gestold (maar is nog steeds vrij zacht), voorzichtig duw de gel druppel van de Microscoop dia in een plastic tissue cassette met een scalpel.
    13. Bedek de plastic weefsel cassettes in 70% ethanol.
      Opmerking: Op dit punt kan de sferoïden direct worden gebruikt of worden opgeslagen voor maanden.
    14. Embed de agarose-embedded sferoïde in paraffine, sectie in 2-3 µm dikke laag dia's en vlek met hematoxyline en eosine of onderworpen aan de immuun-histologische kleuring.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Sferoïde groei analyses gebaseerd op het sferoïde formatie protocol schematisch geïllustreerd in Figuur 1A en Figuur 1B, werden gebruikt als uitgangspunt voor de analyse van de effecten van anti-kankerbehandelingen in een 3D tumor nabootsen instelling. Het gemak waarmee sferoïden worden gevormd is specifieke cel lijn, en sommige cel lijnen vereisen aanvulling met rBM om coherente sferoïden22te vormen. De ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het gebruik van 3D kanker cel sferoïden heeft bewezen een waardevol en veelzijdig instrument niet alleen voor antikanker drug screening, maar ook voor het verkrijgen van mechanistische inzicht in de regulering van kankercellen dood en levensvatbaarheid onder omstandigheden nabootsen die in de tumor micro-omgeving. Dit is vooral van cruciaal belang als de toegankelijkheid, cellulaire opname, en intracellulaire effecten van chemotherapeutische drugs zijn diep beïnvloed door de fysisch-chemische omstandigheden in de tumor, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

We zijn dankbaar voor Katrine Franklin Mark en Annette Bartels voor uitstekende technische hulp en om Asbjørn Nøhr-Nielsen voor het uitvoeren van de experimenten in figuur 1D. Dit werk werd gefinancierd door de Stichting Willumsen, de Novo Nordisk Foundation, en de Fondation juchum (all to SFP).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-(4-amidinofenyl)-1H-indol-6-carboxamid (DAPI)Invitrogen# C10595 Voor het kleuren van kernen
5-Fluorouracil (5-FU)Sigma-Aldrich#F6627Component in chemotherapeutische behandeling
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)Life Technologies#E3111Remmer van NHE1
Antilichaam tegen PARP en cPARPCell signaling#9542Gebruikt in western blotting
Antilichaam tegen Ki-67Cell signaling#9449Gebruikt voor IHC
Antilichaam tegen p53Cell Signaling #2524 Gebruikt voor IHC
Antilichaam tegen β-actineSigma A5441Gebruikt in western blotting
BactoagarBD Bioscience#214010Gebruikt voor agarose gel voorbereiding
Benchmark eiwitladderInvitrogen#10747-012Gebruikt voor SDS-PAGE
Bio-Rad DC Eiwit Assay kitBio-Rad Laboratories#500-0113, #500-0114, #500-0115  Gebruikt voor eiwit bepaling uit lysaten
Bürker kamerMarienfeld610311Voor celtelling 
BX63 epifluorescentiemicroscoopOlympusGebruikt voor fluorescerende beeldvorming
CellTiter-Glo 3D Cel Levensvatbaarheid AssayPromega#G9681Gebruikt voor de cel levensvatbaarheidstest
CisplatinSigma-Aldrich#P4394 Component in chemotherapeutische behandeling
Corning Spheroid Microplate, 96 putjes, Zwart met heldere ronde bodem,  Ultra-lage hechting, Met deksel, SterileCorning#4520Gebruikt voor het laten groeien van sferoïden met luminescentiemetingen als eindpunt
Corning 96 putjes, heldere ronde bodem,  Ultra-lage hechting microplate, Met deksel, SterileCorning#7007Voldoende voor sferoïdgroei zonder luminescentiemetingen als eindpunt
Criterion TGX Precast GelsBio-Rad5671025Gebruikt voor SDS-PAGE
DoxorubicinAbcam#120629Component in chemotherapeutische behandeling
FLUOStar Optima Microplate lezerBMG LabtechGebruikt voor het opnemen van luminescentie 
Formaldehyde VWR Chemicals #9713.1000 Gebruikt voor celfixatie
Geltrex LDEV-vrij Gereduceerde Groei Factor Basement Membraan MatrixGibco#A1413202Bij 4 °C bewaren om verharding te voorkomen. Aangeduid als rBM in het protocol.
Verhit-geïnactiveerde FBSSigma#F9665Serum voor groeimedia
ImageJNIHWetenschappelijke beeldanalyse
Medim Uni-safe cassetteMedim Histotechnologie10-0114Gebruikt voor opslag van ingebedde sferoïden
Mini protease inhibitor cocktail tablettenRoche Diagnostics GmBH # 11836153001Gebruikt voor lysis buffer voorbereiding
MZ16 microscoopLeicaGebruikt voor lichtmicroscopische beelden
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer Invitrogen#NP0007Gebruikt voor western blotting
Pierce ECL Western blotting substraatThermo scientific#32106Gebruikt voor western blotting
Ponceau SSigma-Aldrich#P7170-1LGebruikt voor proteïnebandkleuring
Prism 6.0GraphpadWetenschappelijke grafiek en statistische software
Propidiumjodide (1mg/ml oplossing in water)Invitrogen P3566Licht gevoelig 
Steriele reservoirs, multikanaalsSPL lifesciences21002Gebruikt voor het zaaien van cellen voor sferoïdvorming
Superfrost Ultra-Plus Adhesie schuif Menzel-Gläser#J3800AMNZMicroscoopglasplaatje gebruikt voor inbedding
TamoxifenSigma-Aldrich#T5648Gebruikt als chemotherapeutische behandeling
Trans-blot Turbo 0,2 µm nitrocellulose membranenBio-Rad#170-4159Gebruikt voor western blotting
Tris/Glycine/SDS draaiende buffer Bio-Rad #161 0732Gebruikt voor SDS-PAGE
Trypsin-EDTA oplossingSigma#T4174 Celdissociatie enzym

Referenties

  1. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  2. Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
  3. Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
  4. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293(2008).
  5. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  6. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  9. Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
  10. Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
  11. Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
  12. Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45(2016).
  13. Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
  14. Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
  15. Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
  16. Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
  17. Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
  18. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  19. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  20. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218(2012).
  21. Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
  22. Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
  23. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  24. Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
  25. Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
  26. Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
  27. Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
  28. Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
  29. Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
  30. Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
  31. Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. Cancer Drug Resistance. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).
  32. Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
  33. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  34. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  35. Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039(2017).
  36. Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
  37. Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963(2017).
  38. LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
  39. Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
  40. Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51(2013).
  41. Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
  42. Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

3D-sferoïdkweeklevensvatbaarheid van kankercellenbeoordeling van celdoodscreening van antikankermiddelentumormicro-omgevinghand-dropmethodeimmunohistochemische embeddingpropidiumjodide-kleuringZ-stack-beeldvormingeffecten van rBM-concentratie
Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en de dood in 3D sferoïde culturen van kankercellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.