Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden

5.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59795

⸱

17 juli 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

In dit artikel

Samenvatting

In dit artikel presenteerden we een reeks praktische en haalbare methoden voor het karakteriseren van ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en complementaire Split plaats assay.

Samenvatting

De snel versnelde fibrosarcoma (RAF) familie kinasen spelen een centrale rol in de celbiologie en hun disfunctie leidt tot kankers en ontwikkelingsstoornissen. Een karakterisering van ziekte-gerelateerde RAF mutanten zal ons helpen bij het selecteren van passende therapeutische strategieën voor de behandeling van deze ziekten. Recente studies hebben uitgewezen dat de kinasen van de RAF-familie zowel katalytische als allosterische activiteiten hebben, die strak gereguleerd worden door dimerisatie. Hier bouwden we een reeks praktische en haalbare methoden om de katalytische en allosterische activiteiten en de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van RAF familie kinasen en hun mutanten te bepalen. Ten eerste hebben we de klassieke in-vitro kinase assay aangepast door de detergens concentratie in buffers te verminderen, gebruikmakend van een zachte Quick Wash procedure, en het gebruik van een glutathion S-transferase (GST) fusie om te voorkomen dat RAF Dimeren van dissociatie tijdens Zuivering. Dit stelt ons in staat om de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten adequaat te meten. Ten tweede ontwikkelden we een roman RAF co-Activation assay om de allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten te evalueren door gebruik te maken van N-terminale afgeknotte RAF-eiwitten, waardoor de eis van actieve RAS in huidige protocollen wordt geëlimineerd en daardoor een hogere Gevoeligheid. Ten slotte genereerden we een unieke complementaire Split plaats-test om de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van verschillende RAF-mutanten te kwantificeren, wat betrouwbaarder en gevoeliger is in vergelijking met de traditionele Co-Immunoprecipitation-assay. Kortom, deze methoden hebben de volgende voordelen: (1) gebruiksvriendelijk; (2) in staat zijn om effectief te kunnen uitvoeren zonder geavanceerde apparatuur; (3) kosteneffectief; (4) zeer gevoelig en reproduceerbaar.

Inleiding

De RAF familie kinases zijn een belangrijk onderdeel van RAS/RAF/MEK/ERK signalering Cascade, die een signaal van RAS te activeren mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MEK)1,2,3,4. Deze familie van kinasen speelt een cruciale rol in celgroei, overleving en differentiatie, en hun veranderingen induceren vele ziekten, met name kanker5,6,7,8. Onlangs hebben genomische sequencings veel ziektegerelateerde RAF-mutanten geïdentificeerd die verschillende eigenschappen vertonen in de signaaloverdracht van RAS/RAF/MEK/ERK Cascade9,10,11. Een zorgvuldige karakterisering van de mutanten van de RAF zal ons helpen de moleculaire mechanismen te begrijpen van hoe de mutanten van de RAF de signaal output van RAS/RAF/MEK/ERK Cascade veranderen, en uiteindelijk passende benaderingen selecteren voor de behandeling van verschillende door de RAF gemuteerde ziekten.

De familie van de RAF kinases omvatten drie leden, CRAF, braf, en Araf, die vergelijkbare moleculaire structuren, maar verschillende capaciteiten te activeren downstream signalering1,2,3,4. Onder deze paralogs heeft braf de hoogste activiteit op grond van zijn constitutief gefosforyleerde NTA (N-terminal acidic) motief12,13,14, terwijl Araf de laagste activiteit die voortvloeit uit het niet-canonieke APE motief15. Dit kan verklaren de verschillende mutatie frequenties van RAF paralogs in ziekten: BRAF > CRAF > ARAF. Bovendien, binnen dezelfde RAF Paralog, mutaties in verschillende locaties kunnen leiden tot downstream signalering in verschillende manieren, die voegt een extra laag van complexiteit aan de regulering van de RAF familie kinases. Recente studies hebben aangetoond dat alle RAF kinases zowel de katalytische als de allosterische activiteiten13,14,16,17,18hebben. Constitutief actieve RAF-mutanten zetten de stroomafwaartse signalering rechtstreeks door fosforylating MEK, terwijl kinase-dode RAF-mutanten hun wild type tegenhangers kunnen transactiveren door middel van Side-to-side door dimerisatie en MEK-ERK-signalering16 activeren ,19,20. De dimeer-affiniteit/-stabiliteit is een belangrijke parameter die niet alleen de allosterische activiteit van kinase-dode RAF-mutanten bepaalt, maar ook de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten beïnvloedt,15,21, 22. de kinase-dode RAF mutanten met een hoge dimeer affiniteit/stabiliteit kunnen de endogene wild-type RAFs rechtstreeks transactiveren15, terwijl die met intermediaire dimeer affiniteit/stabiliteit vereist een coördinatie van actieve RAS of een verhoogde niveau van wild-type RAF moleculen om te functioneren13,15,20,21,23. Evenzo, grondwettelijk actieve RAF mutanten fosforylaat MEK in een dimeer-afhankelijke manier, en degenen met een lage dimeer affiniteit/stabiliteit verliezen hun katalytische activiteit in vitro op immunoprecipitatie die de zwakke RAF Dimeren breekt15, 21,22. De dimeer affiniteit/stabiliteit bepaalt ook de gevoeligheid van de RAF mutanten aan hun remmers, en positief correleert met de weerstand van de RAF-remmers24. Om ziekte-gerelateerde RAF-mutanten te karakteriseren, is het daarom noodzakelijk om hun katalytische en allosterische activiteiten te meten, en dimeer affiniteit/stabiliteit.

In de afgelopen jaren hebben ons laboratorium en anderen verschillende methoden ontwikkeld om RAF familie kinasen en hun mutanten te karakteriseren. Volgens ons laboratorium en de ervaring van anderen, denken we dat de volgende drie assays voordelen hebben bij het bepalen van ziekte-gerelateerde RAF-mutanten: (1) de in vitro kinase assay die gemakkelijk kan worden uitgevoerd om de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF mutanten15; (2) de RAF co-Activation assay is een betrouwbare en handige methode om de allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten13,15,21,22,23, 25; (3) de gratis gesplitste plaats test die een veel hogere gevoeligheid heeft bij het meten van de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van de mutanten van de RAF in tegenstelling tot de traditionele Co-Immunoprecipitation Assay, en is in staat om uit te voeren zonder geavanceerde apparatuur in contrast met de kwantitatieve analytische methoden zoals SPR (Sppervlakte Plasmon Resonance) analyse15,22. Door deze drie testen te combineren, kunnen we gemakkelijk begrijpen hoe een ziektegerelateerde RAF Mutant de downstream signalering verandert en zo een geschikte therapeutische strategie gebruiken om de ziekte te behandelen die wordt veroorzaakt door deze RAF-mutatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. in vitro kinase test voor het meten van de katalytische werking van de mutanten van de

  1. Construct vectoren coderen RAF mutanten (afbeelding 1A) met vlag (DYKDDDDK) tag bij C-Terminus met behulp van Gibson assembly of traditionele moleculaire klonen methoden.
    1. Introduceer de vlag tag en mutaties in de RAF-coderings sequenties door PCRs, en voeg vervolgens hele sequenties in pcdna 3.1 (+) vector met behulp van Gibson assembly of T4 DNA ligatie en volgens de protocollen van de fabricage. Gebruik de volgende voorwaarden voor PCR-reacties: (1) 95 °C, 2 min; (2) 95 °C, 30 s; (3) 59 °C, 30 s; (4) 68 °C, 3 min; (5) 20 cycli van (2 tot 4); (6) 4 °C vasthouden.
      Opmerking: De PCR-primers voor het klonen: 5-AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 en 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTA-3.
    2. Voeg de GST-coderings volgorde stroomopwaarts van de RAF Mutant codering sequenties voor het genereren van vectoren codering GST-gesmolten RAF mutanten met behulp van dezelfde methoden zoals beschreven in stap 1.1.1.
    3. Valideer alle vectoren door DNA sequencings voor Transfectie.
  2. Plaat 293T cellen in 6-goed platen met een dichtheid van 5 x 105 cellen/goed één dag voor de trans-fectie. Wanneer de celdichtheid bereikt 80 ~ 90% samenloop op de tweede dag, transfect met vectoren coderen vlag-Tagged RAF kinases of hun mutanten uit stap 1,1 in cellen door het volgen van het Protocol van de vervaardiging van transfectie reagentia (tabel van materialen).
  3. Vervang het kweekmedium 24 uur na transfectie.
  4. Aspirate het kweekmedium 48 h na transfectie en Voeg 400 μL/goed van de lysisbuffer toe (25 mM tris · HCl, 150 mM NaCl, 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) aangevuld met protease-en fosfatase remmers op lyse cellen op ijs.
    Opmerking: De concentratie van NP-40 in de lysisbuffer is van cruciaal belang voor het opsporen van de katalytische werking van mutanten van de RAF met matige dimeer affiniteit/stabiliteit in vitro. Een hoge concentratie van detergens of een sterk wasmiddel in lysisbuffer kan RAF Dimeren breken en daarmee de katalytische activiteit van RAF kinases of hun mutanten doden.
  5. Breng de cellysaten over in een buis van 1,5 mL en draai het met 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c om celresten af te breken.
  6. Breng 300 μL per monster van schone gehele cellijnen naar 1,5 mL buizen, Voeg 20 μL per steekproef van anti-FLAG-affiniteits kralen toe en draai in een koude ruimte (4 °C) voor 1 uur. Neem ook 40 μL per monster van schoon hele celllysaat opzij voor het detecteren van de expressie en de activiteit (phospho-ERK1/2) van de RAF mutanten door immunoblots zoals hieronder beschreven.
  7. Was de anti-FLAG kralen één keer met lysisbuffer, dan eenmaal met kinase reactiebuffer (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mm na3vo4, 0,5 mm DTT, pH 7,2) en Voeg 20 μl kinase reactiemengsel toe (2 μg MEK1 (K97A) en 100 μM ATP in 20 μL kinase re actie buffer) per sample.
    Opmerking: De kraal wassen moet voorzichtig en snel worden voltooid, de residuele buffer moet volledig worden opgezuigen voordat het kinase reactiemengsel toe te voegen, en alle operaties bij deze stap moeten worden uitgevoerd bij 4 ° c in een koude ruimte.
  8. Inbroed de kinase reacties bij kamertemperatuur (25 °C) gedurende 10 minuten, en draai de buisjes met kinase reacties met de vingers om de andere minuut tijdens de incubatie.
  9. Voeg 5 μL van 5x SDS sample buffer (375 mM tris · HCl, 9% natriumdodecylsulfaat (SDS), 50% glycerol, 0,03% Bromophenol blauw) per monster om kinase reacties te stoppen, en verwarm vervolgens de monsters bij 90 °C gedurende 5 minuten.
  10. Voer de monsters uit in 9 ~ 12% polyacrylamidegel elektroforese (pagina) met 0,1% SDS, breng de eiwitten over naar nitrocellulose membraan en Detecteer de niveaus van fosho-MEK en RAF mutanten in monsters door immunoblots.
    Opmerking: De fosho-MEK kan ook worden gekwantificeerd met behulp van γ32P-ATP-integratie. Kort, 10 μM γ32P-ATP wordt toegevoegd aan de kinase reactiebuffer, en de hoeveelheid fosforyleerd MEK wordt vervolgens gekwantificeerd na pagina scheiding met behulp van standaard autoradiografie, phosphorimaging, of vloeibare Scintillatie tellings technieken als Passende.

2. RAF co-activatie assay voor de evaluatie van de Allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten

  1. Construct vectoren coderen van de RAF-ontvanger (CRAF kinase domein met unfosforylatable NtA motief, AAFF) of de kinase-Dead RAF Activators (RAF kinase domein met fosforylation-mimicked NtA motief, SSDD, DDEE of DGEE) (Figuur 1A) als beschreven in stap 1,1.
  2. Transfect 293T cellen met twee vectoren coderen zowel de RAF-ontvanger en de kinase-Dead RAF Activator of een enkele vector codering een van eiwitten zoals beschreven in de stappen 1,2 en 1,3.
  3. Vervang het kweekmedium om 24 uur na de transfectie en oogst 293T transfectanten op 48 h om de hele celllysates voor te bereiden zoals beschreven in stappen 1,4 en 1,5.
  4. Meng het schone hele cellysaat met 5x SDS sample buffer snel bij kamertemperatuur (25 °C) en kook vervolgens gedurende 5 minuten bij 90 °C.
  5. Voer de gekookte whole Cell lysaat samples uit in 9 ~ 12% pagina met 0,1% SDS, breng de eiwitten over naar nitrocellulose membraan en Detecteer de niveaus van phospho-ERK1/2 en controle eiwitten door immunoblots.

3. gratis Split Luciferase assay voor het meten van de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van de RAF mutanten

  1. Construct vectoren codering vlag-Tagged RAF mutanten versmolten met het N-eindpunt van Nluc (N-Terminus van Firefly Luciferase, Aa2-416) of het C-eindpunt van Cluc (C-Terminus van Firefly Luciferase, aa398-550) zoals beschreven in stap 1,1.
  2. Transfect 293T cellen met een paar vectoren coderen verschillende Nluc-RAF mutanten en Cluc-RAF mutanten zoals beschreven in stap 1,2.
  3. Bij 24 h na transfectie, replate 293T celtransfectants in Krystal Black beeld platen bij de celdichtheid van 2x105 per goed met kleur vrij medium (dat wil zeggen, DMEM zonder fenolrood).
  4. 24 h later, Voeg D-Luciferin (0,2 mg/ml) aan 293t celtransfectants, inbroed gedurende 30 min, en meet de plaats signalen met behulp van een multi-detectiesysteem (tabel van de materialen).
  5. Na het meten van de plaats-signalen, aspireren de medium en lyse 293t transfectants met lysis buffer om de hele celllysates voor te bereiden zoals beschreven in de stappen 1,4 en 1,5.
  6. Voer de hele cel lysaat samples uit in 9 ~ 12% pagina met 0,1% SDS en Detecteer de uitdrukkings niveaus van nluc-RAF mutanten en cluc-RAF mutanten door Anti-Flag immunoblot zoals beschreven in stap 2,5. De relatieve uitdrukkings niveaus van zowel Nluc-RAF Mutant als Cluc-RAF mutant in 293T transfectants worden gekwantificeerd met behulp van afbeelding J van hun immunoblots.
  7. Normaliseer de plaats-signalen van 293t celtransfectanten volgens de uitdrukkings niveaus van nluc-RAF mutanten en cluc-RAF mutanten. In het kort wordt dit bereikt door het ruwe plaats-signaal te delen door de relatieve uitdrukkings niveaus van nluc-RAF mutanten en cluc-RAF mutanten uit stap 3,6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De familie kinasen van de RAF hebben zowel katalytische als allosterische activiteiten, waardoor hun ziektegerelateerde mutanten de stroomafwaartse signalering kunnen inschakelen via verschillende mechanismen13,14,16,17 ,18. De constitutief actieve RAF mutanten direct fosforylaathun substraten, terwijl de kinase-dode RAF mutanten hun functie vervullen door he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit artikel presenteerden we drie methoden voor het karakteriseren van de ziekte-gerelateerde RAF mutanten, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en gratis Split plaats assay. Aangezien RAF kinases zowel katalytische activiteit als allosterische activiteit hebben, kunnen verschillende RAF-mutanten de stroomafwaartse signalering activeren via twee verschillende mechanismen13,14,16,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag de Hairy Cell Leukemia Fellowship voor steun van Yuan Jimin erkennen. Dit werk werd gesteund door Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), hertog-NUS Khoo Bridge funding Award (hertog-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging subsidie (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), en SHF academische geneeskunde Onderzoeksbeurs (AM/TP011/2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
anti-phosphoERK1/2Cell Signaling Technologies4370
anti-phosphoMEK1/2Cell Signaling Technologies9154
anti-ERK1/2AB clonalA0229
anti-MEK1/2Cell Signaling Technologies9124
anti-FLAG(muis)Sigma-AldrichF3165
anti-HANovus BiologicalsMAB6875
anti-FLAG(Konijn)Cell Signaling Technologies14793
anti-β-actinSigma-AldrichA2228
anti-FLAG kralen(M2)Sigma-AldrichA4596
HRP-geconjugeerd anti-muis IgGJackson Laboratories115-035-003
HRP-geconjugeerd anti-Konijn IgGJackson Laboratories111-035-144
pcDNA3.1(+)In vitrogenV79020
Gibson Assembly Cloning  KitNew England BiolabsE5510
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
Fugene 6Roche11 814 443 001
DMEM zonder fenolroodInvitrogen21063-029
D-luciferine GoldBioLUCK-100
6xhis-getagged MEK1 (K97A) bereid in onze eerdere studiesN.A.Referentie 15.
GloMax-Multi Detectie Systeem.PromegaE7041

Referenties

  1. Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
  2. Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
  3. Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase". FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
  4. Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
  5. Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
  6. Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
  7. McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
  8. Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
  9. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
  10. Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
  11. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
  12. Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
  13. Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
  14. Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
  15. Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
  16. Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
  17. Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
  18. Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
  19. Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
  20. Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
  21. Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795(2018).
  22. Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
  23. Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
  24. Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
  25. Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
  26. Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
  27. Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  28. Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
  29. Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).
  30. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
  31. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
  32. Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
  33. Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).
  34. Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. "RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
  35. García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
  36. Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  37. Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
  38. Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

RAF kinase mutantenkatalytische activiteitsassayallostere activiteitsassaydimeeraffiniteitsmetingGST fusie eiwitco activatie assaysplit luciferase assaykinase dead mutantenconstitutief actieve mutantenselectie van therapeutische strategie
Karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.