Met behulp van zebravis larven om de pathologische gevolgen van hemorragische beroerte studie

Summary

Hier presenteren we een protocol om hersenletsel te kwantificeren, bewegings tekorten en neuroinflammation na bloeden in de hersenen in zebravis larven, in de context van de menselijke intracerebrale bloeding (ICH).

Abstract

Ondanks het feit dat de meest ernstige subtype van een beroerte met een hoge wereldwijde sterfte, is er geen specifieke behandeling voor patiënten met intracerebrale bloeding (ICH). Modellering ICH pre-klinisch heeft bewezen moeilijk, en de huidige knaagdieren modellen slecht recapituleren de spontane karakter van de menselijke ICH. Daarom is er dringend behoefte aan alternatieve preklinische methodologieën voor de studie van ziektemechanismen in ICH en voor mogelijke drugs ontdekking.

Het gebruik van zebravis vertegenwoordigt een steeds populairder wordende benadering voor translationeel onderzoek, hoofdzakelijk wegens een aantal voordelen die zij over zoogdier modellen van ziekte hebben bezitten, met inbegrip van productieve reproductie tarieven en larvale transparantie toestaand voor levende Imaging. Andere groepen hebben vastgesteld dat zebravis larven kunnen spontane ICH vertonen na genetische of chemische verstoring van cerebrovasculaire ontwikkeling. Het doel van deze methodologie is om dergelijke modellen te gebruiken om de pathologische gevolgen van hersenbloeding te bestuderen, in het kader van pre-klinisch ICH-onderzoek. Door het gebruik van Live Imaging en beweeglijkheid assays, hersenbeschadiging, neuroinflammation en bewegings functie na ICH kan worden beoordeeld en gekwantificeerd.

Deze studie toont aan dat de belangrijkste pathologische gevolgen van hersenbloeding bij de mens worden bewaard in zebravis larven markeren het modelorganisme als een waardevol in vivo systeem voor pre-klinisch onderzoek van ICH. Het doel van deze methodologie is om de pre-klinische beroerte Gemeenschap om de zebravis larvale model in dienst als een alternatief complementair modelsysteem voor knaagdieren.

Introduction

Intracerebrale bloeding (ICH) is de meest ernstige sub-type beroerte geassocieerd met spontane cerebrale schip scheuren en bloeden in de parenchym leidt tot hersenbeschadiging, lichamelijke handicap en vaak de dood¹. Ondanks de hoge sterfte en morbiditeit in verband met ICH², is het begrip van de onderbouwde etiologie en post-bloeding pathologie nog steeds ontbreekt. Als dusdanig, zijn er geen specifieke behandelingen om ICH te verhinderen of geduldige resultaten te verbeteren. De meeste van ons begrip van de ziekte biologie is afkomstig van pre-klinische knaagdieren modellen vanich³, maar studies to-date in deze modellen hebben nagelaten om een succesvolle therapeutische vertalen naar de kliniek^4,5. Deze mislukking kan deels te wijten zijn aan een aantal beperkingen van deze preklinische modellen, met inbegrip van het onvermogen om gemakkelijk recapituleren de spontane aard van de menselijke ziekte en de eis voor invasieve chirurgie om de modellen te genereren in zoogdieren⁶. Bovendien, knaagdieren poseren praktische problemen met betrekking tot het observeren van de snelle aanvang van cellulaire reacties op ICH in intact weefsel. Gezien het ontbreken van de vertaling van knaagdieren modellen, het ontwikkelen van alternatieve modellen van spontane ICH is noodzakelijk als we deze praktische problemen te overwinnen en helpen bij het identificeren nieuwe drug targets.

De moleculaire mechanismen van vasculaire ontwikkeling zijn goed geconserveerd onder gewervelde dieren met inbegrip van zebravis (Danio rerio)⁷. Als dusdanig, wordt de goedkeuring van dit modelorganisme een steeds nuttigere mechanistische strategie voor het bestuderen van cerebrovasculaire ziekte⁸. Een aantal zebravis modellen zijn gegenereerd die recapituleren fenotypes geassocieerd met Stroke-gerelateerde voorwaarden^9,10,11,12. Het gebruik van zebravis larven om ziekte pathogenese te onderzoeken biedt zowel praktische als wetenschappelijke voordelen ten opzichte van zoogdier modellen⁸. Dit omvat hoge reproductie tarieven, snelle ontwikkeling en larvale transparantie die het mogelijk maakt voor intravital Imaging zonder de invasieve beperkingen in verband met knaagdieren. Koppeling van deze voordelen met het brede scala van transgene reporter lijnen beschikbaar binnen de zebravis onderzoekgemeenschap bedraagt een krachtige in vivo aanpak voor het bestuderen van de ziekte biologie, nog niet gebruikt voor het bestuderen van de pathologische gevolgen van ICH.

De verwondings reactie op bloed in de hersenen is bifasische¹³; de primaire belediging veroorzaakt neuronale dood en cel necrose, die vervolgens initieert een secundaire Golf van schade die wordt veroorzaakt door ingeboren immuunsysteem activering. De tweede fase van hersenletsel, in het bijzonder de neuroinflammatory component, wordt beschouwd als een realistische doelstelling voor de toekomstige behandeling van drugs¹³. Spontane en cerebrale-specifieke bloedingen zijn beschreven in zebravis larven eerder^{14,15,16,17,18,19}. Twee van dergelijke modellen zijn het gebruik van Atorvastatine (ATV) op 24 h post-fertilisatie (HPF) om de HMGCR pathway en cholesterol biosynthese¹⁴remmen, en een bubblehead (BBH) mutant die een hypomorphic mutatie in het arhgef7 gen, βpix te uiten, en remt vervolgens actine remodeling voor strakke endovasculaire verbindingen¹⁸. Deze modellen vertonen spontane cerebrale-specifieke bloedvaten scheuren bij het begin van de circulatie (~ 33 HPF). Onlangs hebben we gekenmerkt deze modellen verder te onthullen dat de belangrijkste aspecten van de hersenletsel reactie is geconserveerd tussen de mens en zebravis larven²⁰. Deze studie toont de methodologie die nodig is om spontane hersenbloedingen te verkrijgen en te visualiseren in zebravis larven en hoe hersenletsel te kwantificeren, en bewegings en neuroinflammatory fenotypes die betrekking hebben op de menselijke conditie. Deze gegevens en technieken ondersteunen het gebruik van deze modelsoorten als een waardevol complementair systeem voor pre-klinisch ICH-onderzoek.

Protocol

Zebravis werden opgeheven en werden gehandhaafd bij de Universiteit van Manchester biologische diensten eenheid onder standaard voorwaarden zoals eerder beschreven²¹. Adult zebravis veeteelt werd goedgekeurd door de Universiteit van Manchester dierenwelzijn en ethische Review Board. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met U.K. Home Office Regulations (PPL: P132EB6D7).

Opmerking: transgene lijnen die in deze studie worden gebruikt omvatten macrofagen-specifieke Lineage MPEG1:mCherry (gebouwd in-House zoals eerder beschreven²²), neutrofiele-specifieke MPO:GFP²³,erythroid-specifieke gata1: dsRed²⁴ en alomtegenwoordige:secAnnexinV-mVenus, een verslaggever voor celdood (re-afgeleid in huis²⁵)op wild-type, parelmoer (mitfa^W2/W2) en Mutant (BBH^m292) achtergronden. Figuur 1 toont de experimentele tijdlijn.

Figuur 1 : Afbeelding van experimentele tijdlijn om hersenletsel, bewegings en neuroinflammatory uitkomsten te karakteriseren. ICH, intracerebrale bloeding; BBH, bubblehead. Figuur is gereproduceerd uit Crilly et al.²⁰ met toestemming onder een Creative Commons licentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

1. dag 0: productie en inzameling van eieren

1. Verzamel bevruchte embryo's van natuurlijke paaien in kweek dozen, geproduceerd uit 1 mannelijke en 1-2 vrouwelijke volwassen zebravis.
   Opmerking: voor Atorvastatine protocol alle wild type/transgene dieren kunnen worden gebruikt echter bloeding verschillen enigszins tussen de stammen.
2. Incubeer 100 embryo's bij 28 °C in standaard E3 embryo medium per Petri schaaltje en fase volgens standaard richtlijnen²⁶.
3. Op ~ 6 uur na de bevruchting (HPF) verwijderen van dode en onbevruchte embryo's van de schotel met behulp van een Pasteur pipet.

2. dag 1: Atorvastatine behandeling op 24 HPF

1. Dechorionate embryo's voor Atorvastatine behandeling met behulp van scherpe ultra dunne dissectie Tang²⁷. Nummers die nodig zijn voor experimenten kunnen dienovereenkomstig worden aangepast.
2. Voeg 30 mL E3 embryo medium toe aan twee schone Petri schalen. Gebruik een schotel voor 100 embryo's.
   Opmerking: als platen zijn ontworpen voor de cel cultuur, dechorionated zebravis in dit vroege stadium vaak vasthouden aan de bodem. Om dit te voorkomen, spoel de platen grondig in schoon water voor gebruik.
3. Verwijder 60 µ L van het embryo water van de behandelings plaat en voeg 60 µ L van 0,5 mM atorvastatin (ATV) toe. Op een 0,5 mM voorraad concentratie, de bovenstaande verdunning zal resulteren in een definitieve concentratie van 1 µ M, die zal resulteren in ~ 20% van de larven niet-hemorragische (ICH-) en ~ 80% van de larven bloedde (ICH +). Gebruik de andere plaat voor onbehandelde controles
   Opmerking: Atorvastatine is solubilized in gedistilleerd water (3 mg in 10 mL) om een 0,5 mM voorraad oplossing te maken. Incubeer overnachting bij kamertemperatuur in het donker met agitatie als oplosbaar maken duurt enige tijd. Volledige oplosbaar maken kan tot 1 week duren. Gebruik geen DMSO. Oplossing wordt gepaard en opgeslagen bij-20 °C. Ontdooi niet bevriezen.
4. Met behulp van een Pasteur Pipet, Transfer 100 embryo's in zo weinig mogelijk water naar de behandeling platen.
5. Incubeer de platen bij 28 °C.
   Opmerking: ICH treedt op tussen 33 en 48 HPF. Atorvastatine hoeft niet te worden verwijderd als incubatie langer dan 24 h veroorzaakt geen verdere ontwikkelingsproblemen.

3. dag 2: het scheiden van ICH-en ICH + populaties op 50 HPF

1. Aparte ICH + Fish van ICH-populaties en transfer naar nieuwe gerechten voor het gemak.
   1. Als het gebruik van de ATV-model op een concentratie van 1 µ M, 75-100% van de larven zal vertonen bloeding (ICH +) op dit moment punt.
      Nota: de reactie van de larven verschilt tussen spanningen, als de larven niet bij de gewenste frequenties bloeden, een verse partij van Atorvastatine of een hogere concentratie gebruiken. Als larven niet hebben tentoongesteld bloeding door 48 HPF dan beschouwen ze ICH-.
   2. Bij gebruik van de BBH model, zullen alle homozygous mutanten vertonen bloeding door 48 HPF. Als het gebruik van een zygoot incross, de ICH-zygoot en wild type broers en zussen kunnen worden gebruikt als controledieren voor experimenten.
2. Indien nodig, anaesthetize de larven door toevoeging van 0,02% MS222 aan de E3 media. Met behulp van een Pasteur Pipet, Sorteer de larven voor de aanwezigheid van bloed in het hoofd in verse E3 media. Zie Figuur 2.
   Opmerking: bloed in het hoofd kan verschijnen in de voorgrond, mid of achterhersenen of in combinatie, en bloeden volume kan variëren tussen dieren. In de BBH mutanten, ICH wordt vaak geassocieerd met ernstige oedeem herkenbaar door grotere hoofden, bredere ruimte tussen de ogen en een meer diffuse bloeden. Nochtans niet alle ICH + BBH larven tentoongesteld voorwerp oedeem.

Figuur 2 : Ich + hersenbloeding fenotypes. Voorbeelden van larvale ICH fenotypes gehandhaafd op een transgene gata1: DsRed reporter parelmoer achtergrond waargenomen met een helderveld stereomicroscoop (top panelen) en fluorescentie (onderste paneel) op ~ 48 h post-fertilisatie. Er werden geen bloedingen waargenomen in ICH-larven (linkse panelen). Een duidelijke accumulatie van rode bloedcellen in de forebrain en achterhersenen (pijlen) werden waargenomen in ICH + larven (rechter panelen). Schaal balken vertegenwoordigen 250 µm. figuur is overgenomen uit Crilly et al.²⁰ met toestemming onder een Creative Commons licentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

4. dag 3: celdood en leukocyten analyse op 72 HPF

1. Het scherm van de larven met behulp van een fluorescentiemicroscoop om de expressie van fluorescerende eiwitten te waarborgen.
   Opmerking: in deze studie, transgene alomtegenwoordige: SecAnnexinV-mVenus larven werden gebruikt om de hersenen celdood en dubbele transgene MPOrapport: GFP; MPEG1: mCherry of alomtegenwoordige: secAnnexinV-mVenus; MPEG1: mCherry gebruikt voor leukocyten analyse.
2. Vul de lightsheet montagekamer met E3 media met 0,02% MS222.
3. Anaesthetize de larven met behulp van 0,02% MS222. Breng de larven voor montage (n = 1-6) naar een droge Petri schaal oppervlak in één druppel. Verwijder zo veel mogelijk vloeistof.
   Nota: 1,5% lage smelting agarose wordt voorbereid gebruikend 0,15 g van lage smelting agarose opgelost in 10 mL van E3 middel zonder methyleenblauw in een microgolf en gehouden bij 45 °C tot gebruik.
4. Voeg een druppel van 1,5% laag-smelt agarose (gehandhaafd als vloeistof in een 45 °C warmte blok) aan de larven en met behulp van een 800 µm montage capillaire, en trek de larven omhoog hoofd eerst. Als het plaatsen niet nauwkeurig is kunnen de larven van agarose worden verdreven en opnieuw worden opgezet. Laat het capillair afkoelen voordat u in de lightsheet kamer.
   Opmerking: als alternatief kan een confocale Microscoop worden gebruikt voor deze procedure. Voor dit, zouden de larven lateraal in agarose op een glasbodem schotel moeten worden opgezet.
5. Verwerven z-stack beelden van het hoofd tussen de ogen lenzen (~ 300 µm) en het proces om maximale intensiteit projectie beeld.
   1. Analyseer hersen regio van beelden verzameld voor het totale aantal fluorescentie cellen en de totale intensiteit fluorescentie²⁰.
6. Maak een time lapse video van meerdere projectie composieten meer dan 18-24 h te volgen leukocyten mobiliteit en interactie met stervende cellen.
   Nota: als de lange termijn levende weergave wordt uitgevoerd, wordt slechts één larve opgezet in het capillair.
7. Wanneer de beeldvorming is voltooid verdrijven de larven van de montage capillaire in een dodelijke overdosis van 4% MS222 tot euthanaseren.

5. dag 3: het selecteren van larven voor beweeglijkheid assay op 72 HPF

1. Anaesthetize larven in de petrischalen met 0,02% MS222.
2. Kies willekeurig n = 24 larven voor beweeglijkheid assay en overdracht in verse E3 media en laat dieren om te herstellen van verdoving.
   Opmerking: verdoving op dit punt verwijdert selectie bias voor langzame zwemmers die gemakkelijk te vangen.

6. dag 3-5: het testen van motoriek bij 72, 96 en 120 HPF

1. Transfer larven geselecteerd op 72 HPF in E3 medium zonder methyleenblauw.
   Opmerking: voor het testen op 3 DPF kunnen de larven ruime tijd om te herstellen van verdoving (> 1 uur).
2. Plaat een larve in 1 mL per put van een 24-goed plaat met behulp van een pipet.
   Opmerking: Knip het uiteinde van de pipet-tip om beschadiging van de larven te voorkomen. De grootte van de plaat kan volgens experimenteel ontwerp worden veranderd.
3. Laad platen in de camera kamer en assay beweging voor 10 min met behulp van een wit licht schrikken routine om spontane zwemmen te verhogen.
   Opmerking: zwemmen gedrag werd bijgehouden met behulp van een camera kamer en tracking software (Zie de tabel van de materialen).
4. Herhaal experiment met dezelfde larven op 96 en 120 HPF. Verplaats larven van individuele huisvesting in assay plaat naar een Petri schaaltje en Incubeer bij 28 °C tussen de assays.
5. Bij assay voltooiing, euthanaseren larven in een dodelijke overdosis van 4% MS222.

Results

Beoordeling van hersen celdood met behulp van transgene alomtegenwoordige:SecAnnexinV-mVenus resulteert in duidelijke definitieve clusters van stervende cellen in ich + larven in zowel ATV als BBH modellen die afwezig zijn in alle ich-larven (Figuur 3). Clusters wijken voor 96 HPF. Door middel van beeldanalyse, bloeden wordt geassocieerd met een significante twee-voudige toename van de totale intensiteit van de fluorescentie-signaal in de hersenen, met vermelding van gemarkeerde celdood.

Een neuroinflammatory reactie wordt geïdentificeerd in ICH + larven door significant toegenomen aantallen MPEG1 positieve macrofagen cellen in de hersenen. Het aantal van de totale MPO positieve neutrofiele cellen ook verhoogd maar dit bereikte geen statistische significantie (Figuur 4). De morfologie van het MPEG1 positieve macrofagen kan ook worden gezien om te veranderen in ich + larven als de cellen nemen een actieve, afgerond, amoeboid vorm. Deze geactiveerde afgeronde cellen kunnen ook in de loop van de tijd worden bewaakt om een verhoogde fagocyterende reactie van de alomtegenwoordige te tonen :SecAnnexinV-mVenus uitdrukken van stervende cellen in ich + larven (Figuur 5). MPEG1 positieve macrofagen exposeren vertakte processen werden gecategoriseerd als inactief.

Hersenbloeding wordt geassocieerd met een significante daling van de beweeglijkheid op 72 en 96 HPF in vergelijking met ICH-sibling controles in zowel BBH en ATV modellen (Figuur 6). De beweeglijkheid bij 120 HPF herstelt aan dichtbijgelegen basislijn niveaus. Er zijn vaak verschillen in Baseline beweeglijkheid tussen ei klauwen en stammen en dus vergelijking moet worden gemaakt om ICH-controles elke keer.

Figuur 3 : Intracerebrale bloeding (ich) in zebravis larven resulteert in een kwantificeerbare hersenletsel. (A) representatieve beelden van het hersenletsel fenotype in ich + larven (rechter panelen), in vergelijking met ich-broers en zussen (linker panelen), op 72 HPF. Helderveld beelden (onderste panelen, schaalbalk = 250 µm) tonen de aanwezigheid van hersenbloedingen (pijlen) in ICH + larven. Fluorescente microscopie werd uitgevoerd om celdood in de alomtegenwoordige te visualiseren :SecAnnexinV-mVenus verslaggever lijn (hoogste panelen, schaal staaf = 100 µm). Clusters van stervende cellen werden waargenomen in peri-hematomal regio's. De beelden werden bijgesneden aan hersenen-slechts gebieden en werden geanalyseerd voor totale groene fluorescentie intensiteit in ronde deeltjes groter dan 30 pixel in diameter (witte lijn) gebruikend de macro in supplementair dossier 1. Bkwantificering van het fluorescentie signaal in de hersenen van onbehandelde, ich-en ich + larven verkregen via het ATV-model (n = 12 per groep; 3 onafhankelijke repliceert) op 72 HPF. Significante verschillen werden waargenomen bij het vergelijken van ICH + met onbehandeld (* * p = 0,004) en met ICH-(* p = 0,03) broers en zussen. Ckwantificering van het fluorescentie signaal als voorgelezen voor annexinV binding in de hersenen van ich-en ich + larven verkregen via het bubblehead (BBH) model (n = 12 per groep; 2 onafhankelijke repliceert) op 72 HPF. Grafieken tonen SD van het gemiddelde. Een significant verschil in mVenus fluorescentie werd waargenomen tussen ICH + en ICH-Age-matched broers en zussen (* * p = 0,002). Figuur is gereproduceerd uit Crilly et al.²⁰ met toestemming onder een Creative Commons licentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4 : Intracerebrale bloeding (ich) initieert een aangeboren cellulaire immuunrespons in de zebravis larvale hersenen. Aantallen leukocyten gekwantificeerd in de hersengebieden eerder beschreven voor MPO: GFP; MPEG1: dsRed dubbele transgene larven (n = 8 per groep; 2 onafhankelijke repliceert) op 72 HPF onthult een significante toename van de macrofagen (* p = 0,01), maar niet neutrofielen (p = 0,5), in antwoord op ICH. Figuur is gereproduceerd uit Crilly et al.²⁰ met toestemming onder een Creative Commons licentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Figuur 5 : Geactiveerde macrofagen cellen tonen een fagocyterende reactie op de hersenletsel. (A) representatieve time-lapse Stills²⁰ waaruit een vertakte patrouilleren macrofagen migreren naar een annexinV positieve cel (i-VI). Stills zijn verkregen uit een reeks van beelden genomen van de hele hersenen met behulp van een 20x doelstelling. Schaalbalk vertegenwoordigt 50 µm. De macrofagen verwierf een amoeboid morfologie (v) voor phagocytosing de annexinV-positieve cel (VI, VII). Na fagocytose hervat de macrofagen een vertakte morfologie en migreert weg en de annexinV-positieve cel kan niet meer gezien worden (VIII). Vertakte macrofagen (#), annexinV positive Cell (pijl), amoeboid macrofagen (*) zijn geïndiceerd. (B) representatieve beelden van MPEG1-positieve cellen in de ich-en ich + larvale hersenen exposeren amoeboid en vertakte morfologie. Schaal balken vertegenwoordigen 50 µm.ceen verhoogd aandeel van amoeboid (fagocyterende) en een verlaagd aandeel van vertakte (inactieve) macrofagen werd WAARGENOMEN in ich + Brains in vergelijking met ich-broers en zussen. Figuur is gereproduceerd uit Crilly et al.²⁰ met toestemming onder een Creative Commons licentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Figuur 6 : Ich-geïnduceerd hersenletsel resulteert in een kwantificeerbare bewegings tekort in zebravis larven. (A) representatieve voorbeelden van de zwemmende sporen in ich-en ich + BBH larven bij 72, 96 en 120 HPF. (B) Ich + larven tentoongesteld een significante daling van de cumulatieve tijd besteed mobiel tijdens de 10 min opnameperiode op zowel 72 en 96 HPF. Significantie werd verloren op de 120 HPF tijdpunt potentieel zinspeelde op herstel van hersenletsel (n = 24 larven per groep; 3 onafhankelijke repliceert; * * * * p = 0,00006; * * p = 0,003; NS: p = 0,08). Ckwantificering van de cumulatieve tijd die is besteed aan het verplaatsen van onbehandelde en ATV-behandelde ich-en ich + larven op 120 HPF. ICH + larven tentoongesteld een significante daling van de cumulatieve tijd besteed mobiele tijdens de 10 min opnameperiode. Drie technische replica's (n = 24 larven per groep) werden gebruikt om SD te berekenen van het gemiddelde (* * * p = 0,00004, * * p = 0,0003). Figuur is gereproduceerd uit Crilly et al.²⁰ met toestemming onder een Creative Commons licentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Supplementair dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Deze studie toont aan dat ICH in zebravis larven induceert een hersenletsel reactie die recapituleert belangrijke aspecten van de menselijke conditie die systematisch kan worden getest en gekwantificeerd. Zebravis bieden een consistente en reproduceerbare model van spontane ich die zal helpen met de toekomstige drugs interventiestudies gericht op het richten van bloed-geïnduceerde hersenletsel, in plaats van het voorkomen van schipbreuk^17,28. Inderdaad, gezien de snelle aard van de ziekte begin verwant aan de klinische situatie, een dergelijke aanpak biedt spannende perspectieven voor een succesvolle vertaling in de toekomst.

Sommige beperkingen worden geassocieerd met het gebruik van zebravis larven, zoals het gebruik van een ontwikkelingssysteem en taxonomische rang, maar de praktische en wetenschappelijke voordelen van dit model moet worden beschouwd om nieuwe inzichten te bieden in ICH. Er is geen operatie nodig om een bloeding te initiëren of om cellulaire processen gedurende langere perioden na verwonding te monitoren. Hoge Fecundity van zebravis paringen genereren gemakkelijk toegankelijke en grote steekproefgrootten, en wegens de snelle ontwikkeling van de larven wordt de experimentele chronologie beduidend verminderd in vergelijking met knaagdieren studies^29,30.

Momenteel zijn deze modellen geschikt om te gebruiken voor het ophelderen van de onmiddellijke pathologische en immunologische reactie op spontane ICH in de hersenen van levende intacte dieren. Potentieel kan dit model worden aangepast voor middellange-High throughput drug schermen voor ICH therapieën, of preventief of herstel bevorderen. Als zodanig vormen de post-ICH-pathologieën die in deze studie worden voorgesteld een alternatief, complementair platform voor preklinisch ICH-onderzoek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Sigma-Aldrich	CLS3527
28 °C incubator	LMS	210
Atorvastatin	Sigma-Aldrich	PZ0001-5mg
Breeding boxes	Thoren Aquatics systems	10011
Daniovision observation chamber	Noldus	n/a
E3 medium 1x			4% Instant Ocean, 500 µL methyleenblauw in 1 L dH2O
EthoVision XT software	Noldus	version 11
Heat block	Grant-Bio	PHMT-PSC18
Instant ocean	Instant Ocean	SS15-10
Lightsheet microscope	Zeiss	Z.1
Lightsheet microscope mounting capillary	Zeiss	402100-9320-000
Low melt agarose	Promega	V2111
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	319112-100ML
Microscope	Leica	MZ95	dissectiemicroscoop
Microscope	Leica	M165FC	fluorescentiemicroscoop
MS222			4g tricainepoeder, 500 mL dH2O, 10 mL van 1 M Tris (pH 9). Breng de pH aan op ~7
P1000 pipette	Gilson	F144059M
P1000 pipette tips	Starlab	S1122-1830
Pasteur pipettes	Starlab	E1414-0300
Petri dishes	Corning	101VR20
Pipetboy	Integra Biosciences	PIPETBOY
Stripette 25ml	Corning	CLS3527
Tricaine powder	Sigma-Aldrich	A5040-25G
Tris Base	Fisher BioReagents	BP152-1
Ultra fine dissection forceps	Agar scientific	AGT502
Zen software	Zeiss	version 2.3