Methodenartikel

Het meten van sperma begeleiding en beweeglijkheid binnen de Caenorhabditis van het hermafrodiet-reproductieve kanaal

13.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59783

⸱

6 juni 2019

 ,  , 
1Department of Cell, Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

In dit artikel

Samenvatting

Het sperma moet met succes door de eileider navigeren om een eicel te bevruchten. Hier beschrijven we een assay voor het meten van sperma migratie binnen de C. hermafrodiet baarmoeder. Deze analyse kan kwantitatieve gegevens over sperma distributie binnen de baarmoeder na het koppelen, evenals op snelheid, richtings snelheid, en omkerings frequentie verstrekken.

Samenvatting

Succesvolle bevruchting is van fundamenteel belang voor seksuele voortplanting, nog weinig bekend is over de mechanismen die leiden tot sperma oöcyten binnen de vrouwelijke voortplantingsorganen. Terwijl in vitro studies suggereren dat sperma van intern bemesten van dieren kan reageren op verschillende signalen uit hun omgeving, het onvermogen om hun gedrag te visualiseren binnen de vrouwelijke voortplantingsorganen creëert een uitdaging voor het begrijpen van sperma migratie en mobiliteit in zijn eigen omgeving. Hier beschrijven we een methode met behulp van C. dat deze beperking overwint en maakt gebruik van hun transparante epidermis. C. de mannetjes van de kleuren van de hermafrodieten die met een mitochondrial kleurstof worden bevlekt worden gedekt met volwassene, die als gemodificeerde wijfjes handelen, en deponeren fluorescerend geëtiketteerd sperma in de hermafrodiet baarmoeder. De migratie en beweeglijkheid van het gelabelde sperma kan dan direct worden bijgehouden met behulp van een epi-fluorescentiemicroscoop in een live hermafrodiet. In wild-type dieren, ongeveer 90% van het gelabelde sperma kruipen door de baarmoeder en bereiken de bemesting site, of Spermatheca. De beelden van de baarmoeder kunnen 1 h na het koppelen worden genomen om de distributie van het sperma binnen de baarmoeder en het percentage sperma te beoordelen dat de Spermatheca heeft bereikt. Alternatief, time-lapse beelden kunnen onmiddellijk na de paring worden genomen om de snelheid van het sperma, richting snelheid en omkering frequentie te beoordelen. Deze methode kan gecombineerd worden met andere genetische en moleculaire hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor de C. Colijn om nieuwe genetische en moleculaire mechanismen te identificeren die belangrijk zijn bij het reguleren van sperma begeleiding en beweeglijkheid binnen het vrouwelijk voortplantingskanaal.

Inleiding

De moleculaire mechanismen waardoor spermatozoa (die als sperma wordt bedoeld) door het vrouwelijke voortplantingskanaal naar de eicel navigeren zijn niet goed begrepen, nog zijn fundamenteel voor seksuele reproductie. Sperma beweeglijkheid is zeer dynamisch en is afhankelijk van robuuste communicatie signalen die verandering sperma snelheid en directionele beweeglijkheid1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. C. het is een krachtig model geworden voor het bestuderen van sperma beweging in vivo omdat de transparante epidermis van de hermafrodiet het volgen van levend sperma bij één cel resolutie2,3toelaat, 8,10. Het doel van dit document is het verstrekken van methoden voor de beoordeling van sperma beweging binnen de C. hermafrodiet baarmoeder.

In diersoorten waar sperma en eicel in het externe milieu (d.w.z., aquatische milieu's) samenkomen, reageren de sperma op Chemotactische signalen die door oöcyten worden afgescheiden. Deze signalen leiden de richting van sperma beweging, waardoor ze dichter bij het signaalbron4,6,11. Nochtans, is veel minder gekend over sperma beweging in soorten die intern bevruchten. Een grote uitdaging is de architectuur van het vrouwelijke voortplantingskanaal, dat in de meeste soorten niet toegankelijk is voor microscopie. In vitro studies bij mensen, muizen, en varkens, bijvoorbeeld, leveren bewijs dat subpopulaties van sperma kan reageren op chemoattractants, vloeistof stroom, en thermische gradiënten1,5,7,9, 12. Met deze systemen, het onvermogen om te visualiseren en track sperma beweging in vivo plaatsen ernstige beperkingen op strategieën om de belangrijkste mechanismen reguleren van deze functies te ontdekken.

Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we methoden ontwikkeld met behulp van de nematode C. om sperma direct te visualiseren na inseminatie, om individuele sperma migratie parameters in vivo te meten, en om het vermogen van een sperma populatie te meten om te targeten de Bemestings plaats. Deze methoden, samen met de C. de moleculaire en genetische toolset, vergemakkelijken de ontdekking van de chemische signaalmoleculen en moleculaire machines die het gedrag van de beweeglijkheid van sperma reguleren. Bijvoorbeeld, kunnen de genetische schermen in hermafrodieten of mannetjes worden geleid om genen te identificeren die voor efficiënte sperma beweging in vivo13essentieel zijn. Moleculen kunnen worden geïnjecteerd in de hermafrodiet Gonade om te testen op effecten op sperma activatie, migratiesnelheid, en directionele beweeglijkheid3. Bovendien, de beschreven methoden kunnen worden gebruikt om te controleren Rogue sperma migratie naar buitenbaarmoederlijke lichaams locaties en de sperma wedstrijd te evalueren10,14.

C. er bestaan in de natuur als hermafrodieten en mannetjes (Zie Figuur 1). De hermafrodiet Gonade heeft twee U-vormige armen die spiegelbeelden van elkaar. Tijdens de L4 larvale stadium, de meest proximale kiemcellen (dat wil zeggen, de cellen in de buurt van de Spermatheca) ondergaan spermatogenese. Elke primaire spermatocyte voert de meiose in en produceert vier haploid spermatids. Deze spermatids worden geduwd in Spermatheca samen met eerste rijpe eicel en ondergaan spermiogenesis15. Volwassen hermafrodieten overschakelen van spermatogenese naar ooegenese. De oöcyten rijpen in een assemblagelijn mode langs de Gonade, met de meest volwassen eicel aan het proximale uiteinde van de Gonade, naast de Spermatheca. MSP-signalen van het sperma is nodig om Meiotische rijping en ovulatie16,17trigger. Mannelijk C.de, aan de andere kant, hebben een J-vormige Gonade die alleen sperma produceren. De spermatids worden opgeslagen in de rudimentaire blaasje. Bij de paring met de hermafrodiet of vrouw, de man voegt de spicules in de buurt van de staart in de vulva. Spermatids worden geactiveerd tijdens de ejaculatie, wanneer ze in contact komen met de rudimentaire vloeistof18. C. het sperma van de gegeselde niet zwemmen aangezien zij niet zijn. In plaats daarvan kruipen ze door het voortplantingskanaal, met behulp van de pseudopod voor de motoriek. Het is goed vastgesteld dat mannelijk sperma, die groter zijn in omvang, hebben een concurrentievoordeel ten opzichte van hermafrodiet sperma14.

In deze methode, mannelijke C. wordt het als spermadonor en gedekt door volwassen hermaprhodites. Volwassen mannetjes zijn gekleurd met een fluorescerende mitochondriale kleurstof te produceren geëtiketteerd sperma. Eenmaal gestort via de hermafrodiet vulva, moet het sperma kruipen rond de embryo's in de baarmoeder naar de Spermatheca, of bemesting site. De transparante epidermis van het C. model van de modellen maakt de directe visualisatie van elk individueel sperma mogelijk als het door het vrouwelijke voortplantingskanaal navigeert. In de afgelopen jaren heeft ons lab met succes gebruikt deze methode om het belang van een klasse van F-serie prostaglandines in het begeleiden van sperma van de vulva aan de Spermatheca19,20aan te tonen. De moleculaire mechansims die zijn synthese door hermafrodiet en de reactie door het sperma regeren zijn nog in onderzoek. Echter, deze methode voor de beoordeling van sperma beweeglijkheid en migratie sterk vergemakkelijkt de identificatie van de belangrijkste spelers die controle sperma en eicel communicatie in intern bemesten van dieren. Het volgende protocol beschrijft stap voor stap hoe u deze test uitvoeren.

Protocol

Opmerking: alle stappen in dit protocol worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (~ 20-22 °C) of in constante temperatuur incubators ingesteld op 16 ° c of 20 ° c. Mannelijk en hermafrodiet C. de werken worden gekweekt gebruikend standaard cultuurvoorwaarden en NA22 of OP50 E. coli als voedselbron21,22. Wild-type N2 hermafrodieten en Fog-2 (q71) mannetjes worden gebruikt in de onderstaande procedure.

1. dag 1: het plukken van L4 stadium hermafrodieten voor het koppelen

  1. Om consistente resultaten te verkrijgen, moeten alle hermafrodieten worden gesynchroniseerd als actieve reproductie van volwassenen. Kies 20-30 L4 etappe hermafrodieten tot een 6 cm gezaaide nematode groeimedium (NGM) plaat. Incubeer de hermafrodieten bij 20 °C voor 28-30 h.
    Opmerking: Slechts 12-15 hermafrodieten zal worden gebruikt voor de paring. De resterende hermafrodieten zijn surplus.

2. dag 1: kleuring van mannetjes met fluorescerende mitochondriale kleurstof (Mito-Dye)

  1. Maak een mannelijke kleurplaat door het plaatsen van een stip van E. coli (Food dot) in het midden van een ongezaaid NGM plaat. Om het voedsel dot, gebruik het einde van een glas roerstaaf te schrapen E. coli van de bacterie gazon van een gezaaide plaat en deponeren op de ongezaaide plaat. De stip moet ~ 5-7 mm in diameter.
  2. Meng 2 µ L van 1 mM Mito-Dye (Zie de lijst van materialen) in DMSO en 10 l van M9 buffer (3 g van KH2po4, 6 g van na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O tot 1 L. Voeg MgSO4 na autoclaaf). Pipet alle Mito-Dye oplossing op de voedsel stip op de mannelijke kleurplaat. Laat de plaat droog in het donker (~ 30 min).
    Opmerking: Mito-Dye is lichtgevoelig. Shield alle oplossing, platen, en wormen met Mito-Dye van licht. Bewaar de voorraad van 1 mM bij-20 °C.
  3. Pick ~ 100 1-3 dag oude volwassen mannetjes23 tot en met de Mito-kleurstof gekleurd voedsel stip op de mannelijke kleurplaat. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en broeden 's nachts bij 16 ° c. Voor het koppelen, gebruik ~ 50-60 mannetjes per 12-15 hermafrodieten. Als er meer dan ~ 100 mannetjes nodig zijn, maken meer kleurplaten om overbevolking van mannen te voorkomen.
    Opmerking: Mannetjes kunnen ook worden gekleurd door incubatie in een 10 μM Mito-Dye oplossing in M9 buffer voor 3 uur op een horlogeglas. Houd de wormen bedekt om verdamping en blootstelling aan licht te voorkomen. Na 3 uur, gebruik een Pasteur pipet om mannetjes over te dragen op een 10 cm gezaaid NGM plaat. Breng zo weinig van de Mito-Dye oplossing mogelijk. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en broeden 's nachts in 16 ° c.

3. dag 2: paring

  1. Pluk de gekleurde mannetjes van dag 1 op een nieuwe, gezaaide NGM plaat. Laat de plaat in het donker tot de paring. Deze stap zorgt ervoor dat overtollige Mito-Dye gekleurd bacteriën rond de mannetjes worden verwijderd. Overdracht van overmatige Mito-Dye gekleurd bacteriën op de paring plaat kan vlek hermafrodiet weefsel.
  2. Maak een parings plaat door 2 l van een dik E. coli mengsel te laten vallen op een ongezaaide NGM plaat. Laat de dikke bacteriën droog te maken van de paring dot. Mannetjes en hermafrodieten zullen worden overgedragen op deze stip voor de paring. Om dikke e. coli, spin down 3 ml 's nachts e. coli en de bacterie pellet opnieuw op te schorten in 1 ml M9. Dit mengsel kan worden opgeslagen bij 4 °C en hergebruikt voor maximaal 6 maanden.
    Opmerking: De dikte van de E. coli oplossing kan worden aangepast. Als de oplossing is te dun, mannetjes kunnen kruipen weg van de paring stip in plaats van aggregatie op het voor de paring. Paring stippen gemaakt van een E. coli soluton dat is te dik kan verminderen de paring efficiëntie.
  3. Terwijl de het koppelen plaat van stap 3,2 droogt, meng samen 300 l van 1% (w/v) Tricaine (Tri), 300 l van 0,1% (w/v) Tetramisole (tet), en 900 l van M9.
    Opmerking: Opslag 1% (w/v) Tricaine en 0,1% (w/v) Tetramisole als fracties bij-20 °C. Vermijd herhaalde vorst ontdooien.
  4. Breng 600 l van de Tet/Tri-oplossing over naar een horlogeglas.
  5. Overdracht 12-15 hermafrodieten geplukt op dag 1 aan de Tet/Tri oplossing in het horlogeglas. Incubeer gedurende 30 minuten om de hermafrodieten te immobiliseren. Houd het horlogeglas bedekt om de Tet/Tri-oplossing te voorkomen verdampen.
    Opmerking: Het is belangrijk dat hermafrodieten zijn verdoofd voor ten minste 30 min. minder tijd kan resulteren in een bewegende worm tijdens Beeldacquisitie, die kan interefere met Imaging.
  6. Terwijl hermafrodieten zijn incubatie, pick 50-60 gekleurd mannetjes van stap 3,1 op de paring dot (stap 3,2). Bewaar de plaat in het donker tot stap 3,8.
  7. Na de 30 min incubatie in de Tet/Tri-oplossing, gebruik een glas Pasteur pipet om de immobild hermafrodieten overdracht van het horlogeglas op een ongezaaid NGM plaat. Verwijder zo veel mogelijk vloeistof en laat de overtollige vloeistof droog.
    Opmerking: Laat de hermafrodieten niet overdreven drogen. Zodra alle zichtbare vloeistof is verdampt, begint de volgende stap.
  8. Breng de verdoofd hermafrodieten van de ongezaaide NGM plaat op de paring dot met de gekleurd mannetjes. Incubeer in het donker voor 30 min om de mannetjes te paren met de hermafrodieten.
  9. Na de paring voor 30 min, Monteer de hermafrodieten onmiddellijk voor time-lapse Imaging of de overdracht van de hermafrodieten op een nieuwe, gezaaid NGM plaat om te rusten voor 1 uur voorbeeld vorming.
    Opmerking: Time-lapse Video's van de hermafrodiet baarmoeder worden gebruikt om sperma snelheid en omkering frequentie te kwantificeren. Stilstaande beelden van de baarmoeder genomen 1 h na de paring worden gebruikt om sperma distributie, of Spem begeleiding te kwantificeren.

4. dag 2: montage van wormen voor visualisatie

  1. Het creëren van een bevestigings stootkussen met 2% agarose in H2O
    Opmerking: 2% agarose kan worden gemaakt in bulk, gepaard in glazen reageerbuizen, en opgeslagen op 4 ° c. Wanneer nodig, elke hoeveelheid kan worden magnetron voor elk gebruik en opgeslagen in een warmte blok om te voorkomen dat het stollen.
    1. Om de montage pad, uitlijnen drie glazen Microscoop dia's naast elkaar met de lange randen aan te raken. Plaats twee stukjes plakband bovenop elkaar op beide buitenste dia's. Deze buitenste glazen dia's met tape zal fungeren als de steun, zodat de dikte van de resulterende agarose pad zal worden "twee tape Deep".
    2. Plaats ~ 75 l van gesmolten 2% agarose op de centrum dia (dit is de dia zonder band). Plaats onmiddellijk een nieuwe dia van de glas Microscoop bovenop agarose. Deze top glazen glijbaan moet loodrecht op de andere dia's, met elk uiteinde rust op de tape van de twee ondersteunende dia's.
    3. Laat agarose uitharden (~ 30 s). Verwijder zorgvuldig de hoogste glas dia door het van het agarose stootkussen te glijden.
  2. Plaats 10-15 l van de Tet/Tri oplossing op de 2% agarose pad. Breng de gestuurde hermafrodieten op het pad. Zorg ervoor dat de overdracht zo weinig mogelijk bacteriën.
  3. Plaats een dekkingsstrook over de wormen op het agarose stootkussen.

5. dag 2: Image Acquisition Setup

Opmerking: Elke rechtop miscroscope uitgerust met epi-fluorescentie, 10x en 60x doelstellingen, en een digitale camera kan worden gebruikt om beelden te verwerven voor de distributie van sperma. De software bekwaam om tijd-vervallen beelden te verwerven is vereist voor het beoordelen van sperma snelheid, richtings snelheid, en omkerings frequentie.

  1. Beeldacquisitie 1 h na paring
    1. Monteer de dia op de Microscoop fase. Kijk door de ogen stukken te scannen voor wormen op de agarose pad met behulp van de 10x doelstelling met de rode fluorescentie-emissie filter (TRITC filter). Zodra een worm is gevonden, zet kort het fluorescentie licht om te zien of de worm heeft gedekt. Als sperma is zichtbaar in de baarmoeder, overschakelen naar de 60x doelstelling.
      Opmerking: De druk die door de 60x doelstelling op de dekglaasje kan beschadigen sommige fragiele wormen, waardoor de darm of Gonade te extruderen van het dier. Scannen voor een succesvolle paring met behulp van de 10x doelstelling kan het minimaliseren van de wormen ' blootstelling aan de toegevoegde druk. Stel de gedekte wormen niet bloot aan langere perioden van tl-licht.
    2. Met behulp van differentiële interferentie contrast microscopie (DIC), de positie van de worm, zodat zowel de vulva en een Spermatheca zijn in het zicht. Focus het beeld door zich te concentreren op het centrum van de Spermatheca. Controleer de belichting voor zowel DIC en TRITC kanalen. In DIC moeten interne worm structuren duidelijk zichtbaar zijn. In TRITC, individuele sperma moet zichtbaar zijn als afzonderlijke puncta.
      Opmerking: Elk beeld moet vangen de baarmoeder van de vulva naar een van de Spermatheca. Als de baarmoeder te lang is om op één beeld te passen, kunnen twee afzonderlijke beelden worden genomen. Het is niet nodig dat alle afbeeldingen op hetzelfde blootstellingsniveau worden genomen. Het is echter belangrijk dat individuele zaadcellen kunnen worden onderscheiden en gekwantificeerd in de fluorescentie beelden.
    3. Verwerf DIC en fluorescentie beelden voor elke baarmoeder.
    4. Herhaal de stappen 5.1.1-5.1.3 totdat alle gestuurde hermafrodieten zijn afgebeeld.
  2. Het vastleggen van time-lapse Video's
    1. Scan de agarose pad en lokaliseren hermafrodieten die bevatten geëtiketteerd sperma in de baarmoeder, zoals beschreven in stap 5.1.1 en 5.1.2
    2. Configureer de software voor het verkrijgen van time-lapse beelden in DIC en TRITC kanalen. In het algemeen, time-lapse beelden worden genomen op 15-30 s intervallen voor 10-20 min per baarmoeder.

6. kwantificering

  1. Kwantificeren sperma distributie op baarmoeder beelden genomen 1 h na de paring
    1. Beginnend met de vulva aan de ene kant en de Spermatheca op de andere, verdeel de baarmoeder in derden. Deze zullen de drie zones vertegenwoordigen. Zone 1 (Z1) bevat de vulva en zone 3 (Z3) bevat de Spermatheca.
    2. Tel manueel het aantal sperma binnen elk derde van de baarmoeder, en Rapporteer het aantal in elke streek als percent van het totale sperma in de volledige baarmoeder. Hieronder wordt een voorbeeld gegeven.
      figure-protocol-1
      Nota: soms, moet de signaalintensiteit van het TRITC kanaal beeld worden aangepast zodat elk sperma dat in het beeld is gevangen kan zichtbaar en gekwantificeerd zijn.
  2. Tracking sperma in time-lapse beelden
    Opmerking: In deze paper hebben we de NIS-Elements software voor analyse gebruikt. In de onderstaande paragrafen geven we instructies voorhand matig bijhouden van sperma met behulp van deze software (stap 6.2.1), alsmede de open source software ImageJ/Fiji (stap 6.2.2).
    1. Tracking sperma met NIS-elementen
      1. Open het. ND2-bestand met de time-lapse-reeks die moet worden bijgehouden. Om te beginnen met het bijhouden, het openstellen van de tracking panel door rechts te klikken in de software en het selecteren van analyse controles | Tracking.
      2. Selecteer nieuwe ROI definiërenin het deelvenster bijhouden. Definieer elke regio van belang (ROI) door te klikken op elk sperma dat zal worden bijgehouden. Een gekleurde markering zal over het geselecteerde sperma verschijnen. Klik op Voltooien als alle ROI zijn geselecteerd.
      3. Zodra de ROI zijn geïdentificeerd, ga naar het volgende frame in de time-lapse serie. Sleep de ROI-markering naar de nieuwe positie van het sperma in de afbeelding. Blijf dit doen totdat het sperma niet meer kan worden bijgehouden. Gestippelde lijnen verschijnen met elkaar verbinden elk van de locaties de ROI marker is geplaatst door alle frames van de time-lapse afbeelding.
        Opmerking: Alleen sperma in zone 2 moet worden bijgehouden als sperma in zones 1 en 3 hebben de neiging om te bewegen in een cirkelvormig patroon, zelfs in het wild-type dieren.
      4. Exporteer alle kwantificeerbare gegevens (bijvoorbeeld de lengte van het pad, de tijd, de XY-positie, enz.) van het bijgehouden sperma naar een Excel-document door te klikken op exporteren in het deelvenster bijhouden.
    2. Tracking sperma met Fiji
      1. Converteer de TRITC-kanaal afbeeldingen in de time-lapse-reeks naar. TIF-bestanden. Sla alle bestanden van de ene reeks op in één map.
      2. Importeer de afbeeldingen naar Fiji met behulp van de import functie bioformats. Importeer afbeeldingen van één time-lapse-reeks als één hyperstack.
      3. Open TrackMate in Fiji24 via plugins | Tracking | Handmatig bijhouden met TrackMate. Een diaglogue box wordt geopend.
      4. Selecteer het hulpprogramma TrackMate in de werkbalk Fiji. Dubbelklik op het sperma dat zal worden bijgehouden. Een groene cirkel met stippellijnen zal verschijnen. Deze cirkel kan worden verplaatst door te klikken in de cirkel en te slepen naar de gewenste positie. De grootte van deze cirkel kan worden veranderd door gelijktijdig te drukken op de Alt -toets en scrollen met de muis.
      5. Zodra de grootte en de positie van de Drijver is geplaatst, klik opnieuw op de cirkel. De gestreepte groene lijnen zullen veranderen in een stevige groene lijn. Druk gelijktijdig op de SHIFT en L toetsen om in te schakelen tracking mode. Dit zal worden vermeld in de werkbalk van Fiji.
      6. Naar het volgende frame in de time-lapse-reeks gaan. Als u de nieuwe locatie van de bijgehouden sperma in het nieuwe frame, beweeg de muis over het nieuwe punt en druk op de A -toets. De Drijver zal nu bij de nieuwe plaats verschijnen, en een lijn zal verschijnen die de plaatsen verbindt waar de Drijver in de vorige kaders is geplaatst.
      7. Nadat de sporen zijn voltooid, klikt u op analyseren in het dialoogvenster TrackMate om de benodigde gegevens te genereren.
    3. Om de snelheid te berekenen, verdeel de totale weg lengte van het sperma door de verstreken tijd.
    4. Voor het berekenen van de vector snelheid, teken een lijn door de baarmoeder vanaf de vulva wijzend naar de Spermatheca. Meet de afstand van het sperma is gemigreerd langs deze lijn van het begin tot het einde van de trace. Verdeel deze afstand door de verstreken tijd. Negatieve waarden geven aan dat het sperma weg is gemigreerd van de Spermatheca.
    5. Om omkerings frequentie te registreren, Tel het aantal tijden waarin het sperma spoor een hoek minder dan 90 ° tijdens drie opeenvolgende time-lapse kaders heeft geproduceerd.

Resultaten

Voor het genereren van de resultaten afgebeeld in dit document, mist-2 (q71) mannetjes werden gekleurd met de Mito-Dye en gedekt door wild-type, N2 hermafrodieten. Figuur 2 biedt een algemeen schema voor de methode, met inbegrip van worm voorbereiding, paring, en analyse. Als film 1 toont, de volwassen hermafrodiet voortplantingsorganen heeft twee armen die spiegelbeelden van elkaar. Bij de paring, geëtiketteerd sperma worden neergelegd in de hermafrodiet baarmoeder door de vulva. Het sperma beweegt zich rond de ontwikkelende embryo's binnen de baarmoeder naar Spermatheca, waar zij tot bemesting worden opgeslagen. Aangezien de kiemcellen in de volwassen hermafrodiet zich in oöcyten ontwikkelen, wordt de proximale, meest rijpe eicel geduwd in de Spermatheca via de contraties van de schede cel. Bevruchting treedt op terwijl de eicel is in de Spermatheca.

Om sperma distributie en migratie door het vrouwelijke reproductieve landstreek te kwantificeren, is de hermafrodiet baarmoeder verdeeld in drie streken (Movie 1, Figuur 3a). Zone 1 overspant de eerste derde van de baarmoeder, vanaf de vulva. Zone 2 overspant het middelste derde deel van de baarmoeder, en zone 3 overspant de laatste derde van de baarmoeder en omvat de Spermatheca. Juiste sperma begeleiding met behulp van wild-type, N2 hermafrodieten en Fog-2 (q71) mannetjes moeten resulteren in ongeveer 90% van het gelabelde sperma bereiken van de Spermatheca, of zone 3 (Figuur 3b).  Paringen die resulteren in te weinig (figuur 3c, minder dan 10-15 sperma) of te veel (figuur 3D, baarmoeder gevuld met sperma) sperma in de baarmoeder mag niet worden geteld. In de paringen die resulteren in minder dan 10-15 sperma, 3-4 Rogue sperma kan sterk scheef de gegevens. Op dezelfde manier wanneer de baarmoeder volledig met sperma wordt gevuld, kan het sperma niet geschikt migreren. Sperma kan lijken verspreid over de baarmoeders van een aantal mutanten die slechte sperma begeleiding fenotype weer te geven. Echter, in dit geval moet sperma niet vullen elke spleet van de baarmoeder, zoals te zien in figuur 3D. Kwantificering van elke arm van de Gonade wordt beschouwd als een monster, of een n.

Time-lapse beelden worden genomen om sperma snelheid en omkering frequentie te kwantificeren. Alleen sperma in zone 2 moet worden bijgehouden (figuur 4a), omdat sperma in zones 1 en 3 (film 1) de neiging hebben om in een cirkelvormig patroon te bewegen, zelfs binnen wild-type dieren. Time-laspe beelden genomen op 15-30 s intervallen worden meestal gebruikt voor het bijhouden van sperma. Alleen sperma dat kan worden gevolgd in opeenvolgende frames voor meer dan 2,5-3 min worden gekwantificeerd. In figuur 4b-M, het sperma gemarkeerd door de rode en blauwe stippen voldoen aan dit criterium, terwijl het sperma gemarkeerd door de groene stip niet. Daarom zijn de waarden gedefinieerd in figuur 4n worden gekwantificeerd voor het sperma gemarkeerd door de rode en blauwe stippen (figuur 4O), terwijl die voor het sperma gemarkeerd door de groene stip werden niet gekwantificeerd.

figure-results-1
Figuur 1: cartoon van de volwassen C. hermafrodiet en mannelijk. Belangrijke reproductieve structuren zijn geëtiketteerd in de figuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: schematische schema van de voorbereiding van de monsters en data-acquisitie. De mannetjes die met de Mito-kleurstof worden bevlekt worden gedekt aan gesynchroniseerde volwassen hermafrodieten. Time-lapse beelden van gestuurde hermafrodieten worden onmiddellijk na de paring genomen om gegevens voor sperma snelheid en omkerings frequentie vast te leggen. Stilstaande beelden van gestuurde hermafrodieten worden genomen 1 h na de paring om sperma distributie te beoordelen in de baarmoeder. Refereer naar de tekst voor meer details. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: kwantificeren van sperma distributie binnen de hermafrodiet baarmoeder. (A). schematische van de C. hermafrodiet van de baarmoeder. V = vulva, E = embryo, S = Spermatheca, O = eicel, Z1-Z3 = zones 1-3 gebruikt om sperma distributie te meten. (B-D). DIC + TRITC samengevoegd (linker panelen) en TRITC alleen (rechts panelen) beelden van de wild-type hermafrodiet baarmoeders 1 h na de paring aan Fog-2 (q71) mannetjes gekleurd met de Mito-Dye. Sperma lijkt rood. Gele contouren geven de locatie van de Spermatheca aan. Schaalbalk: 20 μm. Z1, Z2, Z3 kwantificatie in B vertegenwoordigen het percentage sperma in elke zone ± standaarddeviatie. Beelden in C en D vertegenwoordigen paringen die hebben geresulteerd in te weinig (C) of te veel (D) sperma voor kwantificering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: kwantificeren van sperma snelheid en omkerings frequentie tijdens migratie door de baarmoeder. (A). dic + TRITC samengevoegd beeld van een hermafrodiet baarmoeder met fluorescerende sperma (rood). V = vulva, geel = Spermatheca, Z1-Z3 = drie zones van de baarmoeder, zwarte doos: zone 2. (B-M). Time-lapse TRITC kanaal beelden ingezoomd op zone 2 (Black Box in A). Beelden werden verkregen met 20 s intervallen. 3 individuele sperma werden bijgehouden in elk beeld (rode, groene en blauwe stippen). Gekleurde stippen in paneel M staat voor het pad van elk sperma van B-L. Schaalbalk = 20μm. (N). vergelijkingen en definities voor sperma snelheid, Vector snelheid en omkering frequentie. (O). snelheid, Vector snelheid en omkering frequentie van sperma bijgehouden in panelen B-L door de rode en blauwe stippen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-5
Movie 1: film van sperma beweging en migratie. Een wild type hermafrodiet werd gedekt door Fog-2 (q71) mannetjes gekleurd met Mito-Dye. De film is een composiet van time-lapse beelden genomen op gevarieerde tijdsintervallen. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussie

De capaciteit van sperma om het ingewikkelde vrouwelijke voortplantingskanaal te navigeren en oöcyten te vinden is kritiek voor seksuele reproductie. Recente studies met behulp van sperma van intern bemesten dieren suggereren dat ze actief reageren op verschillende milieu-cues, met inbegrip van chemische signalen, vloeiende stroming, en temperatuur gradiënten1,5,7, 9 , 12. deze waarnemingen zijn echter grotendeels het gevolg van in vitro experimenten en er is weinig bekend over het sperma gedrag en de communicatie binnen het voortplantingskanaal. Een van de belangrijkste belemmeringen voor het verwerven in vivo gegevens over de migratie van sperma en de beweeglijkheid is het gebrek aan zichtbaarheid binnen de meeste vrouwelijke voortplantingsorganen. De methode die we hier hebben beschreven met behulp van C. , overwint deze beperking. Aangezien de representatieve resultaten aantonen, staat de transparante epidermis voor directe visualisatie en het volgen van elk sperma bij enige cel resolutie in een levend, intact organisme toe.

C. het heeft twee geslachten. De mannetjes, met een XO genotype, produceren slechts sperma, en in deze methode, worden gebruikt als spermadonors. De hermafrodiet, met een XX genotype, zijn gemodificeerde vrouwtjes. Hun gonaden eerst ondergaan spermatogenese tijdens de vierde larvale stadium en over te schakelen naar ooegenese in de volwassenheid25. Deze test maakt gebruik van volwassen hermafrodieten, waarvan de voortplantings weefsels een model voor de vrouwelijke voortplantingsorganen. Het gebruik van beide geslachten in deze assay stelt ons in staat om genetische en moleculaire paden te identificeren in zowel de mannelijke en vrouwelijke dat sperma begeleiding en de beweeglijkheid kan reguleren. In combinatie met de hele reeks van genetische en moleculaire technieken beschikbaar voor C., kan deze methode leiden tot nieuwe inzichten in sperma migratie en beweeglijkheid, alsmede sperma-en eicel communicatie.

Een paar kritieke stappen in dit protocol rechtvaardigen verdere aandacht, in aanvulling op de details die in het protocol sectie.

Wormen
Fog-2 (q71), him-5 (e1490), of hem-8 (e1489) Mutant mannetjes kunnen worden gebruikt in plaats van N2 mannetjes. Deze mutaties verhogen de frequentie van de mannetjes in culturen, maar hebben geen invloed op de mannelijke paring of sperma functies13. De wijfjes, zoals mist-2 (q71) wijfjes, kunnen in plaats van hermafrodieten worden gebruikt. Nochtans, moeten de wijfjes met mannetjes worden pre-gedekt om juiste eicelontwikkeling toe te staan. De aanwezigheid van bevruchte embryo's van deze pre-paring zorgt er ook voor dat de baarmoeder is lang genoeg om goed te beoordelen sperma distributie. Als Mutant of experimentele hermafrodieten worden beoordeeld, omvatten een controlegroep (s). Bijvoorbeeld, Mutant hermafrodieten moet worden gekoppeld aan wild type N2 hermafrodieten als een controle voor andere variabelen in de assay. Hermafrodieten die zijn gevoed met bacteriën die plasmiden voor RNA interferentie assays moeten ook worden gevoed met bacteriën met lege Vector controle. De afstand van de vulva, waar het sperma wordt bevrucht, aan Spermatheca, de Bemestings plaats, kan afhankelijk van het aantal eieren in de baarmoeder variëren (d.w.z., breidt de baarmoeder zich met stijgend ei aantal uit). Als vergelijkingen tussen genotypen worden gemaakt, selecteert hermafrodieten waarvan de baarmoeders gelijkaardige aantallen eieren bevatten. Selecteer geen hermafrodieten met broed embryo's of bewegende larven. Een tijd cursus kan worden uitgevoerd om de optimale leeftijd te identificeren waarop hermafrodieten moet worden getest.

Plukken hermafrodieten en mannetjes
Het is belangrijk dat de hermafrodieten geplukt voor deze test niet uit overwoekerd of uitgehongerd platen. Voedsel en feromonen cues moduleren de uitdrukking van DAF-7, een TGFß homolog. De DAF-7 route is aangetoond reguleren van de synthese van F-serie prostaglandines die belangrijke rol spelen in het begeleiden van sperma naar de Spermatheca20. Het plukken hermafrodieten van overbevolkte of uitgehongerde platen kan in slechte sperma begeleiding resulteren niet verwant met het doel van belang. De dichtheid van de platen schijnt niet om het mannelijke sperma te beïnvloeden. Nochtans, kunnen de mannetjes die te jong of te oud zijn resulteren in verminderde het koppelen efficiency (d.w.z., het percent van hermafrodieten op de het koppelen plaat die genoeg sperma in hun baarmoeders hebben om te kwantificeren). 1-3 dag oude volwassen mannetjes zijn optimaal voor deze assay23.

Verlamming hermafrodieten
In onze handen, de Tetramisole en Tricaine combinatie zorgt ervoor dat wormen zijn immobiled, en blijven leven tijdens de paring en beeldacquisitie. Andere verdovingsmiddelen, zoals natrium azide, kunnen ook worden gebruikt. Echter, natrium azide is zeer giftig en de voorwaarden moeten worden gestandaardiseerd. Immobilisatie technieken met behulp van microkralen, agarose, en microfluidics kamers worden niet aanbevolen als ze interfereren met de paring.

Mannelijke kleuring
De Mito-Dye gebruikt in dit manuscript, MitoTrackerCMXRos, is op grote schaal gebruikt voor het etiketteren van sperma, evenals andere mitochondriën, in C.. Het sperma gelabeld met deze Mito-Dye is volledig functioneel, behoud van haar vermogen om te worden geactiveerd, migreren, bemesten oöcyten, en produceren levensvatbare nakomelingen26,27. Andere mitochondrial kleurstoffen, zoals Rhodamine 6G en DiOC6 zijn gebruikt om vlek C. de mitochondria van de van de voorstanders28,29. Echter, de voorwaarden voor deze kleurstoffen moeten worden gestandaardiseerd voor het etiketteren van sperma in deze test. Naast mitochrondrial etiketterings mechanismen, kunnen de vlekken van DNA, zoals Syto17, ook worden gebruikt om sperma voor migratie analyses30te etiketteren. Hoewel deze etikettering technieken zijn relatief eenvoudig en snel uit te voeren, transgene strategieën kunnen ook worden gebruikt om het genereren van sperma dat fluorescerende Tags uit te drukken onder sperma-specifieke promotors31,32.

Paring
Paring punten die te dik zijn kan verminderen paring efficiëntie. Zorg moet worden genomen om de overdracht zo weinig mogelijk bacteriën bij de overdracht van mannetjes en verdoofd hermafrodieten op de paring dot.

Het maken van agarose pads en het plaatsen van de cover slip
De luchtbellen kunnen in de agarose stootkussens worden geproduceerd. Ze kunnen breken licht tijdens de beeldvorming of, wanneer groot genoeg, veroorzaken wormen door te vallen, waardoor het onmogelijk is om het beeld (s) te verwerven. Zo ook, kunnen de luchtbellen langs worden gecreërd hermafrodieten wanneer de dekkingsstrook over hen op het agarose stootkussen wordt geplaatst. Deze bubbels breking licht en leiden tot een verminderde beeldkwaliteit. De praktijk zal helpen verminderen het optreden van luchtbellen.

Kwantificering
Wanneer het kwantificeren van sperma distributie, kunnen de verschillende z-vliegtuigen door de baarmoeder van een worm lichte verschillen in sperma distributie hebben. We vinden dat het nemen van een enkel beeld gericht op de Spermatheca geeft ons reproduceerbare resultaten die vergelijkbaar zijn met de resultaten verkregen door het gemiddelde van meerdere z-secties. We raden u aan het beeld te concentreren op het midden van de Spermatheca, maar de focale vlakken kunnen enigszins worden aangepast op basis van de behoeften van de experimenter. Het is echter van cruciaal belang dat alle beelden op dezelfde manier worden genomen. Bovendien is het belangrijk dat alleen sperma die in focus zijn geteld. Het is de teller de discretie bij het bepalen van de criteria voor in-focus sperma. Het is echter van cruciaal belang dat de criteria systematisch worden toegepast op elke worm die wordt gekwantificeerd. Voor het bijhouden van sperma, veel software bieden automatische tracking mogelijkheden. Echter, vinden we dat handmatige tracking beter presteert dan de software automatische tracking-algoritme voor twee belangrijke redenen: 1) de overvloed van vergelijkbare grootte kernen binnen de beperkte ruimte maakt het moeilijk voor de software om onderscheid te maken tussen individuele sperma en creëer gedefinieerde ROI voor elk sperma. 2) als sperma gaan in en uit focus, hun intensiteiten Shift, waardoor het moeilijk voor de software om bij te houden van het sperma over langere perioden.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Wij oprecht danken onze overleden mentor, Dr Michael Miller, voor zijn inspirerende en onbaatzuchtige mentorschap en de oprichting van deze methode als een instrument om beter te begrijpen sperma en eicel communicatie. Zijn plotselinge passeren is een enorm verlies voor zijn familie, zijn lab, en de wetenschappelijke gemeenschap. Deze studie werd gesteund door NIH (R01GM085105 aan MAM en F30HD094446 aan MH). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de nationale instituten van de gezondheid.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents en materiaal
60 mm x 15 mm Petri schotelFisherFB0875713A
AgarFisherBP1423-500
NatriumchlorideFisherS671-3
PeptonFisherBP1420-500
CholesterolSigma-AldrichC8667
LB-bouillon, MillerFisher1426-2
Escherichia coli stam NA22Caenorhabditis Genetics Center (CGC)NA22Dit of OP50 E. coli kan worden gebruikt voor onderhoud en test van C. elegans. Beide kunnen worden gekocht bij de CGC
N2CGCN2
fog-2(q71)CGCCB4108
Platinedraad 0,25 mm diameterAlfa Aesar10288
5 3/4" Wegwerp Pasteur-pipetFisher13-678-20A
KijkglasFisher02-612A
Glazen staaf 5 mm diameterFisher50-121-5269
MitoTracker CMXRos (Mito-kleurstof)FisherM7512Bescherm tegen licht, bewaar bij -20 °C
MonokaliumfosfaatFisherP285-500
DinatriumfosfaatFisherS374-1
MagnesiumsulfaatFisherM63-500
DimethylsulfoxideFisherBP231-1DMSO
AluminiumfolieFisher01-213-102
Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaatSigmaE10521-10GTricaine is de gebruikelijke naam. Bewaren in aliquoten bij -20 °C.
TetramisoolhydrochlorideSigmaL9756-5GBewaren in aliquoten bij -20 °C
AgaroseFisherBP1356-100
DekglasjesFisher12-548-A18 x 18-1
Microscoopglaasjes met gladde randFisher12-552-3
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
16 °C en 20 °C incubatorsFisher97-990EHetzelfde model, ingesteld op verschillende temperaturen.
Staande microscoop met epi-fluorescentie-verlichting, camera en 10x en 60x objectievenNikon
Software met beeldverwervings- en trackingmogelijkhedenNikonNIS-elements AR
Stereo-microscoopNikonSMZ800NElke stereo-microscoop die kan worden gebruikt om C. elegans te visualiseren, kan worden gebruikt met dit protocol

Referenties

  1. Boryshpolets, S., Perez-Cerezales, S., Eisenbach, M. Behavioral mechanism of human sperm in thermotaxis: a role for hyperactivation. Human Reproduction. 30 (4), 884-892 (2015).
  2. Edmonds, J. W., McKinney, S. L., Prasain, J. K., Miller, M. A. The gap junctional protein INX-14 functions in oocyte precursors to promote C. elegans sperm guidance. Developmental Biology. 359 (1), 47-58 (2011).
  3. Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Developmental Cell. 19 (6), 858-871 (2010).
  4. Espinal-Enriquez, J., Priego-Espinosa, D. A., Darszon, A., Beltran, C., Martinez-Mekler, G. Network model predicts that CatSper is the main Ca(2+) channel in the regulation of sea urchin sperm motility. Scientific Reports. 7 (1), 4236(2017).
  5. Hunter, R. H., Nichol, R. A preovulatory temperature gradient between the isthmus and ampulla of pig oviducts during the phase of sperm storage. Journal of Reproduction and Fertility. 77 (2), 599-606 (1986).
  6. Hussain, Y. H., Guasto, J. S., Zimmer, R. K., Stocker, R., Riffell, J. A. Sperm chemotaxis promotes individual fertilization success in sea urchins. Journal of Experimental Biology. 219 (Pt 10), 1458-1466 (2016).
  7. Kantsler, V., Dunkel, J., Blayney, M., Goldstein, R. E. Rheotaxis facilitates upstream navigation of mammalian sperm cells. Elife. 3, e02403(2014).
  8. Kubagawa, H. M., et al. Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo. Nature Cell Biology. 8 (10), 1143-1148 (2006).
  9. Miki, K., Clapham, D. E. Rheotaxis guides mammalian sperm. Current Biology. 23 (6), 443-452 (2013).
  10. Ting, J. J., Tsai, C. N., Schalkowski, R., Cutter, A. D. Genetic Contributions to Ectopic Sperm Cell Migration in Caenorhabditis Nematodes. G3. 8 (12), Bethesda. 3891-3902 (2018).
  11. Yanagimachi, R., et al. Chemical and physical guidance of fish spermatozoa into the egg through the micropyledagger, double dagger. Biology of Reproduction. 96 (4), 780-799 (2017).
  12. Zhang, Y., et al. Generation of Gradients on a Microfluidic Device: Toward a High-Throughput Investigation of Spermatozoa Chemotaxis. PloS One. 10 (11), e0142555(2015).
  13. Hoang, H. D., Miller, M. A. Chemosensory and hyperoxia circuits in C. elegans males influence sperm navigational capacity. PLoS Biology. 15 (6), e2002047(2017).
  14. Hansen, J. M., Chavez, D. R., Stanfield, G. M. COMP-1 promotes competitive advantage of nematode sperm. Elife. 4, (2015).
  15. L'Hernault, S. W. Spermatogenesis. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-14 (2006).
  16. Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291 (5511), 2144-2147 (2001).
  17. Greenstein, D. Control of oocyte meiotic maturation and fertilization. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-12 (2005).
  18. O'Hagan, R., Wang, J., Barr, M. M. Mating behavior, male sensory cilia, and polycystins in Caenorhabditis elegans. Seminars in Cell & Developmental Biology. 33, 25-33 (2014).
  19. Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. A heterogeneous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the Caenorhabditis elegans reproductive tract. PLoS Genetics. 9 (1), e1003271(2013).
  20. McKnight, K., et al. Neurosensory perception of environmental cues modulates sperm motility critical for fertilization. Science. 344 (6185), 754-757 (2014).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
  23. Chatterjee, I., et al. Dramatic fertility decline in aging C. elegans males is associated with mating execution deficits rather than diminished sperm quality. Experimental Gerontology. 48 (11), 1156-1166 (2013).
  24. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , 80-90 (2017).
  25. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  26. Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
  27. Wang, Y., et al. Kinetics and specificity of paternal mitochondrial elimination in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 7, 12569(2016).
  28. Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
  29. Mottram, L. F., Forbes, S., Ackley, B. D., Peterson, B. R. Hydrophobic analogues of rhodamine B and rhodamine 101: potent fluorescent probes of mitochondria in living C. elegans. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 8, 2156-2165 (2012).
  30. Singson, A., Hill, K. L., L'Hernault, S. W. Sperm competition in the absence of fertilization in Caenorhabditis elegans. Genetics. 152 (1), 201-208 (1999).
  31. Wu, J. C., et al. Sperm development and motility are regulated by PP1 phosphatases in Caenorhabditis elegans. Genetics. 190 (1), 143-157 (2012).
  32. Seidel, H. S., et al. A novel sperm-delivered toxin causes late-stage embryo lethality and transmission ratio distortion in C. elegans. PLoS Biology. 9 (7), e1001115(2011).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Spermmotiliteitreproductieve tractus van C eleganskleuring met mitochondri le kleurstofepifluorescentiemicroscopietime lapse imagingspermtrackingkwantificering van de spermathecazonering van de uterusgenetische manipulatie
Het meten van sperma begeleiding en beweeglijkheid binnen de Caenorhabditis van het hermafrodiet-reproductieve kanaal
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.