Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Murine model van gemetastaseerde lever tumoren in de setting van ischemie reperfusie letsel

12.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59748

⸱

30 augustus 2019

 , 
1Department of Surgery, University of Pittsburgh

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven in detail een klinisch relevante colorectale kanker Levermetastasen (CRLM) tumor model en de invloed van lever ischemie reperfusie (I/R) in tumorgroei en metastase. Dit model kan helpen om beter te begrijpen van de mechanismen onderliggende chirurgie-geïnduceerde bevordering van de lever metastatische groei.

Samenvatting

Lever ischemie en reperfusie (I/R) letsel, een gemeenschappelijke klinische uitdaging, blijft een onvermijdelijk pathofysiologisch proces dat is aangetoond dat het induceren van meerdere weefsel en orgaanschade. Ondanks de recente vooruitgang en therapeutische benaderingen, is de algehele morbiditeit niet bevredigend gebleven, vooral bij patiënten met onderliggende parenchymale afwijkingen. In het kader van agressieve kanker groei en metastase wordt vermoed dat chirurgische I/R de promotor is die de tumor recidief reguleert. Dit artikel is bedoeld om een klinisch relevante Murine model van lever I/R en colorectale Levermetastasen beschrijven. Daarbij willen we andere onderzoekers helpen bij het vaststellen en perfectioneren van dit model voor hun routineonderzoek om de effecten van lever-I/R op het bevorderen van Levermetastasen beter te begrijpen.

Inleiding

De lever is een van de meest voorkomende sites voor de ontwikkeling van gemetastaseerde ziekte1. Sterfte is bijna altijd toe te schrijven aan complicaties die gepaard gaan met tumorgroei in de lever. Bij patiënten met gemetastaseerde vaste tumoren in de lever blijft chirurgie een cruciale ingreep voor Ziektebeheersing en een mogelijke curatieve benadering. Echter, de overgrote meerderheid van de patiënten aanwezig uiteindelijk met terugkerende ziekte, voornamelijk in de lever2,3. Tijdens hepatische chirurgie, intraoperatieve bloeden is gebruikelijk, vaak noodzakelijk bloedtransfusie en verschillende technische benaderingen voor controle van bloeden, met inbegrip van vasculaire opspan methoden. Echter, dergelijke maatregelen veroorzaken hepatische ischemie/reperfusie (I/R) naar het leverweefsel. De nadelige effecten van I/R op hepatocellulaire functie zijn goed gedocumenteerd. De lever I/R beledigt inflammatoire Cascades tijdens het herstel van de bloedtoevoer via ontstekings trajecten4. Niet alleen lever I/R letsel bijdragen aan leverfalen, maar het huidige bewijs toont ook aan dat I/R letsel stimuleert tumor celadhesie, en bevordert de incidentie van metastasen vorming en de groei van bestaande micrometastatische ziekte5. We hebben eerder gemeld dat chirurgische stress induceert activering van immune cellen die niet alleen helpt bij de groei van de primaire tumor, maar vergemakkelijkt ook metastasen door het vastleggen van kankercellen in de circulatie6.

Hier beschrijven we in detail een techniek om een lever metastase muis tumor model vast te stellen. In dit model, we presenteren ook een methode voor het opwekken van hepatische ischemie reperfusie letsel die fungeert als een surrogaat naar de chirurgische stress aanwezig klinisch tijdens hepatectomies. De gecombineerde methoden van kanker injectie en hepatische I/R kunnen de ontwikkeling van CRLM met succes interpreteren bij patiënten die een primaire tumorresectie hebben ondergaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dier protocollen zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité en zijn gehecht aan de richtsnoeren van de National Institutes of Health (NIH). Instrumenten die voor elke chirurgische ingreep worden gebruikt, werden grondig gesteriliseerd.

1. initiële voorbereiding

  1. Voor het injecteren van kankercellen in de muis milt, autoclaaf en steriliseren alle instrumenten die moeten worden gebruikt tijdens de procedure.
  2. Steriliseren en/of autoclaaf een verwarmingskussen, chirurgische handschoenen, gaas, paar schaar, kleine klemmen, dilator van het vat, chirurgische pincet en een naald houder.
  3. Bereid postoperatieve analgetische (0,1 mg/kg buprenorfine) te worden toegediend na splenectomie en elke 12 h gedurende 2 dagen.

2. celcultuur

  1. Zorg ervoor dat kankercellen vrij zijn van mycoplasma besmetting met behulp van een Mycoplasma ELISA kit.
  2. Bereid een 500 ml oplossing van dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) kweekmedium bij 4 °c voor de cultuur van Murine colorectale kankercellen (MC38). De kweekmedia moeten worden aangevuld met 10% warmtegeïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 100 U/mL penicillair, 100 μg/mL streptomycine, 15 mM HEPES en 200 mM L-glutamine.
  3. Kweek kankercellen in een DNAse-en RNAse-vrije kolf (75 cm2). Incuberen de celkweek in een cel/weefsel bevoficeerde incubator met 5% CO2. Handhaven temperatuur bij 37 °C.
  4. Zodra de prolifererende cellen 90 – 100% confluency bereiken, aspireren de oude media, wassen cellen met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en behandel ze vervolgens met 1x trypsine (0,25%) om cellen uit de kolf te losmaken.
  5. Verzamel cellen in een conische buis van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 700 x g.
  6. Aspireren van de media en wassen met 1x PBS tweemaal door herhaalde centrifugeren.
  7. Ga verder met het bevestigen van de levensvatbaarheid van de cel door kleurings cellen met trypan blauwe vlek (0,4%).
  8. Respendeer cellen tot een concentratie van 1 x 106 cellen/100 μL in 1x PBS. Pipet cellen grondig om eventuele klonters te voorkomen. Houd kankercellen op ijs vóór de injectie.

3. het injecteren van tumorcellen

  1. Anesthetize 8 – 12-week-Old Male (C57BL6) muizen door het toedienen van ketamine (150 mg/kg) en xylazine (12 mg/kg) intraperitoneaal met een 1 mL 25 G (0,5 mm x 16 mm) naald.
  2. Scheer de buikhuid van de muizen met behulp van Clippers om postoperatieve infecties te voorkomen.
  3. Plaats muizen op het magnetische fixator-terugtrek systeem. Bevestig dat de muizen volledig onder het effect van anesthesie door het knijpen van een teen of de staart.
  4. Voeg zoute druppels in de ogen om droogheid tijdens de procedure te voorkomen.
  5. Schrobben van Povidon-jodiumoplossing (7,5%) aan de geschoren buikwand om de huid te desinfecteren voor het maken van een chirurgische incisie.
  6. Til de huid in eerste instantie op met de getande Tang en maak een middenlijn incisie met behulp van een chirurgische schaar. Til vervolgens de buikspier en het peritoneum op om een middenlijn incisie van ongeveer 3 cm lengte te creëren (midabdominaal tot xifoïde proces om de abdominale inhoud bloot te leggen. Wees voorzichtig om de incisie buiten het xifoïde proces niet uit te breiden om uitgebreide bloedingen te voorkomen.
  7. Plaats de hemostat aan beide zijden van de incisie en onder het xifoïde proces. Strek de buik door het trekken van de staart naar beneden en taping. Gebruik de 6-inch steriele katoenen tip applicator om de milt van het alvleesklier vetweefsel te scheiden en bloot te leggen.
  8. Voor injectie in de milt, Vortex de kankercellen om te voorkomen dat elke cel klonters.
  9. Gebruik een 0,5 mL 28 G (0,36 mm x 13 mm) insulinespuit voor injectie. Vermijd luchtbellen.
  10. Injecteer langzaam en voorzichtig 100 μL cellen in het uiteinde van de milt. Plaats een watten puntje en voeg zachte druk toe om terugstroming in de abdominale regio te voorkomen. Een geslaagde injectie kan worden waargenomen door de verandering in de kleur van de lever tijdens de injectie te identificeren.
  11. Bevochtig een steriel gaas met 1x PBS en plaats het over het ontleed gebied.
  12. Breng de muizen 15 minuten op een verwarmingskussen om de kankercellen in het systeem te laten circuleren.
  13. Om door te gaan met chirurgische ischemie en reperfusie letsel, volg de stappen 5.3-5.10.
    Opmerking: deze procedure is het bestuderen van het effect van I/R geïnduceerde oprichting van gemetastaseerde Foci.

4. splenectomie

  1. Voor het uitvoeren van een splenectomie, gebruik een hand-held cauterie apparaat. Til de milt voorzichtig op met een gladde Tang en wij de milt bloedvaten om overmatige bloedingen te voorkomen. Verwijder de milt door de vaten in de gecauteriseerde sectie te transeceren.
  2. Onmiddellijk na de procedure, sluit de incisie in een dubbellaagse patroon door eerst de spierlaag en vervolgens de huid te voeden. Gebruik 4-0 polypropyleen hechtingen voor zowel de buikwand als de huid.
  3. Voordat u de procedure op een ander dier herhaalt, desinfecteer dan alle instrumenten door ze te spuiten met 70% isopropanol of ze in een kraal bad te plaatsen.
  4. Plaats de muizen terug in de originele kooien en zoek naar tekenen van nood en postoperatieve pijn.
  5. Injecteer postoperatieve analgetische (buprenorfine 0,1 mg/kg) elke 12 h gedurende 2 dagen om postoperatieve pijn te voorkomen.

5. ischemie reperfusie letsel

  1. Na 5 dagen na de eerste laparotomie, anesthetiseren muizen door het toedienen van ketamine (150 mg/kg) en xylazine (12 mg/kg) intraperitoneaal met behulp van een 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm) naald. Volg de stappen 3.3 – 3.4.
  2. Schrobben van Povidon-jodiumoplossing (7,5%) op de geschoren buik van de muis te desinfecteren van de huid en het uitvoeren van een middellijn laparotomie zoals hierboven beschreven in stap 3,6.
  3. Met behulp van twee bevochtigde katoenen tips, beweeg voorzichtig de darm uit de holte om de bijbehorende structuren bloot, met inbegrip van de portaal ader. Dissect de lever Hilum vrij van het omringende weefsel.
  4. Til de mediaan en linker laterale lobben tegen het diafragma op. Scheid de Quadrate kwab van de linker laterale LOB door het ontleden van de lever Hilum met de veer schaar met behulp van een operatiemicroscoop om duidelijke zichtbaarheid toe te staan naar de portal Triad structuur.
  5. Plaats een klein vochtig wattenstaafje tussen de mediane LOB en de rechterlaterale LOB om voldoende ruimte te creëren voor het klemmen. Met behulp van het vat dilator Tang, zorgvuldig passeren de 10 cm draad (4,0 polypropyleen hechtmiddel) om de portal Triad op te heffen. Occlude alle structuren in de portal Triad (hepatische slagader, portaal ader, en gal duct) naar links en mediaan lever kwabben door het plaatsen van een microvasculaire klem met behulp van een micro-serverfijnen klem applicator met slot.
  6. Als de lobben niet significant blancheren, pas de klem door te verwijderen en opnieuw toe te passen.
    Opmerking: als de onmiddellijke Blancheren van de lever niet optreedt, zelfs na het opnieuw afstellen van de klem, zorgvuldig overwegen of om door te gaan met de I/R.
  7. Verwijder de kleine wattenstaafje geplaatst tussen de mediaan en rechter laterale lobben. Vervang de darm voorzichtig door de buikholte. Bedek de buikwand met een vochtig gaas (geweekt met 1x PBS) en dek af met een plastic folie om het verdampings verlies te minimaliseren.
  8. Plaats de muis op het verwarmingspaneel en breng de klem aan gedurende een periode van 60 min.
  9. Gedurende de ischemische interval, zoeken naar bewijs van ischemie letsel door het visualiseren van de bleke Blancheren van de juiste mediale en links mediale en laterale lobben.
  10. Start reperfusie door de klemmen na de periode van 60 minuten te verwijderen.
    Opmerking: het bewijs van reperfusie kan worden waargenomen door een onmiddellijke kleurverandering van de mediane en linker laterale lobben.
  11. Onmiddellijk na reperfusie, sluit de incisie met een dubbellaagse hecht patroon door eerst de spierlaag en vervolgens de huid te voeden. Gebruik de 4-0 polypropyleen hechtmiddel met behulp van een naald houder om de buikwand en de huid te sluiten.
  12. Desinfecteer alle instrumenten voordat u de procedure op een ander dier herhaalt door ze met 70% isopropanol te spuiten of in een verwarmd kraal bad te plaatsen.
  13. Plaats de muizen terug in de originele kooien en zoek naar tekenen van nood en postoperatieve pijn.
  14. Injecteer postoperatieve analgetische (0,1 mg/kg buprenorfine) elke 12 h gedurende 2 dagen om postoperatieve pijn te voorkomen.
  15. Voor lever I/R schijn muizen, voer laparotomie, Hilum dissectie en abdominale hechtingen.
    Opmerking: De rol van chirurgische stress beïnvloeding van de oprichting van Levermetastasen kan worden onderzocht door middel van twee verschillende experimentele ontwerpen. Het bovenstaande Protocol (model-1) wordt gebruikt om micro metastatische leverziekte vast te stellen en het effect van lever I/R op hun groei te bestuderen (Figuur 1a). Als alternatief kunnen lever I/R en tumor injectie gelijktijdig worden uitgevoerd (model-2) om het effect van i/r-letsel te bestuderen bij de oprichting van nieuwe gemetastaseerde Foci (Figuur 1b). Om dit te doen, Injecteer kankercellen in de milt zoals hierboven beschreven en laat ze circuleren voor 15 min. lever I/R of schijn chirurgie uitvoeren na de circulerende periode voor 60 min. Voer laterale splenectomie 60 min later, en sluit de laparotomie incisie.

6. beoordeling van uitgevoerde muizen

  1. Tijdens de chirurgische ingreep zorgen ervoor dat de muizen onder invloed van fase III anesthesie zijn door het uitvoeren van palpebrale en corneale reflex test. Aanvullende verdoving dosis moet worden gegeven op de tekenen van reflexen.
  2. Zorg voor postoperatieve analgetische (buprenorfine 0,1 mg/kg) direct na de operatie en elke 12u gedurende 2 dagen om postoperatieve pijn te voorkomen.
  3. Laat muizen 30 – 60 min van hersteltijd van anesthesie. Voortdurend monitoren van muizen en laat ze niet onbewaakt tot volledig herstel.
  4. Kijk voor nood verschijnselen zoals opgejakte rug, gesloten ogen, langzame beweging en niet-bruidegom. Behandel dienovereenkomstig totdat muizen terugkeren naar hun normale activiteit.
  5. Supplimental Care met inbegrip van vloeistoffen, warmte, Yohimbine omkering agent voor xylazine, zachte papieren handdoek beddengoed (om aspiratie te voorkomen) moet worden verstrekt na de operatie om de herstelperiode te verbeteren.

7. beoordeling van lever ischemie reperfusie letsel

  1. Onmiddellijk na het aanbrengen van de klem, zorg ervoor dat de bleke Blancheren van de mediaan en linker laterale lobben optreedt in vergelijking met de caudatus en Quadrate lobben.
  2. Beoordelen van lever ischemie letsel door het meten van serum alaninetransaminase (zout), serum aspartaattransaminase (sAST) en serumlactaatdehydrogenase (sLDH) niveaus. Het bloed kan worden getrokken uit de gezichts ader te extract serum 3 – 6 h na de inleiding van reperfusie. Voer lever histologie om het percentage tumor gebied binnen de ischemische LOB te analyseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Alle wild type (C57BL6) muizen (n = 20) werden onderworpen aan het Levermetastasen model met behulp van het hierboven beschreven protocol. Alle geïnjecteerde muizen met of zonder ischemie reperfusie letsel overleefden tot de datum van opoffering. Het schematische diagram Figuur 1a van een door kanker geïnjecteerde lever illustreert de opspanning van de portal triade (Leverslagader, portaal ader en galkanaal) die een partiële lever ischemische induceert (70%) belediging naar de mediaan en lin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het diermodel dat in dit manuscript wordt beschreven, is gebaseerd op twee belangrijke benaderingen. De eerste is om te erkennen van het vermogen van kankercellen te lokaliseren en prolifereren in de lever kwabben. De tweede is het bestuderen van het effect van hepatische ischemie reperfusie letsel invloed op de tumorgroei en metastasen. Dit model maakt de relevante studie van Levermetastasen mogelijk bij afwezigheid van secundaire metastasen in een immunocompetente muis. Het model is nuttig bij het aanpakken van de vrag...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs maken geen belangenconflicten bekend die bij dit werk horen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Sara Minemyer en Alexander Comerci voor de taalkundige revisie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle MediumLonza12-614F
Fetaal bovien serumLonza900-108
L-GlutaminGibco25030-081
PenicillineFisher scientific15-140-122
StreptomycineFisher scientific15-140-122
HEPESFisher ScientificSH3023701
TrypsineHyclonesh30042.02
Celcultuurkolf 75cm5 Cells Star658170
15ml PP Conische buisjesBioExcell41021037
Trypan Blue StainGiibco15250-061
GaasFisherbrand1376152
CautryBovieAA01
Microvasculaire klemFinescience tools18055-03
Micro-Serrefine klemapplicator met vergrendelingFine science tooslFST-18056-14
VedertangFine science tooslFST-15021-15
VaatdilaterFine science tooslFST-00276-13
Magneetfixator RetractiesysteemFine science tooslFST-18200020
Micro-Adson pincetFine science tooslFST-11019-12
Micro-Adson pincetFine science tooslFST-11018-12
4-0 polypropyleen hechtdraadEthiconK881H
NaaldhouderHarvard Apparatus72-8826
VerwarmingskussenFisher scientific1443915
HaarkapperOster559A
Povidon-jodiumoplossingMedlineMDS093945
Spuit 1ml 25GBD safety Glide305903
Insulinespuit 0,5 mlBD insulin Syringes32946
Wattenstaafje met katoenFisher Scientific23-400-101
Chirurgisch microscoopLeicaLR92240
Mycoplasma Elisa KitRoche11663925910
KetaminePutney#056344
XylazinNADA#139-236
ALT stripHeska15809554
AST stripHeska15809542
LDH stripHeska15809607
```

Referenties

  1. Riihimäki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. Patterns of metastasis in colon and rectal cancer. Scientific Reports. 6 (1), 29765(2016).
  2. Oki, E., et al. Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis. Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).
  3. Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
  4. van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).
  5. Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations. Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).
  6. Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
  7. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. Journal of Visualized Experiments. (10), 484(2007).
  8. Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).
  9. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9 (1), 29(2009).
  10. Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Saëc, P. R. emaud-, Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
  11. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  12. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Leverischemie-reperfusieColorectale levermetastasenAfklemmen van de vena portaeInjectietechniek in de miltEffecten van chirurgische stressGroei van metastatische tumorenOcclusie van leverkwabbenCirculatie van kankercellen
Murine model van gemetastaseerde lever tumoren in de setting van ischemie reperfusie letsel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.