Hier presenteren we een protocol van volwassen muizen Terminal falalanx amputatie om de vorming van zoogdieren blastema en intramembraneuze ossificatie te onderzoeken, geanalyseerd door fluorescerende immunohistochemie en sequentiële in-vivo microcomputer tomografie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Volwassen muis cijfer amputatie en regeneratie: een eenvoudig model om de vorming en Intramembraneuze ossificatie van zoogdier Blastema te onderzoeken
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier presenteren we een protocol van volwassen muizen distale terminale falanx (P3) amputatie, een procedureel eenvoudig en reproduceerbaar zoogdier model van epimorfe regeneratie, dat blastema-vorming en intramembraneuze ossificatie omvat, geanalyseerd door fluorescentie immunohistochemie en sequentiële in-vivo microcomputer tomografie (μCT). De zoogdier regeneratie is beperkt tot amputaties die het distale gebied van de terminale falanx (P3) dwars doorkruisen; cijfers geampuleerd op meer proximale niveaus niet te regenereren en ondergaan fibrotische genezing en littekenvorming. De regeneratie respons wordt gemedieerd door de vorming van een proliferatieve blastema, gevolgd door botregeneratie via intramembraneuze ossificatie om de geampuleerde skelet lengte te herstellen. P3 amputatie is een preklinisch model om epimorfe regeneratie bij zoogdieren te onderzoeken, en is een krachtig hulpmiddel voor het ontwerpen van therapeutische strategieën om fibrotische genezing te vervangen door een succesvolle regeneratieve respons. Ons protocol maakt gebruik van fluorescentie immunohistochemie op 1) Identificeer vroege en late blastema celpopulaties, 2) Bestudeer revascularisatie in de context van regeneratie, en 3) onderzoek intramembraneuze ossificatie zonder de noodzaak van complexe botten stabilisatie apparaten. We demonstreren ook het gebruik van sequentiële in-vivo μCT om afbeeldingen met een hoge resolutie te maken om morfologische veranderingen na amputatie te onderzoeken, en om volume-en lengte veranderingen in hetzelfde cijfer te kwantificeren tijdens de regeneratie. Wij geloven dat dit protocol een enorm nut biedt om zowel epimorfe als weefsel regeneratieve reacties bij zoogdieren te onderzoeken.
Inleiding
Zoogdieren, met inbegrip van mensen en muizen, hebben de capaciteit om de toppen van hun cijfers te regenereren na distale amputatie van de Terminal falanx (P3)1,2,3. Bij muizen is de regeneratie reactie amputatie-niveau afhankelijk; in toenemende mate van proximale cijfers wordt een geleidelijk verzwakte regeneratieve respons weergegeven totdat volledig regeneratief falen bij amputaties Romeinse en proximale naar de P3-nagel matrix4,5,6 , 7 ,<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dier gebruik en-technieken waren in overeenstemming met de standaardwerk procedures van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van Texas A & M University.
1. volwassen muis Hind ledemaat distale P3 amputatie
- Anesthetiseer een 8 tot 12 week oude cd-1 muis (tabel met materialen) met behulp van Isofluraan gas in zuurstof; aanvankelijk anesthetiseren bij 3% in een kamer, gevolgd door 2% Isofluraan geleverd door een neuskegel over de duur van de operatie. Breng oftalmische zalf aan op de ogen om droogheid te voorkomen onder anesthesie.
Opmerking: De volwassen P3-amputatie studies gest....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Volwassen muis regenereert P3-cijfers bij 6/7 DPA(afbeelding 2a-D), 9 DPA(figuur 2e-H) en 10 DPA (figuur 2i-L) waren immunogekleurd met antilichamen tegen Runx2, OSX en pcna om intramembraneuze botten te visualiseren en immunobevlekt met antilichamen tegen CXCR4 en vWF om de vorming van blastema te visualiseren. Representatief μCT-weergave van de cijfers die zijn gescand vóór de amp.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde procedure van volwassen muis distale P3 amputatie, fluorescerende immunohistochemische kleuring om blastema vorming en intramembraneuze ossificatie te visualiseren en te onderzoeken, en sequentieel in-vivo μCT scanning om Identificeer botmorfologische, volume-en lengte wijzigingen na amputatie. P3-amputatie is een uniek, procedureel eenvoudig en reproduceerbaar model om een Pro-regeneratieve wondomgeving te analyseren die blastema-vorming activeert. Bovendien biedt het P3-ci.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken de leden van het Muneoka Lab en het Texas Institute for genomic Medicine (TIGM). Dit werk werd gesteund door Texas A & M University.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Klaar voor gebruik |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 verdunning |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 verdunning |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 verdunning |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 verdunning |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 verdunning |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 verdunning |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 verdunning |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 verdunning |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Klaar voor gebruik |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Klaar voor gebruik |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Klaar voor gebruik |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12 weken oud |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
Referenties
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
