Meting van BK-polyomavirus niet-coderende controle regio gedreven transcriptionele activiteit via Flowcytometrie

Summary

In dit manuscript wordt een protocol gepresenteerd voor het uitvoeren van FACS-based meting van de transcriptionele activiteit van BK-polyomavirus door gebruik te maken van HEK293T cellen met een bidirectionele reporter plasmide die tdTomato en eGFP uitdrukt. Deze methode maakt het mogelijk om de invloed van nieuwe verbindingen op virale transcriptie kwantitatief te bepalen.

Abstract

Polyomavirussen, zoals het BK-polyomavirus (BKPyV), kunnen ernstige pathologieën veroorzaken bij immuungecompromitteerde patiënten. Echter, aangezien zeer effectieve antivirale middelen momenteel niet beschikbaar zijn, zijn methoden voor het meten van de impact van potentiële antivirale agenten vereist. Hier werd een dubbele fluorescentie reporter die de analyse van de BKPyV non-coding Control-Region (NCCR) gedreven vroege en late promotor activiteit mogelijk gemaakt om de impact van potentiële antivirale geneesmiddelen op virale genexpressie via tdTomato en eGFP te kwantificeren. Expressie. Bovendien kan door het klonen van BKPyV-NCCR-amplicons die in dit protocol voorbeeld zijn verkregen uit het bloed afgeleide DNA van immuungecompromitteerde niertransplantatiepatiënten, de impact van NCCR-rearrangementen op virale genexpressie worden bepaald. Na het klonen van de patiënt afgeleide amplicons, HEK293T cellen werden met de reporter-plasmiden, en behandeld met potentiële antivirale middelen. Vervolgens werden de cellen onderworpen aan FACS-analyse voor het meten van de gemiddelde fluorescentie intensiteiten 72 h post transfectie. Om ook de analyse van geneesmiddelen die een potentiële celcyclus remming van effect te testen, alleen getransffecteerd en dus fluorescerende cellen worden gebruikt. Aangezien deze test wordt uitgevoerd in een groot T-antigeen dat cellen uitdrukt, kan de impact van vroegtijdige en late expressie op een wederzijds onafhankelijke manier worden geanalyseerd.

Introduction

Polyomavirussen vertegenwoordigen een onafhankelijke familie van kleine dubbel-gestrande DNA (dsDNA) virussen met het Simian virus 40 (SV40) als prototype soort. De primaire infectie treedt voornamelijk op tijdens de kindertijd, die meestal doorgaat zonder ziektesymptomen en meestal latente infecties veroorzaken in immuun competente hosts. Het BK-polyomavirus (BKPyV) blijft voornamelijk bestaan in nierbuisjes cellen zonder nefropathologieën, echter, in geval van aantasting van de immuun-competentie na niertransplantatie het virus kan reactiveren en veroorzaken ernstige schade en verminderde transplantaat functie bij het bereiken van een hoge hersenen (1 x 10⁴ bkpyv DNA-kopieën/ml)^1,2. Bij ongeveer 10% van de niertransplantatie ontvangers resulteert reactivering van het BK-polyomavirussen (bkpyv) in een met polyomavirussen geassocieerde nefropathie (pyvan), die tot 80% geassocieerd met een hoog risico op renale allotransplantaat storingen^3,4 . Aangezien er geen goedgekeurde antivirale middelen beschikbaar zijn, is de huidige therapie gebaseerd op de reductie van immunosuppressie. Interessant, mTOR-remmers lijken te hebben een antivirale effect; Zo kan het overschakelen van de immunosuppressieve therapie op mtor-gebaseerde immunosuppressie een alternatieve benadering zijn om progressie van de bkpyv hersenen^5,6,7te voorkomen. Echter, het mTOR gebaseerde antivirale mechanisme is momenteel nog niet volledig begrepen. Daarom zijn methoden vereist voor het meten van de impact van potentiële antivirale middelen in klinisch relevante concentraties.

Het circulaire genoom van de BKPyV bestaat uit ongeveer 5 KB die een niet-coderende controle regio (NCCR) verveelt die dient als een bron van replicatie en tegelijkertijd een bidirectionele promotor die de uitdrukking van vroege en late fase mRNA transcripten besturen. Aangezien spontaan voorkomende nccr-herschikkingen, verwijderingen en duplicaties worden aangetroffen in pathogene bkpyv⁸ en aanzienlijk worden opgehoopt bij patiënten die lijden aan pvan^5,9, een vergelijking van archetypische (WT) en Re-gerangschikte (RR) NCCR-activiteiten zijn nuttig om virale replicatieve fitness te karakteriseren.

Zoals samengevat in Figuur 1, beschrijft dit protocol een veelgebruikte methode om de BKPyV nccr-transcriptionele activiteit te meten door de fluorescentie van twee fluoroforen tdTomato en EGFP te kwantificeren, uitgedrukt door een reporter plasmide^{5, 9,10,11}. De procedure wordt uitgevoerd in de aanwezigheid van het SV40 grote T-antigeen (lTAg), die het mogelijk maakt om de impact van potentiële antivirale middelen op de vroege en late NCCR-activiteit afzonderlijk te analyseren⁵. Deze assay analyseert verder de impact van herschikkingen op de nccr-activiteit en vergelijking met WT-nccrs^5,9. De reporter plasmide herbergt het SV40 late polyadenylatie signaal stroomafwaarts van elk de open reading frame om te zorgen voor een vergelijkbare en efficiënte verwerking van beide transcripten voor respectievelijk tdtomato en EGFP. Vergeleken met QRT-PCR-gebaseerde methoden^5,12, vertegenwoordigt deze op FACS gebaseerde aanpak een laaggeprijsde en hoge doorvoer compatibel alternatief omdat geen ingewikkelde extractie protocollen voor geïnfecteerde celcultuur en geen dure Er zijn antilichamen voor immuun fluorescentie kleuring nodig. Bovendien, aangezien een bepaalde hoeveelheid fluorescerende cellen wordt geanalyseerd via Flowcytometrie, is de analyse van celcyclus remmende middelen ook mogelijk op een kwantitatieve manier.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van menselijk onderzoek zoals goedgekeurd door de ethiek Committee van de medische faculteit van de Universiteit van Duisburg-Essen (14-6028-Bo).

1. verzameling van bloed-of urine monsters en isolatie van polyomavirussen-DNA

1. Verzamel ten minste 3 mL bloed in EDTA-buisjes of urine in acquisitie buisjes.
2. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 2.500 x g . Indien nodig, Pipetteer plasma in een nieuwe buis en bewaar de plasma monsters gedurende meerdere dagen bij 4 °C of Vries bij-20 °C voor langere opslag.
3. Bereid 40 μl proteïnase K in een micro centrifugebuis van 1,5 ml en voeg met Pipetting 400 μl plasma toe.
4. Lyse het monster door toevoeging van 400 μL lysisbuffer, Vortex voor 15 s, en incuberen gedurende 10 min bij 56 °C.
5. Isoleer het DNA met behulp van een DNA bloed extractie Kit zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Kort, voeg alcohol toe en laad de lysaten op een spin kolom met een DNA bindend membraan op basis van silica. Was de kolommen meerdere malen om puur DNA te leveren.
6. Het opgeleverd DNA in 30-50 μL te buffer te Elderen.

2. versterking van het niet-coderings controlegebied (NCCR)

1. Voer de volgende procedure uit in fysiek gescheiden ruimten. Gebruik een geïsoleerde ruimte om de reagentia voor te bereiden en verdeel de mix naar de PCR-buisjes.
2. Bereid de Master mix voor de pre-PCR met primer pair A (tabel 1) in een totaal volume van 50 μL en gebruik het eerder geïsoleerde DNA uit stap 1,6. Het Pipetteer schema voor het voorbereiden van de Master mix voor de pre-en geneste PCR wordt afgedrukt in tabel 2.
3. Verdeel 45 μL van de Master mix in de PCR-buisjes.
4. Voeg 5 μL van het geïsoleerde DNA toe aan de PCR-buisjes.
   Opmerking: gebruik een andere ruimte dan die voor de Master Mix voorbereiding om verontreiniging te voorkomen.
5. Voer de PCR uit met de reactieomstandigheden zoals geïllustreerd in tabel 3. Herhaal denaturatie, gloeien en uitbreiding in 35 cycli.
6. Voor het geneste versterkings gebruik primer paar B harkotteren de beperkings locaties voor AgeI en SpeI (tabel 1).
7. Voer de geneste PCR uit met de reactieomstandigheden zoals beschreven in de stappen 2,2 tot en met 2,5 met 5 μL van de pre-PCR.
8. Meng 10 μL van het PCR-product met 2 μL 6x gel laad kleurstof. Laad 10 μL van de mix op een 1,5% agarose gel en voer de gel gedurende 30 minuten uit bij 60 mA.
9. Visualiseer de gel met behulp van een geschikt UV-documentatiesysteem.
   Opmerking: de grootte van de ampliconlengte voor Temp is naar verwachting tussen 300-500 BP afhankelijk van of herschikkingen (verwijderingen, inserties of duplicaties) hebben plaatsgevonden (figuur 2c).
10. Reinig de PCR-amplicons met behulp van een PCR-zuiverings pakket volgens de instructies van de fabrikant. De PCR-amplicons worden in 30 μL elutie buffer elute.
11. Stuur de amplicons voor Sanger-sequencing met primer pair B.

3. klonen van de NCCR in de dubbele fluorescentie reporter

1. Verteren de gezuiverde amplicons (stap 2,10) met AgeI en SpeI voor 2 uur bij 37 °C, zoals beschreven in tabel 4.
2. Herhaal stap 2,10 en zuivert de verteerde amplicons.
3. Parallel, ook verteren de plasmide ruggengraat (1,5 μg) met AgeI en SpeI voor 2 h bij 37 ° c zoals beschreven in tabel 5. Deze stap hoeft slechts eenmaal te worden uitgevoerd. Voor volgende reacties, Vries de spijsvertering bij-20 °C.
4. Analyseer de verteerde plasmide ruggengraat op een 0,8% lage smelt agarose gel.
   Opmerking: Voer de gel niet uit met een stroom van meer dan 40 mA. De verwachte wisselplaat van het spacer gebied oorspronkelijk afgeleid van de plasmide pEX-K4 2-LTR CD3¹³ is 128 BP (figuur 2c).
5. Visualiseer DNA-fragmenten met behulp van UV-licht met lange golf (320 nm) en knip de ruggengraat band uit met een schone scalpel. Breng het low Melt gel fragment over in een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL. Vermijd lange UV-belichtingstijden om DNA-beschadiging te voorkomen.
   Opmerking: omdat een laag smelt agarose wordt gebruikt, is het niet nodig om het DNA te zuiveren voor de ligatie.
6. Verwarm de ruggengraat met het lage smelt agarose-stuk gedurende 10 minuten bij 65 °C om het gelstuk te smelten en om de 2 minuten te mengen met zachte vortexing. De gesmolten gel kan direct worden gebruikt voor ligatie.
7. Ligate de ruggengraat en de verteerde ampliconlengte voor Temp met behulp van T4 DNA ligase tijdens de nacht bij 16 ° c met behulp van het schema weergegeven in tabel 6.
8. Voer transformatie in E. coli met behulp van de heat shock methode, plaat bacteriën op lb-amp platen, en cultuur bij 37 °c gedurende de nacht.
9. Selecteer de volgende dag drie positieve klonen en bereid 's nachts E. coli culturen (5 ml lb-amp) en cultuur bij 37 °c.
10. Isoleer het plasmide-DNA met behulp van standaardprotocollen zoals elders beschreven¹⁴, voer agei en Spei digestie uit om te controleren op positieve klonen en uitsnede fragmenten te visualiseren op een 1% agarose gel. De afstandbandband (128 BP) wordt vervangen door de grotere NCCR-sequentie (300-500 BP, zie hierboven).
11. Stuur het plasmide voor Sanger-sequencing met behulp van de primer EGFP-N of primer pair B (tabel 1).
12. Aangezien mutaties spontaan kunnen optreden, vergelijkt u de sequentie resultaten met de sequentie resultaten die met de amplicon zijn verkregen. Gebruik alleen de klonen met identieke sequenties in vergelijking met de amplicon.
13. Gebruik een moleculaire Workbench-software (bijvoorbeeld freeware GENtle 1.9.4 of andere sequence-bewerkingsprogramma's) om de verkregen sequenties uit te lijnen en te bewerken (Figuur 3).
14. Start zachte 1.9.4 en importeer de DNA-sequenties door te klikken op de knop importeren (groene pijl omlaag).
15. Klik vervolgens op gereedschap en selecteer uitlijning in het menu (gebruik CTRL + G als snelkoppeling) en kies de DNA-sequenties voor uitlijning.
16. Voeg een sequentie toe aan de uitlijning door te klikken op toevoegen of verwijderen van een reeks door te klikken op verwijderen. Voeg een archetypische NCCR-consensussequentie zoals JN192438¹⁵, gebruik niet de nccr-sequentie van de vaak gebruikte Dunlop-stam¹⁶, omdat het herschikkingen en duplicaties anderen dan de archetypische bkpyv Stammen.
    Opmerking: de NCCR bevat al de translationele start codon (Figuur 3).
17. Kies een methode voor de uitlijning door te klikken op de algoritme in de werkbalk en kies Clustal W. Stel de uitlijnings parameters in op 2; gap-extensie penalty-1; kloof penalty-2 en klik op OK om de uitlijning uit te voeren.

4. voorbijgaande transfectie van HEK293T cellen met de reporter plasmide en behandeling met potentiële antivirale middelen

1. Voor het bereiden van voldoende hoeveelheden plasmide DNA voor daaropvolgende transfectie experimenten bereiden een 150 mL nacht cultuur. Isoleer het plasmide DNA met een plasmide isolatiekit. Als alternatief kunnen andere plasmide zuiverings kits worden gebruikt.
2. Zaad 1 x 10⁵ HEK293T cellen in DMEM bevattende 10% FCS, penicillaire en streptomycine (1x) per put van een 12-goed plaat 24 h voorafgaand aan de transfectie en incuberen 's nachts bij 37 ° c en 5% Co₂ om actieve proliferatie tijdens de trans fectie te behouden.
   Opmerking: cellen moeten ongeveer 80% Confluent Health zijn bij transfectie.
3. Plaats 250 μL verlaagde serum media in een steriele buis en voeg 1 μg van elke reporter plasmide DNA toe en meng zachtjes door Pipetting.
4. Voeg 3 μL van het transfectiereagens toe aan het DNA-mengsel, meng zachtjes door pipetteren en inincuberen gedurende 15 min. Verwarm het transfectie-reagens voor op de omgevingstemperatuur van 22 °c en draai zachtjes voor gebruik.
5. Voeg het mengsel drop-Wise toe aan de putjes en verdeel zachtjes naar de put.
6. Vervang na 4 uur het supernatant met vers medium dat de teststoffen en oplosmiddel controle bevat. Inincuberen bij 37 °C tot de analyse. In dit voorbeeld werden de mTOR remmers INK128 (100 ng/mL) en rapamycine (100 ng/mL) gebruikt.

5. fluorescentiemicroscopie en Flowcytometrie

1. Controleer de cellen op de rode en groene fluorescentie onder de fluorescentiemicroscoop (Figuur 4).
   Opmerking: rode en groene fluorescentie komen overeen met respectievelijk de vroege en de late BKPyV-genexpressie.
2. Na 72 h post transfectie, aspireren de supernatant en was de cellen tweemaal met 1 mL koude PBS.
3. Voeg voorzichtig 500 μL trypsine toe en draai de plaat enigszins om vroegtijdige loslating van de cellen te voorkomen. Deze stap is belangrijk om te voorkomen dat celdubbeltjes.
4. Verwijder na toevoeging de trypsine direct met dezelfde pipetpunt.
5. Inincuberen de cellen gedurende ten minste 5 min bij 37 °C.
6. Respendeer trypsinized cellen met 1 mL PBS met 3% FCS en breng de suspensie over in voorgelabelde FACS tubes.
7. Voeg DAPI (1 μg/mL) toe vóór de FACS-analyse.
8. Analyseer de cellen met behulp van een flow cytometer. Meet voor elk monster ten minste 10.000 levende cellen, die negatief zijn voor DAPI-kleuring.

6. gegevensanalyse

1. Importeer de gegevens in de flow flowcytometrieonderzoeken analyse software en voeg samples toe door te klikken en te slepen naar de werkruimte.
2. Dubbelklik op het geïmporteerde bestand en maak een grafiek plot. Kies FSC-A versus SSC-A door op de x-en y-as te klikken. Poort de belangrijkste celpopulatie door te klikken op polygoon op de werkbalk en framing van de celpopulatie (Figuur 5). Noem de gekozen celpopulatie zoals vereist (bijvoorbeeld "enkelvoudige cellen"). De "enkelvoudige cellen" wordt weergegeven als een nieuwe werkruimte.
3. Ga door met het gating van "enkelvoudige cellen" voor DAPI-negatief (d.w.z. "levende cellen"). Om levende cellen te identificeren, vergelijkt u de celpopulatie met en zonder DAPI-kleuring. In beide percelen kiest u FSC-A versus Pacific-Blue-A.
4. Klik op de rechthoek en kies de DAPI-negatieve celpopulatie, noem de gekozen celpopulatie "levende cellen", en maak een nieuw punt-plot dat FITC (eGFP) versus PE (tdTomato) weergeeft, zoals eerder beschreven.
5. Voeg kwadranten toe in "levende cellen" door Quad te kiezen uit de werkbalk. Poort de populatie door het midden van het Kwadrant naar de rand van elke populatie te slepen. De kwadranten vertegenwoordigen 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM +, 3) eGFP + tdTOM-, 4) eGFP + tdTOM +.
   Opmerking: vanwege de spectrale overlay van emissiespectra tussen FITC en PE is initiële compensatie essentieel om een onderscheid te maken tussen rode en groene signalen en om nauwkeurige resultaten te behalen.
6. Bepaal de gemiddelde fluorescentie intensiteiten (Mfi's) door met de rechtermuisknop op het Kwadrant te klikken en Statistieken toevoegente kiezen. Kies mean en klik op OK. De gemiddelde MFI wordt nu onder de populatie weergegeven in de rubriek "statistiek". Kwadranten 2 en 4 komen overeen met vroege expressie, terwijl kwadranten 3 en 4 late uitdrukking vertegenwoordigen.
7. Voeg extra replicaten op dezelfde manier toe voor statistische energie.
8. Voor gegevens interpretatie plot MFI-waarden van vroeg en laat in een staafdiagram:
9. Om NCCR-activiteiten te vergelijken die zijn verkregen van verschillende donoren of virusstammen, voegt u een archetypische controle of de Dunlop-stam¹⁶ toe en stelt u de relatieve mfi's in op 100% en berekent u de relatieve MFI-waarden. Herhaal dit met elke replicatie en bepaal het gemiddelde en de standaarddeviatie.
10. Om een effect van potentiële verbindingen op de transcriptionele activiteit te evalueren, stelt u de oplosmiddel controle in op 100% en plot de MFI van de behandelde cellen.

Results

In dit representatieve experiment werd de door de BK-polyomavirus niet-coderende controle regio gestuurde transcriptionele activiteit gemeten via Flowcytometrie. Bovendien werd een mTOR-remmer, die zou kunnen worden gebruikt voor de behandeling van patiënten na BKPyV reactivatie, getest op de remming van de virale vroege genexpressie. Hiertoe werd een dubbele fluorescentie-reporter test gebruikt zoals eerder gepubliceerd⁵. Het algemene workflowschema van de experim...

Discussion

In dit artikel wordt een veelgebruikte methode gepresenteerd die de analyse van de BKPyV non-coding Control-Region (NCCR) gedreven vroege en late Promoter activiteit mogelijk maakt. De NCCR-activiteit kan gelijktijdig worden gemeten en heeft geen lysis nodig van de getransfunteerde cellen. Bovendien kan een relatief groot aantal cellen worden geanalyseerd en is de co-transfectie van extra markers voor normalisatie van de fluorescentie waarden niet nodig.

Een essentieel onderdeel van deze metho...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp ladder	NEB	N3231	Elke ladder met een bereik tot 1 kb kan worden vervangen
2-log ladder	NEB	N0550	Elke ladder met een bereik tot 10 kb kan worden vervangen
Agar-Agar, Kobe I	Carl Roth	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
Ampicillin Natriumsalz Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	kan worden vervangen door elke fabrikant
BD FACSCanto™ II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma	10236276001
DFC450C camera module	Leica		Elke camera kan worden gebruikt
DMEM	Gibco	41966-029	kan worden vervangen door elke fabrikant
DMIL LED microscope	Leica		Elke fluorescentiemicroscoop kan worden gebruikt
DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	kan worden vervangen door elke fabrikant
E.coli DH5alpha Competent Cells	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	Elke FBS kan worden gebruikt
FlowJo v10.5.3	FlowJo, LLC		Elke flow cytometry software FBS kan worden gebruikt
Gel Loading Dye, Purple (6X)	NEB	B7024	Elke 6x ladingskleurstof kan worden vervangen
HEK293T cells	ATCC	11268	Deze cellen drukken constitutief het simian virus 40 (SV40) grote T-antigeen tot expressie, en clone 17 werd specifiek geselecteerd vanwege zijn hoge transfecteerbaarheid.
HERAcell® 240i CO2 Incubator	Thermo Scientific		kan worden vervangen door elke fabrikant
HotStar PCR kit	Qiagen	203203
Intas Gel documentation system	Intas		Elk visualisatiesysteem voor gekleurde DNA-bevattende agarose gels kan worden gebruikt
Low Melt Agarose	Biozym	850081	kan worden vervangen door elke fabrikant
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	kan worden vervangen door elke fabrikant
pBKV (34-2)	ATCC	45025	Plasmid dat het volledige genoom van BKPyV-stam Dunlop bevat; werd gebruikt als positieve controle; DNA Seq. Acc.: KP412983
PBS	Gibco	14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler	Bio-Rad	discontinued product	Elke thermocycler kan worden gebruikt
PCR Nucleotide Mix, 10 mM	Promega	#C1145	kan worden vervangen door elke fabrikant
PCR1 and PCR2 Primers	metabion	not applicable	Ontzilt. Verdun tot (10 µM) met PCR-kwaliteit water
PenStrep (100x)	Gibco	15140-122	kan worden vervangen door elke fabrikant
Roti®-GelStain	Carl Roth	3865	Een op fluorescentie gebaseerde kleurstof voor het meten van dsDNA-concentratie
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA Ligase	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
Trypsin 0.05% - EDTA	Gibco	25300-054	kan worden vervangen door elke fabrikant
ZymoPURE II Plasmid Kit	Zymo	D4201	kan worden vervangen door elke fabrikant