Methodenartikel

Detectie van Extravasculaire Trypanosoma -parasieten door fijne naald aspiratie

12K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59798

⸱

7 augustus 2019

 ,  , 
1Comparative Pathology Unit, Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina de Lisboa, 2Biology of Parasitism Laboratory, Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina de Lisboa

In dit artikel

Samenvatting

Fijne naald aspiratie is een techniek, waarbij cellen worden verkregen uit een laesie of orgaan met behulp van een dunne naald. Aspirated materiaal is besmeurd, gekleurd en onderzocht onder een Microscoop voor diagnose of gebruikt voor moleculaire biologie, cytometrie of in vitro analyse. Het is goedkope, eenvoudig, snel en veroorzaakt een minimaal trauma.

Samenvatting

Fine Needle aspiratie (FNA) is een routinematige diagnostische procedure die essentieel is voor zowel medische als veterinaire praktijken. Het bestaat uit de percutane aspiratie van cellen en/of micro-organismen uit palpabele massa's, organen of effusies (vochtophoping in een lichaamsholte) met behulp van een dunne naald vergelijkbaar met de reguliere naald gebruikt voor de veneuze punctie. Het materiaal verzameld door Fna is in het algemeen zeer cellulaire, en de opgehaalde aspiraat wordt vervolgens besmeurd, lucht gedroogd, NAT-vaste, gekleurd en waargenomen onder een microscoop. In de klinische context, FNA is een belangrijk diagnostisch instrument dat dient als een leidraad voor de juiste therapeutische behandeling. Omdat het eenvoudig, snel, minimaal invasief is en beperkte investeringen in het laboratorium en human resources vereist, wordt het op grote schaal gebruikt door veterinaire artsen, meestal in het binnenland, maar ook bij landbouwhuisdieren. In studies met behulp van dierlijke modellen, FNA heeft het voordeel dat het herhaaldelijk kan worden uitgevoerd in hetzelfde dier, waardoor longitudinale studies door de verzameling van cellen van tumoren en organen/weefsels in het verloop van de ziekte. Naast routinematige microscopie, kan teruggevonden materiaal ook worden gebruikt voor immunocytochemie, elektronenmicroscopie, biochemische analyse, Flowcytometrie, moleculaire biologie of in vitro testen. Fna is gebruikt voor het identificeren van de protozoa parasiet Trypanosoma brucei in de geslachtsklieren van geïnfecteerde muizen, het openen van de mogelijkheid voor een toekomstige diagnose bij runderen.

Inleiding

Fijne naald aspiratie (FNA) wordt veel gebruikt bij de diagnose van kanker en niet-neoplastische ziekten, zowel bij mens als huisdieren. De techniek is gestandaardiseerd door de jaren heen en wordt beschreven in tal van studieboeken1,2.

Het bestaat grotendeels uit de percutane aspiratie van voelbare massa's, organen of effusies met een dunne naald aangebracht op een lege spuit, met behulp van de negatieve druk om cellen of vocht uit de massa te trekken1,3. Naalden zijn meestal 22 tot 25 G (gauge overeenkomend met de binnendiameter van de naald), en het gebruik van een grotere boring naald (grote diameter, bijvoorbeeld, 21 G) is nuttig om de cellulariteit te verhogen, hoewel dit overmatige bloed verontreiniging kan produceren. Naald lengte zal afhangen van de diepte van de massa, maar 1 of 11/2 inch wordt vaak gebruikt voor oppervlakkige massa's. Spuiten zijn meestal 5 tot 10 ml, met grotere spuiten het bereiken van hogere vacuüm, die op zijn beurt verhoogt aspiraat rendement. Niet-palpabele diepliggende massa's kunnen ook worden aanzuigen, met langere naalden en onder beeld begeleiding (echografie). Het opgehaalde aspiraat kan vervolgens worden besmeurd, lucht gedroogd, NAT-vast, gekleurd en waargenomen onder een microscoop om een diagnose3 (Figuur 1) te bereiken.

Dit is een eenvoudige, goedkope, pijnloze en minimaal invasieve techniek die voornamelijk wordt gebruikt in de preoperatieve setting om een diagnose te stellen op voelbare massa's en ook voor organen, zoals lymfeklieren, schildklier, prostaat of zelfs de uitwendige mannelijke voortplantings structuren 1. naast het feit dat het een diagnostisch hulpmiddel is, kan deze techniek ook worden gebruikt voor het verzamelen van cellen voor andere doeleinden, namelijk cytogenetica, elektronenmicroscopie (figuur 1d), flowcytometrische karakterisering4,5 ,6,7, oprichting van celculturen8. Een veelvoorkomend voorbeeld in de klinische praktijk is het ophalen van sperma voor in vitro fertilisatie9.

Aspiratie kan meerdere malen in dezelfde massa worden herhaald om meerdere uitstrijkjes te verkrijgen. In het geval van een heterogene laesie, bijvoorbeeld een vast gebied en een cystische ruimte, is het belangrijk dat cellen uit elke regio worden aangezuigen. Het materiaal verzameld door FNA is in het algemeen zeer cellulaire, die in de meeste gevallen maakt het mogelijk voor de diagnose van ziekten zonder de noodzaak voor een weefsel biopsie. Speciale vlekken, immunofluorescentie. immunocytochemie (figuur 1d) en moleculaire technieken kunnen ook worden uitgevoerd in uitstrijkjes verkregen door middel van Fna, bijvoorbeeld voor de identificatie van infectieuze agentia wanneer ze niet herkenbaar zijn door morfologie alleen10. Een beknopt overzicht van de algemene toepassingen en van de benodigde apparatuur en benodigdheden voor FNA zijn samengevat in respectievelijk tabel 1 en 2.

Het eerste rapport over het gebruik van de naald punctie voor diagnostische doeleinden wordt beschreven in vroege geschriften van de Arabische geneeskunde, maar het is in het begin van de 20e eeuw dat moderne naald aspiratie technieken werden geïmplementeerd11. Met name, misschien is het eerste rapport dat het gebruik van Fna suggereert voor de diagnose van besmettelijke ziekten een studie in 1904, waar Grieg en Gray rapporteerden naald aspiraties van lymfeklieren van patiënten met slapende ziekte onthulde motiel trypanosomen12 . De auteurs rapporteerden de aanwezigheid van trypanosomen in zowel vroege als gevorderde gevallen, en bij een hogere dichtheid dan die gezien in bloeduitstrijkjes, waar dit vaak zeldzame gebeurtenissen12zijn.

De huidige diagnose van trypanosomiasis bij rundvee berust op de directe observatie van parasieten in het bloed, lymfe of in immunodiagnostische technieken13,14,15. We hebben eerder aangetoond dat in experimentele Trypanosoma -infecties in de muis Trypanosoma brucei (T. brucei) een opmerkelijk tropisme heeft voor vetweefsel16 en ook voor enkele van de uitwendige mannelijke voortplantings structuren, namelijk epididymis17. Parasieten accumuleren in de stroma van deze weefsels in grote aantallen16.

Onderstaand protocol beschrijft een gedetailleerde stapsgewijze technische procedure voor Fna in levende muizen, gericht op de aspiratie van trypanosomen die aanwezig zijn in de uitwendige mannelijke voortplantings structuren (testis, epididymis en epididymale vet), gevolgd door conventionele cytologie en immunokleuring voor specifieke parasiet eiwitten (VSG)16,17. Aspiratie werd uitgevoerd 6 dagen na de infectie en de veiligheidsprocedures die van toepassing zijn die vaak worden vastgesteld voor routine behandeling van proefdieren. Er zijn extra maatregelen nodig voor dieren met Immuundeficiënties (het dragen van een met stoom gesteriliseerde Gown, masker, haar motorkap, steriele handschoenen, en het garanderen van een aseptische techniek te allen tijde) om onbedoelde blootstelling aan opportunistische pathogenen te beperken.

Protocol

Alle dier experimenten in dit protocol werden uitgevoerd volgens de EU-voorschriften en goedgekeurd door de ethische commissie dieren van Instituto de Medicina Molecular (iMM), (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). De faciliteit voor de inrichting van de iMM voldoet aan de Portugese wetgeving voor het gebruik van proefdieren (Wetsdecreet 113/2013) en volgt de Europese richtlijn 2010/63/EU en de FELASA (Federatie van Europese laboratorium Dierenwetenschappen verenigingen) richtsnoeren en aanbevelingen betreffende het dierenwelzijn in het laboratorium.

1. aspiratie van parasieten uit de uitwendige mannelijke voortplantingsorganen van de muis

Opmerking: Fijne naald aspiratie (FNA) werd uitgevoerd in wild-type Male C57BL/6J muizen, 6 tot 10 weken oud, geïnfecteerd met T. brucei door intraperitoneale injectie van 200 μL zoutoplossing met 2.000 parasieten zoals eerder beschreven16.

  1. Voor FNA van de uitwendige mannelijke voortplantingsorganen, plaats de muis in een laminaire stroom afzuigkap, anesthetiseer het dier met een intraperitoneale injectie van 200 μL van een mengsel van 75 mg/kg ketamine + 1 mg/kg Medetomidine in zoutoplossing.
    1. Bevestig anesthetisering met de teen pinch methode. Wanneer de reflex van de terugtrekking van het been afwezig is, plaats de muis in de dorsale ligpositie (Figuur 2a).
    2. Zorgvuldig palperen de testis, beoordeling van de grootte en de afstand van de bovenliggende huid. Restrain het orgel tussen de index en middelvinger of tussen de wijsvinger en duim. Strek de bovenliggende huid strak over de massa om het doelwit verder te immobiliseren. Reinig het oppervlak met alcoholdoekjes (Figuur 2a).
    3. Houd de geassembleerde 22 G naald en 5 mL spuit vast en steek de naaldpunt in het doelwit, altijd met de zuiger in de rusttoestand (Figuur 2b-C).
    4. Breng zuigkracht aan door de zuiger van de spuit in te trekken naar de 4 mL tot 5 mL Mark 2-3 keer. Leid de naald binnen het orgel ofwel in een rechte lijn of langs verschillende raaklijnen om de waarschijnlijkheid van een representatief monster te vergroten en om kleinere structuren zoals de epididymis te richten. Zorg ervoor dat deze procedure zacht is, om beschadiging van het weefsel te minimaliseren (figuur 2c-D).
    5. Laat de zuigkracht los en trek de naald vervolgens terug. Trek de naald niet opnieuw met de teruggetrokken zuiger omdat dit zal leiden tot de zuigkracht van het aspiraat in de loop van de spuit en het herstel ervan belemmert (figuur 2e). Na het terugtrekken van de naald, controle van eventuele bloedingen door het aanbrengen van druk met een gesteriliseerde gaas spons op de prikplaats.
    6. Koppel de spuit los van de naald, vul hem met lucht, sluit de naald weer aan en werp de inhoud van de naald voorzichtig op een glaasje uit. Plaats de punt van de naald heel dicht of zelfs op de glijbaan om spettering te voorkomen (figuur 2F-I).
    7. Voer ten minste één extra aspiratie per orgaan/dier uit om ervoor te zorgen dat de bemonstering wordt gerepliceerd.
    8. Terugkeren anesthesie met een subcutane injectie van 200 μL van 1 mg/kg Atipamezole in zoutoplossing en terug te keren dieren naar hun huis kooi voor herstel en observeren tot volledig herstel.

2. Smear voorbereiding van het Aspirated materiaal

Opmerking: Gebruik handschoenen gedurende de hele procedure en zorg voor een veilige afvoer van naalden en spuiten.

  1. Twee stappen pull-methode
    1. Pak de glijbaan met de druppel van de aspiraat met behulp van de niet-dominante hand, en knijp het matte uiteinde tussen de duim en wijsvinger (Figuur 3a).
    2. Pick-up een tweede schone glijbaan, de strooier glijbaan, met de dominante hand en breng het over de eerste dia met de druppel van de aspirate. Plaats de gladde, schone rand van de glijbaan op de preparaat glijbaan net boven op de druppel onder een hoek van ongeveer 30 ° (Figuur 3b).
    3. Beweeg de schuif voorwaarts met één lichte, continue en constante beweging om een dunne film te verkrijgen (figuur 3c).
    4. Laat de glijbaan rusten en maak de volledige en snelle luchtdroging van het materiaal mogelijk (figuur 3D). Niet verwarmen-repareren. Label de matte rand van de dia met een potlood.
      Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken bij deze stap en uitstrijkjes kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen totdat ze klaar zijn om te worden gekleurd.

3. vlekken van de uitstrijkjes

Opmerking: Gebruik handschoenen gedurende de hele procedure en zorg ervoor dat de stappen 3.1.4 en 3.2.9 worden uitgevoerd in een rook afzuigkap.

  1. Giemsa-kleurings Protocol
    1. Bevestig Luchtgedroogde uitstrijkjes door de glaasjes in een Coplin pot te dompelen met 100% methanol gedurende 5 min (figuur 3e).
    2. Breng de dia in een Coplin-pot met 20% Giemsa-oplossing (verdund tot 1/5 in gedistilleerd water) gedurende 30 minuten of 10% Giemsa gedurende 10 minuten (figuur 3F).
    3. Afspoelen in kraanwater en grondig drogen met behulp van tissuepapier om te deppen.
    4. Houd de dia horizontaal en breng één druppel van het niet-waterige bevestigings medium op het uitstrijkje aan. Plaats de rand van een afdekglas op de glijbaan, verlaag het en druk zachtjes om eventuele luchtbelletjes te verwijderen.
  2. Immunocytochemie in FNA-uitstrijkjes
    1. Fix Luchtgedroogde uitstrijkjes in 100% methanol bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
    2. Was de glijbaan 5 min in een Coplin potje met 1x fosfaatbuffer (PBS), herhaal deze stap 3 keer met elke keer verse 1x PBS.
    3. Verwijder de dia van Coplin jar, veeg overtollige buffer af zonder het uitstrijkje aan te raken en teken een cirkel rond het uitstrijkje met een waterafstotende pen (tabel met materialen).
    4. Houd de dia horizontaal en breng 150 μL van de verdunde primaire antilichaam oplossing aan op elke uitstrijkje en incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Primair antilichaam dat hier wordt gebruikt, is een niet-gezuiverd konijn serum anti-T. brucei VSG13 antigen (cross-reactief met veel T. brucei vsgs, in eigen huis geproduceerd), verdund in 1x PBS bij 1:50000. Voer negatieve controles uit door het geschikte primaire antilichaam te vervangen door het preimmuunserum (tabel met materialen) om de niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam te kunnen beoordelen.
    5. Was de glijbaan 5 min in een Coplin potje met 1x PBS, herhaal deze stap 3 keer met elke keer verse 1x PBS.
    6. Houd de dia horizontaal en breng 150 μL in de handel verkrijgbare mierikswortelperoxidase/DAB visualisatie systeem aan op elk uitstrijkje. Inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (tabel van de materialen).
    7. Wassen voor 3x voor 5 min in 1x PBS.
    8. Contra vlek door het onderdompelen van de dia's in een Coplin jar met Harris hematoxylin. Afspoelen in kraanwater en grondig drogen met behulp van papier om te deppen.
    9. Houd de dia horizontaal en breng één druppel van het niet-waterige bevestigings medium op het uitstrijkje aan. Plaats de rand van een afdekglas op de glijbaan, verlaag het en druk zachtjes om eventuele luchtbelletjes te verwijderen.

Resultaten

Fna werd uitgevoerd in de uitwendige mannelijke voortplantingsorganen van muizen geïnfecteerd met T. brucei met behulp van een 22 G naald gekoppeld aan een 5 ml spuit, en glaasjes voor de uitstrijkje preparaat (Figuur 1a-C). De methode is eenvoudig, maar optimale resultaten vertrouwen op kritische stappen: perfecte immobilisatie van de muis bereikt door algemene anesthesie, en stabilisatie van de organen gedurende de hele procedure (Figuur 2a-B). Zuigkracht werd 2-3 keer toegepast en naald omgeleid 1-2 keer om representatieve bemonstering van de kleinere organen en weefsels toe te staan: epididymis en epididymale vet. Negatieve druk werd vrijgegeven vóór het externaliseren van de naald. Het aspiraat in het lumen en de naaf van de naald (ongeveer 20 μL) werd gebruikt voor de productie van 2 uitstrijkjes (Figuur 3a-C). In gevallen waarin de naald werd teruggetrokken zonder de afgifte van de zuigkracht, werd het materiaal in de spuit gezogen en kon het niet worden hersteld. Het proces werd twee keer met succes herhaald, één voor elk gepaarde orgel. Na droging werden uitstrijkjes NAT-vast en immunocytochemie voor de trypanosoom oppervlakte-eiwitten werd uitgevoerd.

Een uitstrijkje van goede kwaliteit (figuur 4a-C) werd gekenmerkt door een monolaag van cellen met een goede cellulaire dichtheid, waarin gastheer cellen bewaarde morfologische kenmerken vertonen, waardoor de identificatie van hun weefsel van oorsprong en relatieve verhouding tussen elkaar. Parasieten waren efficiënt immuno-gekleurd, identificeerbaar en Telbaar (figuur 4b). Een geval van een FNA-vlies van een peritoneale effusie in een geïnfecteerde muis, gekleurd met Giemsa voor directe observatie en diagnose, wordt ook getoond (figuur 3D-F en figuur 4c).

Een slecht of negatief FNA-resultaat kan te wijten zijn aan verschillende redenen: (1) te weinig FNA-materiaal wordt op de glijbaan uitgedrukt en is onderrepresentatief voor het monster; (2) te veel FNA-materiaal wordt uitgedrukt op een enkele dia, waardoor te dikke uitstrijkjes worden gemaakt en cytologische evaluatie wordt afbreuk doen; (3) te veel kracht wordt toegepast bij het maken van het uitstrijkje en cellen worden verstoord, wat resulteert in veel naakte kernen en DNA-strepen (Crush-artefact); of (4) er wordt niet genoeg kracht uitgeoefend wanneer het uitstrijkje en de cellen niet worden opgesplitst, wat resulteert in een gestratificeerde laag die de evaluatie van de morfologische kenmerken van de cellen belemmert (Figuur 5).

Wanneer we de FNA-cytopathologie vergelijken met Histopathologie, d.w.z. de analyse van cellen versus weefsels, heeft de vuist het voordeel dat de cellulaire morfologie beter bewaard blijft en de relatieve verhoudingen en het tellen van cellen beter kunnen worden beoordeeld (Figuur 6). Bovendien is immunocytochemie eenvoudiger, sneller en gemakkelijker te optimaliseren dan immunohistochemie, die meestal wordt uitgevoerd in formalin-vast en paraffineingebed weefsel.

DoelToepassingenVoordelenBeperkingen
Palpable massaRoutine matige microscopie, diagnoseEenvoudige, snelleGeen weefsel architectuur
OrgelImmunohistochemistryLage kostenBlind aspiratie (naald kan het doelwit tangentially missen; aspiratie kan gericht zijn op necrotische, cystic of hemorragische gebieden)
EffusiesStroom cytometrieBemonstering van meerdere sites
CytogeneticaGoed bewaarde cellulaire morfologie
ElektronenmicroscopieVrij van complicaties
PCR, andere moleculaire techniekenHoge diagnostische nauwkeurigheid
Biochemische analyseAnesthesie (voor immobilisatie)
In vitro assays, celkweekNiet-terminale procedure

Tabel 1: doel, algemene toepassingen, voordelen en beperking van fijne naald aspiratie.

FNA-pakketArchetype van een aspiratie naald en spuit
Aspiratie:Naald onderdelen:
1. wegwerp plastic spuiten (5 of 10 mL) (Figuur 1b) Schuine kant. Uiteinde van de naaldschacht is schuin om een punt te vormen, het schuin is de schuine kant. Alleen afgeschuinde naalden zijn geschikt voor percutane aspiraties.
3. naalden van 22 tot 25-gauge (diameter); 0,75, 1,0, 1,5 inches lang, met standaard schuine naaldpunt rand (Figuur 1a) Schacht. Holle buis gedeelte van de naald waarvan de lengte kan worden aangepast volgens de diepte van de massa. De gauge van de naald komt overeen met de diameter van de boring, dat is de diameter van de binnenkant van de schacht (kleinere naalden hebben een hogere gauge). Het gebruik van grotere boor naalden (minder dan 22 G) is nuttig om de cellulariteit te verhogen, hoewel dit overmatige iatrogene bloed verontreiniging kan produceren.
1. anesthesie (indien nodig). Pijn geassocieerd met FNA is vergelijkbaar met die van een veneuze punctie, maar een goede aspiratie vereist een goede immobilisatie van het onderwerp, vooral belangrijk bij kleine dieren en/of voor kleine, fluctuerende laesies en organen. Ratten en muizen onderworpen aan FNA moeten adequaat passief worden ingetogen, of, indien nodig, verdoofd of onder lichte algemene anesthesie. Hub. Plastic gedeelte van de naald dat aan de spuit is bevestigd; moet transparant zijn om de visualisatie van het aanzuiging materiaal mogelijk te maken. Het aanzuiging materiaal verkregen tijdens het FNA-punt moet worden opgevangen in de naaldschacht en de aspiratie gestopt wanneer materiaal wordt gezien het invoeren van de hub.
FNA-uitstrijkje en interpretatie:Onderdelen van de spuit:
1. Frosted eind glas Microscoop dia's (figuur 1c) Vat/cilinder. Het holle gedeelte van de spuit. Tenzij het omgaan met Cystic laesies of effusies, materiaal dat wordt aangekoerd aan het vat over het algemeen niet kan worden teruggewonnen. Het ideale volume aspiraat voor de Fna-cytologie is ongeveer 5 μL, overeenkomend met het gemiddelde volume aspiraat dat de as en het knooppunt van de naald inneemt.
2. romanowsky type vlekken (bv. diff-quik, Giemsa) Tip. Uiteinde van het vat waarop de naald naaf is bevestigd.
3. Microscoop (helder-veld) Zuiger. Beweegbaar gedeelte van de spuit met een vlakke schijf of lip aan de ene kant en een rubberen afdichting aan de andere kant. Past in het vat en geeft de druk om de cellen te tekenen, vloeistof in de naald. Een perfect verzegelde zuiger die een goede negatieve druk creëert is verplicht om een goede aspiraat-opbrengst te verkrijgen.

Tabel 2: benodigde apparatuur en benodigdheden voor fijne naald aspiratie.

figure-results-1
Figuur 1 : Gereedschappen en resultaten voor fijne naald aspiratie. (A) ideale diameter van de naald voor Fna is van 22 tot 25 G. (B) ideaal spuit volume om een goede aspiraat-opbrengst te verkrijgen van 5 tot 10 ml. C) schoon, droog, vrij van vet glas glijbaan met Frosted markeringsgebied voor het schrijven met potlood en voorgelakt (indien voor immunohistochemie). (D) voorbeeld van trypanosomes die zijn waargenomen met Giemsa-kleuring (zwarte pijlpunt), IMMUNOGEKLEURD voor de VSG-oppervlakte eiwitten (witte pijlpunt) en onder transmissie elektronenmicroscopie (blok pijl). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2 : Schema's met fijne naald aspiratie (FNA) van de uitwendige mannelijke voortplantingsorganen (testis, epididymis, en epididymale vet) bij muizen. A) zodra het dier is vastgezet, wordt het eerder gemonteerde aspiratie-instrument opgepikt. (B-C) Steek de naaldpunt in het doelorgaan. (D) Breng de zuigkracht aan door de zuiger van de spuit in te trekken naar de 1 ml tot 2 ml markering, herhaaldelijk 3-4 keer. Naaldpunt kan ook heen en weer worden verplaatst binnen het doelwit tijdens het aanbrengen van zuigkracht, om voldoende materiaal te verzamelen. (E) laat de zuigkracht los en trek de naald pas terug. (F) Verwijder de naald uit de spuit en (G) Trek de zuiger terug. (H) Bevestig de naald opnieuw. (I) zet het materiaal op een glazen glijbaan door de zuiger snel door de spuit te duwen. Om spettering te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de punt van de naald heel dicht of zelfs op de glijbaan rust. De druppel aspiraat wordt ongeveer 1 cm van de rand van het Frosted markeringsgebied geplaatst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3 : Smear preparaat en kleuring. (A) Houd het ene uiteinde van de dia (Frosted gebied) tussen de duim en wijsvinger. B) plaats de gladde rand van een tweede dia (spreider) op de preparaat glijbaan vlak voor de druppel van het materiaal. (C) Schuif de spread eenmaal met matige snelheid naar voren om een dunne film te verkrijgen. D) laat de schuif aan de lucht drogen en label de matte rand van de dia met een potlood. E) na volledige droogoplossing met methanol gedurende 5 min. (F) beits met 20% Giemsa-oplossing gedurende 30 min (of 10% Giemsa gedurende 10 min). Spoel lichtjes af met water, droog volledig, dip in xyleen en gemonteerd met een in water onoplosbare bevestigingsmiddel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4 : Micro foto's van uitstrijkjes verkregen uit Fna van uitwendige mannelijke voortplantings structuren bij muizen T. brucei. A) bruto verschijningsvorm van een direct uitstrijkje van goede kwaliteit: het materiaal werd op ongeveer 1 cm afstand van de matte rand (zwarte stip) op de glijbaan uitgedrukt, Besmeurd en 0,5 cm voor de rand van de glijbaan (parallelle lijnen) gestopt. B) immunocytochemie voor de oppervlakte-eiwitten van de parasiet (VSG) werd uitgevoerd voor uitstrijkjes verkregen uit Fna van de uitwendige mannelijke voortplantingsorganen op de dag 6 van de infectie. Er werden talrijke parasieten (pijlpunt) aangetroffen, vermengd met muizen kiemcellen (Arrow). DAB met Harris hematoxylin. Oorspronkelijke vergroting: 40x (schaalbalk = 50 μm). C) Giemsa-kleuring van het uitstrijkje verkregen na Fna van een peritoneale effusie op dag 21 van de infectie, toonde talrijke parasieten (pijlpunt) vermengd met gastheer (muis) cellen, in dit geval ontstekingscellen, macrofagen (Arrow) en lymfocyten. Oorspronkelijke vergroting: 40x (schaalbalk = 50 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5 : Slechte kwaliteit Fna-uitstrijkjes. A) slecht cellulair uitstrijkje, onderrepresentatief voor de massa of het orgaan. (B) zeer dik uitstrijkje. (C) verpletterd artefact, met verstoorde cellen, naakte kernen en DNA-strepen. D) aggregaten en gestratificeerde lagen cellen. DAB met Harris hematoxylin. Oorspronkelijke vergroting: 20 x (schaalbalk = 100 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6 : Vergelijking van epididymale cytologie en histologie bij muizen die besmet zijn met T. brucei. A) micro Foto's die corresponderen met een Fna-uitstrijkje en (B) een paraffine gedeelte van 4 μm, met dezelfde vergroting (oorspronkelijke vergroting van 20x, schaalbalk = 100 μm), beide immunogekleurd voor de oppervlakte eiwitten van de parasiet (VSG). Het uitstrijkje toonde grote aantallen parasieten (pijlpunt) met goed bewaarde cellulaire morfologie, vermengd met gematigde aantallen kiemcellen en weinig spermatozoa (Arrow). De histologische sectie toonde een goed bewaard gebleven weefsel architectuur, samengesteld uit epididymale kanalen met intra-Luminale spermatozoa (Arrow), en de aanwezigheid van grote aantallen parasieten uitbreiding van de epididymale Stroma (pijlpunt). DAB met Harris hematoxylin. Oorspronkelijke vergroting: 20 x (schaalbalk = 100 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Fijne naald aspiratie (FNA) is een methode die op grote schaal wordt gebruikt voor de diagnose van ziekten bij mens en huisdieren. De techniek is gestandaardiseerd over vele jaren1,2, diegebruik maakt van een kleine boring naald te aspireren cellen of vloeistof uit een palpabele massa of orgaan1,3. Het aspiraat wordt dan meestal besmeurd op een glazen glijbaan en gekleurd voor microscopische observatie om een diagnose te stellen, maar de techniek kan ook worden gebruikt om cellen op te halen voor andere doeleinden4,5,6, 7 , 8 , 9.

De procedure is snel (< 5 min per muis, voor een ervaren onderzoeker) en het risico op complicaties is minimaal, vergelijkbaar met het risico dat ontstaat bij het ondergaan van een eenvoudige veneuze punctie. Om deze reden, voor FNA van palpabele massa's, anesthesie is alleen nodig voor gevoelige anatomische locaties of wanneer een goede immobilisatie van het dier en stabilisatie van het orgel of de massa te zuigen is uiterst belangrijk voor optimale resultaten. Dit is vaak voor kleine laboratoriumdieren, als veilige en effectieve terughoudendheid van een kleine knaagdier met één hand, terwijl het waarborgen van de beste toegang tot het gebied voor aspiratie met de andere hand, is moeilijk te bereiken zonder verdoving. Kortdurende anesthesie is in de meeste gevallen voldoende, niettemin noodzakelijk, voor een goede FNA in de muis. Een goede immobilisatie maximaliseert de kans op het verkrijgen van een aspiraat dat representatief is voor de cellulaire componenten van de laesie en minimaliseert ook de kans op het externaliseren van de punt van de naald terwijl negatieve druk wordt uitgeoefend.

Hoewel de procedure zelf zeer eenvoudig is, zijn de gecoördineerde toepassing en het vrijkomen van vacuüm de meest kritieke stappen. Na het inbrengen van de naald wordt de zuiger van de spuit teruggetrokken om een gecontroleerd vacuüm (zuigkracht) te bereiken en kan de naald alleen uit de massa worden verwijderd na het vrijgeven van de negatieve druk door de zuiger los te laten (Figuur 2); anders wordt de aspiraat in de loop van de spuit gezogen en is het dan zeer moeilijk om te herstellen. Een andere zeer belangrijke stap is de voorbereiding van kwalitatief hoogstaande smears. Er zijn verschillende methoden om een uitstrijkje te maken, maar ongeacht de methode moeten uitstrijkjes onmiddellijk worden bereid nadat het materiaal op het glas is geplaatst. Het biologisch materiaal moet voorzichtig worden uitgespreid om celcrush-artefacten te voorkomen. Gebruik van een dekslip als strooier kan helpen voorkomen dat deze artefacten. Echter, de toepassing van te veel kracht tijdens het maken van het uitstrijkje zal breken de dekslip. Een uitstrijkje van goede kwaliteit heeft meestal de meeste celpopulatie verdeeld als monolaag zodat ze gemakkelijk licht kunnen verzenden. Cellulair materiaal mag niet overmatig worden gevangen in het bloedstolsel.

Het doel van een FNA is om cellen te verzamelen van een massa, weefsel of orgaan. Het gebruik van grotere boring naalden is nuttig om de cellulariteit te verhogen, maar kan worden geassocieerd met overmatige bloed verontreiniging, terwijl de bemonstering met kleinere naalden hogere kwaliteit oplevert, hoewel minder overvloedig materiaal. In ons geval, percutane aspiratie van de uitwendige mannelijke voortplantings structuren bij muizen experimenteel geïnfecteerd met T. brucei, werd uitgevoerd met 22-gauge naalden gekoppeld aan een 5 ml spuit. Muizen werden verdomiliseerd, de testis werd gestabiliseerd met één hand en punctie en aspiratie geleid en uitgevoerd met de andere hand. We hebben talrijke trypanosomen vermengd met geslachtscellen, spermatozoa, epitheliale cellen en stromale cellen, die werden besmeurd en immunogekleurd voor de oppervlakte-eiwitten van de parasieten (VSG) (Figuur 4).

Er is altijd de potentiële bemonsterings fout bij aspiraties die negatieve resultaten opleveren, omdat hoewel meerdere gebieden van een bepaalde laesie meerdere keren kunnen worden bemonsterd, dit een blinde aspiratie is waarbij we de naaldpunt en het doelorgaan of de massa niet visualiseren. Dit is zeer relevant in een klinische setting, waarbij een negatief FNA-punt van een verdachte laesie geen verdere onderzoeken overbodig maakt, maar het is niet zo relevant in diermodellen van de ziekte. Algemene beperkingen omvatten dus voornamelijk vals negatieve resultaten en minder vaak vals-positieve resultaten (bijvoorbeeld van bloed verontreiniging), maar de belangrijkste beperking bij het vaststellen van dier experimenten is het gebrek aan informatie over weefsel architectuur17, zoals we hebben met Histopathologie, bijvoorbeeld distributie patroon van parasieten, van immune cellen, en cel-cel interactie functies. Niettemin, voordelen zijn dat FNA is een niet-terminale procedure waardoor de herhaalde bemonstering in hetzelfde dier over-tijd en altijd zorgt voor een beter bewaarde cellulaire morfologie (Figuur 5). Alternatieven voor FNA voor het oogsten van gastheer cellen, immuuncellen of micro-organismen van een muis vertrouw altijd op euthanatatie van de muis om de massa of de organen van belang te verzamelen.

Naar onze kennis, er zijn slechts een paar rapporten over het gebruik van FNA in kleine laboratoriumdieren, een van 1949 overeenkomend met de aspiratie van beenmerg met 22 G naald voor het bestuderen van Hematopoiesis18, en alle andere in combinatie met Flowcytometrie te Kwantificeer ofwel tumor-geassocieerde ontstekingscellen of endotheel cellen7,19,20. Ons werk toont aan dat deze techniek kan worden uitgebreid tot de diagnose en studie van infectieuze ziekte modellen en cytologie kan combineren met technieken zoals immunocytochemie of elektronenmicroscopie. Twee van de belangrijkste voordelen van de methode bij proefdieren zijn: (1) deze procedure is geen Terminal, d.w.z. kan worden uitgevoerd in levende muizen; en (2) vanwege de milde ernst maakt het mogelijk voor seriële aspiraties in hetzelfde dier. Er zijn dus minder muizen nodig voor elke studie, en de correlatie tussen progressie van klinische ziekte en evolutie van de cellulaire en moleculaire kenmerken van een ziekte en/of micro-organisme kan gemakkelijk worden uitgevoerd, waardoor longitudinale studies mogelijk zijn.

Misschien is het eerste verslag over het gebruik van Fna voor de diagnose van een besmettelijke ziekte een studie van Grieg en grijs in 1904, die de naald aspiraties van lymfeklieren rapporteert van patiënten met slaapziekte, die motiel trypanosomen12onthulde. Als onze bevindingen in laboratorium muizen vertaling naar runderen vinden, d.w.z. dat als Trypanosoma gemakkelijk door Fna kan worden bemonsterd vanuit de uitwendige mannelijke voortplantings structuren, men kan verwachten dat deze techniek nuttig zal zijn voor dierenartsen voor de diagnose van dier immunrespons in-boerderij, in vee.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit project werd gefinancierd door Fundação para a Ciência e a tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) via Fundos do Orçamento de Estado (Ref.: ID/BIM/50005/2019). LMF is onderzoeker van de Fundação para a Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014) en het laboratorium wordt gefinancierd door ERC (FatTryp, Ref. 771714). Publicatie van dit werk werd ook gefinancierd UID/BIM/50005/2019 project gefinancierd door Fundação para a Ciência e a tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) via Fundos do Orçamento de Estado. We danken Andreia Pinto uit het laboratorium voor histologie en vergelijkende pathologie van de iMM voor deskundige elektronenmicroscopie assistentie, en Sandra Trindade, Tiago Rebelo en Henrique Machado (iMM) voor het delen van weefsels van geïnfecteerde muizen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL)Bio 27418046Anesthesie omkering
Cover slips (24 x 60 No.1)VWR631-0664Smear maken
DABDakoK3468Immunoctytochemie
Entellan (500 mL)VWR1.07961.0500Montage media
Envision Flex antibody diluent Dako8006Immunoctytochemie
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit)DakoK4010Immunoctytochemie
Envision Flex Wash Buffer DakoK8007Immunoctytochemie
Giemsa stain Atom Scientific LtdRRSPSS-ASmear staining
Glass slides (Superfrost Plus)VWR631-9483Smear maken
Harris Haematoxylin Bio-optica05-06004EImmunoctytochemie
Hydrogen Peroxide solution SigmaH1009-500MLImmunoctytochemie
Hypodermic needles Microlance 3 (23 G)Henry Schein902-8001Aspiratietechniek
Ketamin (IMALGENE 1.000-10 mL)Bio 27410928Anesthesie
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) Bio 27418335Anesthesie
MethanolMerck1.06009.2511Smear fixatief
Pap pen MerckZ377821-1EAImmunoctytochemie
Protein Block Serum free DakoX0909Immunoctytochemie
Syringes (5 mL, 10 mL)Henry Schein900-3311, 900-3304Aspiratietechniek

Referenties

  1. Leopold, G., Koss, M. R. M. Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. , Lippincott Williams and Wilkins. (2006).
  2. Raskin, R. E., Meyer, D. J. Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. , (2016).
  3. Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185 (3), 819-824 (1992).
  4. Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107 (33), 14524-14529 (2010).
  5. Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
  6. Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40 (4), 307-319 (1998).
  7. Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
  8. Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43 (6), 985-990 (1999).
  9. Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63 (5), 1038-1042 (1995).
  10. Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120 (3), 351-367 (1998).
  11. Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47 (2), 191-197 (2009).
  12. Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1 (2265), 1252(1904).
  13. Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47 (6), 727-734 (1972).
  14. Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. , 1-15 (2009).
  15. Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12 (2), 186-194 (2012).
  16. Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19 (6), 837-848 (2016).
  17. Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), 1-15 (2018).
  18. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (2013).
  19. Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13 (3), 251-258 (2010).
  20. Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21 (7), 648-661 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cytologische procedureuitstrijkstervingGiemsa kleuringimmunocytochemieflowcytometrieelektronenmicroscopiemoleculaire biologiein vitro assays

Gerelateerde artikelen