Het artikel beschrijft een snel protocol voor het etiketteren van bloedvaten in een Teleost vis door cardiale transfusie van DiI verdund in fixatief, met behulp van Medaka (Oryzias latipes) als een model en gericht op de hersenen en de hypofyse weefsel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Etikettering van bloedvaten in de Teleost hersenen en de hypofyse met behulp van cardiale transfusie met een DiI-fixatief
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bloedvaten innervate alle weefsels in gewervelde dieren, waardoor hun overleving door het verstrekken van de nodige voedingsstoffen, zuurstof en hormonale signalen. Het is een van de eerste organen die beginnen te functioneren tijdens de ontwikkeling. Mechanismen van de vorming van bloedvaten zijn uitgegroeid tot een onderwerp van hoge wetenschappelijke en klinische belangstelling. Bij volwassenen is het echter moeilijk om de vasculatuur te visualiseren in de meeste levende dieren als gevolg van hun lokalisatie diep in andere weefsels. Niettemin, visualisatie van de bloedvaten blijft belangrijk voor verschillende studies, zoals endocrinologie en Neurobiology. Terwijl verschillende transgene lijnen zijn ontwikkeld in zebravis, met bloedvaten direct gevisualiseerd door middel van expressie van fluorescerende eiwitten, geen dergelijke instrumenten bestaan voor andere Teleost soorten. Met behulp van Medaka (Oryzias latipes) als een model, het huidige protocol presenteert een snelle en directe techniek om de bloedvaten label in de hersenen en de hypofyse door perfusing door het hart met fixatief met DiI. Dit protocol maakt de verbetering van ons begrip over hoe de hersenen en de hypofyse cellen interageren met bloed vasculatuur in hele weefsel of dikke plakjes weefsel.
Inleiding
Bloedvaten spelen een essentieel onderdeel van het gewervelde lichaam als ze de nodige voedingsstoffen, zuurstof en hormonale signalen te verstrekken aan alle organen. Ook, sinds de ontdekking van hun betrokkenheid bij de ontwikkeling van kanker1, hebben ze veel aandacht gekregen in klinisch onderzoek. Hoewel een aantal publicaties de mechanismen hebben onderzocht die de groei en de morfogenese van de bloedvaten mogelijk maken, en een groot aantal genen belangrijk voor hun vorming zijn geïdentificeerd2, nog veel te begrijpen met betrekking tot de interactie tussen cellen of weefsels en het circulerende bloed.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren behandeling werd uitgevoerd volgens de aanbevelingen voor de zorg en het welzijn van onderzoek dieren aan de Noorse Universiteit voor levenswetenschappen, en onder toezicht van erkende onderzoekers.
1. voorbereiding van instrumenten en oplossingen
- Bereid DiI voorraad oplossing oplossen van 5 mg DiI kristal in 1,5 mL plastic buis met 1 mL 96% EtOH. Vortex voor 30 s en blijf bedekt met aluminiumfolie.
Opmerking: De DiI stockoplossing kan gedurende enkele maanden in het donker worden bewaard bij-20 °C. - Bereid de vis houder (Figuur 1a) door het sn....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol toont een stap voor stap procedure om de bloedvaten label in de Medaka hersenen en de hypofyse, en op hetzelfde moment vast het weefsel. Na etikettering door cardiale injectie van een fixatieve oplossing die DiI in het hart bevat, kunnen de bloedvaten op schijfjes worden waargenomen met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop (Figuur 4) of op geheel weefsel met behulp van een confocale Microscoop (Figuur 5). Hetzij op de dikke tissue slice of.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Cardiale transfusie met DiI eerder is gebruikt om de bloedvaten label in verschillende modelsoorten24, met inbegrip van Teleost Fish13.
Aangezien DiI rechtstreeks wordt geleverd aan het endothelial celmembraan door middel van doorbloeding in de vasculatuur, is het mogelijk om de signaal-ruisverhouding te verhogen door de DiI concentratie in de fixatie oplossing te verhogen. Bovendien, de fluorophore biedt intense kleuring wanneer opgew.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
Wij danken Dr. Medaka Kanda voor de demonstratie van cardiale doorbloeding met fixatieve oplossing in, mevrouw Lourdes Carreon G Tan voor hulp bij Medaka veeteelt, en de heer Anthony Peltier voor illustraties. Dit werk werd gefinancierd door NMBU en door de Raad van het onderzoek van Noorwegen, toelage nummer 248828 (digitaal leven het programma van Noorwegen).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE zonder naald | Sigma | Z116866-100EA | spuiten |
| BD Precisionglide spuitnaalden | Sigma | Z118044-100EA | naalden 18G (1,20*40) |
| Borosilicaatglas 10 cm OD 1,2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glaspipet |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE buis O.D 1,7 mm en I.D 1,1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Fosfaat Buffer Saline (PBS) oplossing | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipettrekker | Narishige | PC-10 | |
| Kunststof petrischalen | VWR | 391-0442 | |
| Superlijm gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
Referenties
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
