Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek

9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59810

⸱

16 september 2019

 , 
1Apoptosis, Cancer and Development Laboratory - Equipe labellisée 'La Ligue', LabEx DEVweCAN, Centre de Cancérologie de Lyon, INSERM U1052-CNRS UMR5286, Centre Léon Bérard, 2Department of Radiology/Molecular Imaging Program at Stanford, School of Medicine, Stanford University

In dit artikel

Samenvatting

De in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL)-methode kan worden gebruikt om in vivo biodistributie van antilichamen en antilichaam conjugaten voor oncologische doeleinden in levende organismen te onderzoeken met behulp van een combinatie van in vivo tumor targeting en ex vivo-immunokleuring Methoden.

Samenvatting

Monoklonale antilichamen (mAbs) zijn belangrijke instrumenten voor de opsporing, diagnose en behandeling van kanker. Ze worden gebruikt om de rol van eiwitten in tumorigenesis ontrafelen, kan worden gericht aan kanker biomarkers waardoor tumor detectie en karakterisering, en kan worden gebruikt voor kankertherapie als mAbs of antilichaam-drug conjugaten te activeren immune Effector cellen, remmen signalering van trajecten, of direct dodencellen die het specifieke antigeen dragen. Ondanks klinische ontwikkelingen in de ontwikkeling en productie van nieuwe en zeer specifieke mAbs, diagnostische en therapeutische toepassingen kunnen worden aangetast door de complexiteit en heterogeniteit van de tumor micro omgeving. Voor de ontwikkeling van efficiënte therapieën en diagnostiek op basis van antilichamen is het dus cruciaal om de biodistributie en interactie van het op antilichamen gebaseerde geconjugeerde met de levende tumor microomgeving te beoordelen. Hier beschrijven we in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL) als een nieuwe benadering om interacties van op antilichamen gebaseerde therapieën en diagnostiek in de in vivo fysiologische en pathologische omstandigheden te bestuderen. In deze techniek wordt een therapeutisch of diagnostisch antigeen-specifiek antilichaam intraveneus geïnjecteerd in vivo en gelokaliseerde ex vivo met een secundair antilichaam in geïsoleerde tumoren. IVIL weerspiegelt daarom de in vivo biodistributie van op antilichamen gebaseerde geneesmiddelen en doelstoffen. Twee IVIL-toepassingen worden beschreven bij het beoordelen van de biodistributie en de toegankelijkheid van contrastmiddelen op basis van antilichamen voor moleculaire beeldvorming van borstkanker. Dit protocol stelt toekomstige gebruikers in staat om de IVIL-methode aan te passen voor hun eigen op antilichamen gebaseerde onderzoekstoepassingen.

Inleiding

Monoklonale antilichamen (mAb) zijn grote glycoproteïnen (ongeveer 150 kDa) van de immunoglobuline superfamilie die worden uitgescheiden door B-cellen en die een primaire functie in het immuunsysteem hebben om de biologische functie van, of markeren voor vernietiging, bacteriële of virale pathogenen, en kan abnormale eiwit expressie op kankercellen herkennen1. Antilichamen kunnen een extreem hoge affiniteit hebben met hun specifieke epitopen tot en met femtomollaire concentraties, waardoor ze veelbelovend zijn in biogeneeskunde2. Met de ontwikkeling van hybridoma-technologie door Milstein en Köhler (bekroond met de Nobel prijs in 1984), werd de productie van mAbs mogelijk3. Later werden menselijke MABS gegenereerd met behulp van de faag display technologie of transgene muis stammen en revolutioneerden hun gebruik als nieuwe research tools en Therapeutics4,5.

Kanker is een wereldwijd gezondheidsprobleem en een belangrijke doodsoorzaak die de behoefte aan nieuwe benaderingen voor preventie, opsporing en therapie6creëert. Tot nu toe, MABS hebben toegestaan verdrievoudiging van de rol van genen en hun eiwitten in tumorvorming en wanneer gericht tegen kanker biomarkers, kan tumor detectie en karakterisering voor patiënt stratificatie. Voor kankertherapie, bispecifieke mAbs, antilichaam-drug conjugaten, en kleinere antilichaam fragmenten worden ontwikkeld als Therapeutics, en voor de beoogde drug delivery ter verbetering van de therapeutische werkzaamheid7. Daarnaast dienen antilichamen voor de biomarker-targeting van contrastmiddelen voor moleculaire beeldvormings modaliteiten zoals fluorescentie geleide chirurgie, photoacoustic (PA) beeldvorming, echografie (VS) moleculaire beeldvorming en klinisch gebruikte positron-emissie tomografie (PET) of enkelvoudige foton emissie computertomografie (SPECT)8. Tot slot kunnen antilichamen ook worden gebruikt als theranostische middelen die stratificatie van patiënten mogelijk maken en respons monitoring voor gerichte therapieën9. Daarom beginnen nieuwe mAbs een cruciale rol te spelen bij de opsporing, diagnose en behandeling van kanker.

Ondanks kritische vooruitgang in de ontwikkeling en productie van nieuwe en zeer specifieke mAbs, diagnostische en therapeutische toepassingen kunnen worden weergegeven ineffectief als gevolg van de complexiteit van de tumor omgeving. Interacties tussen antilichamen zijn afhankelijk van het type epitope,d.w.z. ofhet lineair of conformationeel10is. Naast de herkenning van antigenen moeten antilichamen natuurlijke barrières overwinnen, zoals de wanden van het vat, basale membranen en de tumor stroma om doelcellen te bereiken die het antigeen uitdrukken. Antilichamen communiceren niet alleen met het weefsel via het variabele fragment antigen binding (FAB) domein, maar ook via het constant kristallijne fragment (FC) dat verder leidt tot off-site interacties11. Targeting wordt ook bemoeilijkt door de heterogene expressie van tumormarkers in de tumor bulk en heterogeniteit in tumor vascularisatie en het lymfestelsel12,13. Bovendien, de tumor micro omgeving is samengesteld uit kanker-geassocieerde fibroblasten die tumorcellen ondersteunen, tumor immune cellen die anti-tumor immuunreacties onderdrukken, en de tumor endotheel die het transport van zuurstof en voedingsstoffen ondersteunt, alle van die interfereren met de penetratie, distributie en beschikbaarheid van op antilichamen gebaseerde therapieën of diagnostiek. Algemene, deze overwegingen kunnen beperken therapeutische of diagnostische werkzaamheid, vermindering van de behandeling reactie, en kan resulteren in tumor resistentie.

Daarom is het voor de ontwikkeling van efficiënte op antilichamen gebaseerde therapieën en diagnostiek cruciaal om de biodistributie en interactie van het op antilichamen gebaseerde geconjugeerde in de tumor micro omgeving te beoordelen. Momenteel, in preklinische studies, marker expressie in tumor Research modellen wordt geanalyseerd ex vivo door immunofluorescentie (indien) kleuring van tumor secties14. Standaard indien kleuring wordt uitgevoerd met primaire marker-specifieke antilichamen die vervolgens worden gemarkeerd door secundaire fluorescently gelabelde antilichamen op ex vivo tumorweefsel segmenten die zijn geïsoleerd van het dier. Deze techniek benadrukt de statische locatie van de marker op het moment van weefsel fixatie en geeft geen inzicht in hoe de op antilichamen gebaseerde therapieën of diagnostiek in fysiologische omstandigheden kunnen verspreiden of ermee omgaan. Moleculaire beeldvorming door Pet, SPECT, US en PA kan informatie verschaffen over de verdeling van antilichamen-geconjugeerde contrast agenten in levende preklinische modellen8,15. Aangezien deze beeldvormings modaliteiten niet-invasief zijn, kunnen longitudinale onderzoeken worden uitgevoerd en kunnen tijdgevoelige gegevens worden verzameld met een minimaal aantal dieren per groep. Deze niet-invasieve moleculaire beeldvormings benaderingen zijn echter niet gevoelig genoeg en hebben onvoldoende resolutie voor de lokalisatie van antilichaam distributie op cellulair niveau. Bovendien kunnen de fysische en biologische kenmerken van het primaire antilichaam drastisch worden gewijzigd door de conjugatie van een contrastmiddel16.

Om de in vivo fysiologische en pathologische omstandigheden rekening te houden met de interactie van op antilichamen gebaseerde therapieën en diagnostiek binnen de tumor omgeving en om cellulaire en zelfs sub-cellulaire distributie met een hoge resolutie te verkrijgen profielen van niet-geconjugeerde antilichamen, stellen wij een IF-benadering voor, die wordt geacht in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL), waarbij het antigeen-specifieke antilichaam in vivo intraveneus wordt geïnjecteerd. De op antilichamen gebaseerde therapeutische of diagnostische, optredend als primair antilichaam, circuleert in functionele bloedvaten en bindt zich aan zijn doel proteïne in de uiterst nauwkeurige, levende tumor omgeving. Na isolatie van in vivo-gelabelde tumoren met het primaire antilichaam, wordt een secundair antilichaam gebruikt om geaccumuleerde en bewaarde antilichaam conjugaten te lokaliseren. Deze benadering is vergelijkbaar met een eerder beschreven als histologie benadering die fluorescently gelabelde antilichamen17injecteert. Hoewel hier, het gebruik van niet-geconjugeerde antilichamen vermijdt een mogelijke verandering in bioverdelings kenmerken veroorzaakt door modificatie van antilichamen. Bovendien vermijdt ex vivo toepassing van fluorescerende secundair antilichaam een mogelijk verlies van fluorescentie signaal tijdens het verzamelen en verwerken van weefsels en biedt versterking van de intensiteit van het fluorescentie signaal. Onze etiketterings aanpak weerspiegelt in vivo biodistributie van op antilichamen gebaseerde geneesmiddelen en doelstoffen en kan belangrijke inzichten bieden voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische en therapeutische middelen.

Hier beschrijven we twee toepassingen van de IVIL-methode zoals toegepast in eerdere studies die de biodistributie onderzoeken en de toegankelijkheid van antilichamen-gebaseerde contrastmiddelen voor moleculaire beeldvormings benaderingen voor borstkanker detectie. Ten eerste is de biodistributie van een antilichaam-near infrarood kleur conjugaat (anti-B7-H3-antilichaam gebonden aan de Near Infrared fluorescentie Dye, indocyanine Green, B7-H3-ICG) en het Isotype-controlemiddel (ISO-ICG) voor fluorescentie en fotoakoestisch moleculair beeldvorming is verkend18. De methode van deze toepassing wordt beschreven in het protocol. Vervolgens wordt de bioverdelings resultaten van een conformatief gevoelig antilichaam tegen netrin-1, meestal niet detecteerbaar met traditionele als beeldvorming, gebruikt met echografie moleculaire beeldvorming, gekwantificeerd en gepresenteerd in de representatieve resultaten19. Aan het einde van dit protocol papier moeten lezers zich comfortabel voelen bij het aannemen van de IVIL-methode voor hun eigen op antilichamen gebaseerde onderzoekstoepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel administratief panel voor laboratorium Animal Care (APLAC) van Stanford University.

1. transgene muismodel van borstkanker ontwikkeling

  1. Observeer muizen van het gewenste kanker model voor de juiste tumorgroei via palpatie of remklauw-meting voordat u doorgaat.
    Opmerking: hier werd het transgene Murine model van borstkanker ontwikkeling (FVB/N-TG (MMTV-PyMT) 634Mul/J) (MMTV-PyMT) gebruikt. Deze dieren ontwikkelen spontaan invasieve borst carcinomen tussen 6 en 12 weken oud in elke borstklier20. Normale borstklieren werden gebruikt als controle van de transgene-negatieve, leeftijd overeenkomende littermates.

2. intraveneuze injectie van specifieke en niet-specifieke antilichaam middelen

  1. Purify Rabbit anti-Mouse B7-H3 en Rabbit IgG Isotype-antilichamen op een ontzuigerkolom (bijv. PD-10) om conserveringsmiddelen en opslag buffers te verwijderen volgens de instructies van de fabrikant.
    Opmerking: Sommige antilichamen hebben mogelijk verdere zuivering nodig met eiwit-A agarose kralen gebaseerd protocol21.
  2. Aliquot doseringen van 33 μg van elk antilichaam geconjugeerd in individuele microcentrifuge buizen.
    Opmerking: de dosering van de toegediende agent kan variëren afhankelijk van de toepassing en overeenkomt met de doseringen waarbij het antilichaam conjugaat routinematig wordt gebruikt. De concentratie van de antilichaam oplossingen is vereist als het volume meer dan 100 μL voor de veiligheid van dieren is.
  3. Op het gewenste tijdstip vóór de weefsel verzameling, hier 96 h, anesthetiseer de tumor lager dier met 2% Isofluraan stroomt in zuurstof op 2 L/min, en plaats op een 37 ° c verwarmd podium. Doe een teen knijpen om ervoor te zorgen dat het juiste niveau van anesthsia werd bereikt vóór de procedure.
  4. Ter voorbereiding op de staart ader inoculatie van de antilichaam oplossingen Desinfecteer de staart van het dier door drie keer te vegen met een alcoholdoekje. Laat de staart aders verwijden door te verwarmen met een warmte pad voor ongeveer 30 s. Vermijd het verwarmen van het hele dier. Veeg de staart opnieuw met een alcoholdoekje na het verwijderen van de Heat pad.
  5. Steek de vlindernaald in een van de twee laterale staart aders met behulp van een 27G staart ader katheter en bevestig de staart met de ingebracht naald op het podium met een stukje chirurgische tape.
    Opmerking: zichtbare bloed terugstroming in de katheter geeft de juiste plaats van de naald in de staart ader aan.
  6. Spoel de katheter met 25 μL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en Injecteer vervolgens de antilichaam vloeistof in de katheter met behulp van insuline spuiten. Spoel de katheter nogmaals met 25 μL steriele PBS.
  7. Verwijder de naald van de staart en druk op om eventuele bloedingen te stoppen.
  8. Schakel anesthesie uit en observeer het dier totdat het volledig wakker is voor tekenen van nood.

3. verzameling en bereiding van doel tumorweefsels

  1. Op het gewenste moment, humaan euthanaëren het dier volgens de aanvaardbare institutionele procedure, hier, door geleidelijke inademing van 100% CO2 uit een gecomprimeerde gastank met een kamer verplaatsing debiet van 10-30% volume/min.
    Opmerking: sommige toepassingen van de ivil-techniek vereisen euthanasie door cardiale perfusie met PBS om vrij Circulerend antilichaam te verwijderen19,22.
  2. Na bevestiging van humane euthanasie via stopzetting van de Ademhalings-en cardiale beweging, gebrek aan teen knijpen reactie, en vergrijzing van de slijmvliezen, accijnzen tumorweefsels met behulp van chirurgische schaar en Tang als volgt:
    1. Leg de muis in de liggende positie en grijp alleen de buitenste laag van de huid tussen de set van borstklieren die het dichtst bij de staart (5th) met een tang, maak een kleine incisie met een paar chirurgische schaar.
    2. Introduceer de gesloten schaar in de snede en open de punt langzaam om de huid van de onderliggende buikwand membraan zorgvuldig te scheiden en intact te houden.
    3. Maak een verticale incisie van de buik, blijven scheiden van de huid van het binnenste membraan. Tussen de 3RD en 4th borstklieren, maak een horizontale snede over de buik om terugtrekking van de huid en visualisatie van de borstklieren toe te staan.
      Opmerking: borsttumoren en klieren bevinden zich oppervlakkig onder de huid.
    4. Door elke tumor of normale klier met een tang te grijpen, de bijgevoegde huid zorgvuldig af te knippen met behulp van een chirurgische schaar.
  3. Plaats uitgesneden weefsels in weefsel wegwerp basis mallen, prelabeled en gevuld met optimale snijtemperatuur (OCT) insluitings medium en Vries de mallen snel door plaatsing op droogijs. Om af-doel levering te bestuderen, accijnzen andere weefsels of organen van belang(bijvoorbeeld delever of de longen).
    Opmerking: om het protocol op dit punt te onderbreken, bewaart u bevroren weefsel blokken bij-80 °C totdat u klaar bent om verder te gaan.
  4. Met behulp van een cryostat, sectie bevroren weefsel blokken op 10 μm dikte en plaats aangrenzende secties op prelabeled adhesieve glas dia's.
    Opmerking: om het protocol op dit punt te onderbreken, slaat u dia's op-80 °C totdat u klaar bent om verder te gaan.

4. ex vivo-kleurings Protocol

Opmerking: voor de kwantitatieve vergelijking tussen fluorescentiemicroscopie beelden worden alle dia's tegelijkertijd gekleurd met dezelfde bereide oplossingen.

  1. Spoel bevroren weefsel dia's met kamertemperatuur PBS gedurende 5 minuten om OCT te verwijderen.
  2. Afbakenen van weefsel secties met een hydrofobe barrière pen om het volume van de tijdens de kleuring benodigde oplossingen te verminderen.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de pen niet over de weefselmonsters loopt omdat deze het weefsel van de glijbaan kan verwijderen of de juiste kleuring op het aangetaste weefsel gedeelte voorkomt. Laat de weefsel secties op geen enkel moment dehydraat.
  3. Fixeer de weefsel secties met 4% Paraformaldehyde oplossing gedurende 5 min.
  4. Spoel de dia's in PBS gedurende 5 minuten.
  5. Permeabilize weefsel secties met 0,5% Triton-X 100 in PBS gedurende 15 min.
  6. Spoel de dia's in PBS gedurende 5 minuten.
  7. Blokkeer de weefsels met 3% w/v boviene serumalbumine (BSA) en 5% v/v geit serum, beide in PBS (blokkerende oplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    Opmerking: overeenkomen met de blokkerende oplossing serum aan de secundaire antilichaam host dier.
  8. Spoel de dia's in PBS gedurende 5 minuten.
  9. Inbroed secties met primaire antilichamen met record behoud zoals gewenst, mogelijk een gemeenschappelijk nucleair (bijv. DAPI), vasculaire (bijv. CD31) of cytoplasma marker (bijv. actin). Hier werd rat anti-muis CD31 (vasculaire marker) bij een verdunning 1:100 gebruikt volgens de instructies van de fabrikant in de blokkerende oplossing 's nachts bij 4 °C beschermd tegen uitdroging op een diapresentatie.
    Opmerking: Voeg geen aanvullend primair antilichaam of antilichaam conjugaat toe. Het geconjugeerde dat werd geïnjecteerd en toegestaan om zich te accumuleren in de weefsels in vivo fungeren als primair antilichaam.
  10. Spoel dia's in PBS gedurende 5 minuten driemaal, waarbij elke keer de PBS wordt gewijzigd.
  11. Incuberen dia's met secundaire antilichamen om primaire antilichamen te labelen. Visualiseer voor deze toepassing anti-B7-H3-antilichamen met AlexaFluor-546 geconjugeerd geit anti-konijnen antilichaam (1:200 verdunning, geoptimaliseerd volgens de instructies van de fabrikant) en CD31 met AlexaFluor-488 geitenanti-rat secundair antilichaam (1:200 verdunning, geoptimaliseerd volgens de instructies van de fabrikant) in blokkerende oplossing, beschermd tegen licht en uitdroging op een diaplade, voor 1 uur bij kamertemperatuur.
    Opmerking: secundaire antilichamen zijn afkomstig van hetzelfde gastheer dier, maar komen overeen met de affiniteit van de secundaire antilichamen tegen de hostsoorten van het respectieve primaire antilichaam. Dia's zijn vanaf dit punt beschermd tegen licht.
  12. Spoel dia's in PBS gedurende 5 minuten driemaal, waarbij elke keer de PBS wordt gewijzigd.
  13. Breng één druppel van het afdekmedium in het midden van het weefsel segment en plaats voorzichtig een dekslip om het inbouwen van luchtbellen te vermijden.
  14. Sluit de randen van de Afdeklijst af met blanke nagellak en laat drogen.
    Opmerking: om het protocol voor maximaal een week op dit punt te onderbreken, slaat u dia's op-20 °C op totdat u klaar bent om verder te gaan.

5. confocale microscopie beeldvorming en kwantitatieve beeldanalyse

Opmerking: de voorbereiding van de confocale Microscoop en de beeldvormings parameters is afhankelijk van het gebruikte confocale systeem. De hier gebruikte Microscoop werd commercieel aangekocht (bijv. Zeiss LSM 510 meta systeem) en de bijbehorende acquisitie software werd gebruikt (bijv. Zen 2009). Veel van deze stappen zijn echter van toepassing op elke confocale Microscoop en veronderstellen elementaire confocale microscopie kennis.

  1. Nadat het systeem is ingeschakeld en opgewarmd, selecteert u de gewenste doelstelling; Hier werd een 20x-doelstelling (numeriek diafragma = 0,8) gebruikt.
  2. Laad een positieve controle-Slide, dekslip naar beneden, om de optimalisatie voor het helderste signaal in te stellen. Imaging in het rode kanaal, focus het systeem op het voorbeeld in Live Imaging mode.
  3. Optimaliseer voor elk gebruikte laser kanaal de laserintensiteit, de Master Gain en de pinhole grootte als volgt:
    1. Overschakelen naar continue modus voor Imaging.
    2. Optimaliseer de laserintensiteit (die de laser stroom regelt) en Gain (Master) (die de spanning regelt voor fotomultiplicator-buis) schuifbalken terwijl het Lut-histogram (look up Table) wordt bewaakt. Pas deze twee instellingen aan totdat het dynamische bereik van het histogram is opgevuld zonder de pixels te verzaveren.
      Opmerking: als de laserintensiteit te hoog fotobleaching zal optreden. Als de versterking (Master) te hoog is, zal de afbeelding luidruchtig worden. Idealiter wordt de versterking (Master) in het midden van het bereik.
    3. Stel de pinhole in op 1 Airy Unit (AU), die de hoogste resolutie en de dunste z-slice geeft.
    4. Schuif de digitale offset balk om de ruisvloer op het Lut-histogram te minimaliseren voor een echte zwarte achtergrond.
      Opmerking: zodra de microscopie-instellingen zijn geoptimaliseerd voor elk Laser kanaal en elke doelstelling, houd ze constant gedurende de Imaging sessie en voorbeeld vorming van alle dia's, om de kwantitatieve vergelijking tussen dia's mogelijk te maken.
  4. Selecteer onder het tabblad acquisitie modus onder gemiddeldehet gewenste aantal en de bitdiepte. Klik op de knop optimaal om de optimale pixelgrootte in te stellen.
  5. Gebruik de knop aankoop magnetisch om een afbeelding van hoge kwaliteit te verzamelen. Hier, willekeurige velden van uitzicht werden geselecteerd uit binnen de tumor, maar andere gebieden van belang kunnen gelden voor verschillende toepassingen (vaten, tumor marges, penetratie diepte, enz.)
  6. Sla afbeeldingsbestanden op in het formaat dat wordt gebruikt door de confocale software (hier, ". lsm") voor offline verwerking en kwantificering.
    Opmerking: als niet alle dia's tijdens dezelfde sessie worden afgebeeld, slaat u de instellingen op en laadt u ze opnieuw op bij volgende bezoeken, hoewel reimaging van dezelfde dia niet wordt aanbevolen vanwege fotobleaching.
  7. De kwantitatieve metingen van de fluorescentie intensiteit uitvoeren. Open Fiji (Fiji is gewoon imagej-software)19,23 en laad een. lsm-afbeeldingsbestand door naar de statusbalk te slepen.
  8. Splits de gegevens van het kleurkanaal. Ga naar afbeelding ≫ stapels ≫ gesplitste kanalen.
  9. Voorverwerken van de fluorescentie beelden indien nodig, d.w.z. aftrekken van het achtergrond signaal (proces ≫ achtergrond aftrekken) of verminder het geluid via een filtermethode.
  10. Segmenteer het kleurkanaal dat overeenkomt met het referentie-eiwit (vasculaire, nucleaire, cellulaire vlek) door een drempelwaarde op de signaalintensiteit in te stellen (afbeelding > ≫ drempel aan te passen).
    Opmerking: handmatige drempelmethode introduceert subjectiviteit in de beeldanalyse, daarom, met behulp van een geautomatiseerde drempel-algoritme of verwijzen naar afbeelding histogrammen maakt beeldanalyse resultaten minder bevooroordeeld.
  11. Gebruik deze drempelwaarde voor het maken van een binair masker (proces ≫ binaire ≫ converteren naar masker).
  12. Meet en label ROIs binnen het masker (analyseer ≫ deeltjes analyseren ≫ Controleer toevoegen aan Manager > OK).
  13. Breng ROIs aan op het kleurkanaal dat overeenkomt met het antilichaam van belang (Klik op kanaalafbeelding, analyseer ≫ Tools > ROI Manager ≫ meting). Dit zal het masker ROIs toepassen op de antilichaam afbeelding en bieden beeld metingen voor label secties in de resultatenvenster. Venster resultaten opslaan (bestand ≫ opslaan).
  14. Bereken de gewenste rente statistiek, zoals de gemiddelde fluorescentie intensiteit zoals hier beschreven24.
  15. Alle verwerkingsstappen identiek uitvoeren aan elke afbeelding in een set dia's. Maak een macro om dit automatisch te doen voor grote afbeeldings batches23.
  16. Pas bij beeldweergave na kwantitatieve metingen kwalitatieve beeldaanpassingen toe om visualisatie van bioverdelings patronen te optimaliseren door de minimale, maximale, helderheid en het contrast aan te passen op dezelfde niveaus op alle dia's (afbeelding ≫ aanpassen > Helderheid/contrast).
  17. Converteer het afbeeldingstype (afbeelding ≫ type > RGB-kleur) en sla bestanden op in een verliesloos afbeeldingstype zoals. TIFF (bestand > opslaan als > TIFF...) voor gebruik in presentaties en publicaties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De IVIL-methode werd hier gebruikt om de in vivo biodistributie en weefsel interactie van B7-H3-ICG en ISO-ICG te onderzoeken, door de agentia, na intraveneuze injectie in een levend dier, toe te staan om met het doelweefsel te communiceren voor 96 h, en vervolgens zodra de weefsels als primaire antilichamen tijdens ex vivo-immunokleuring. De IVIL-methode werd ook vergeleken met de standaard ex vivo als kleuring van de weefsels voor de markering B7-H3. Normale muriene borstklieren niet ui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze methode heeft verschillende kritieke stappen en vereist mogelijke wijzigingen om te zorgen voor een geslaagde implementatie. Ten eerste moet de dosering en timing van de intraveneuze injectie van antilichaam/antilichaam conjugaat worden afgestemd op de specifieke toepassing. In het algemeen moeten doseringen worden gebruikt die consistent zijn met hoe het antilichaam conjugaat meestal zal worden gebruikt, d.w.z. overeenkomende doseringen van het therapeutische antilichaam of contrastmiddel op basis van antilichamen....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy service) voor discussies en het gebruik van apparatuur. We danken Dr. Juergen K. Willmann voor zijn mentorschap. Deze studie werd ondersteund door NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA118681 training Grant (KEW) en NIH K99EB023279 (KEW). De Stanford Neuroscience microscopie service werd ondersteund door NIH NS069375.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Diermodel
FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/JThe Jackson Laboratory002374Vrouwtjes, 4-6 weken oud
Dierverzorgingsartikelen
27G KatheterVisualSonicsBel om te bestellenVevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit
AlcoholdoekjesFisher Scientific22-246073
Gaasjes (4" x 4" 16 Vouw)Cardinal Health2913
WarmtelampMorganville Scientific HL0100
IsofluraanHenry Schein Animal Health29404
OogzalfFisher ScientificNC0490117
Chirurgisch plakband3M1530-1
Weefselcollectie
Wegneembare basisvormenFisher Scientific22-363-556
Optimal Cutting Temperature (OCT) MediumFisher Scientific23-730-571
Chirurgische Londense pincettenFine Science Tools11080-02
Chirurgische schaarFine Science Tools14084-08
Antilichamen
AlexaFluor-488 geit anti-rat IgGLife TechnologiesA-11006
AlexaFluor-546 geit anti-konijn IgGLife TechnologiesA-11010
AlexaFluor-594 geit anti-menselijke IgGLife TechnologiesA11014
Menselijke IgG Isotype ControleNovus BiologicalsNBP1-97043
Gehumaniseerd anti-netrin-1 antilichaam Netris Pharmacontact@netrispharma.com
Konijn anti-Muis CD276 (B7-H3)Abcamab134161EPNCIR122 Clone
Ratten anti-Muis CD31BD Biosciences550274MEC 13.3 Clone
Reagentia
Rund Serum Albumine (BSA)Sigma-AldrichA2153-50G
Klare nagellakElke lokale drogisterij
Indocyanine Green - NHSIntrace MedicalICG-NHS ester
Mounting MediumThermoFisher ScientificTA-006-FM
Normaal Geit SerumFisher ScientificICN19135680
Paraformaldehyde (PFA)Fisher ScientificAAJ19943K2
Steriele Fosfaat Buffered Saline (PBS)ThermoFisher Scientific14190250
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787
Benodigdheden
Adhesie GlasplatenVWR48311-703
Desalting KolommenFisher Scientific45-000-148
Glazen DekglasjesFisher Scientific12-544G
Hydrofobe BarrièrepenTed Pella22311
MicrocentrifugebuizenFisher Scientific05-402-25
Schijf Kleur TrayVWR87000-136
Software
FIJILOCI, UW-Madison.Versie 4.0https://fiji.sc/

Referenties

  1. Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
  2. Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
  3. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
  5. McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
  6. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
  7. Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
  8. Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
  9. Fleuren, E. D. G., et al. Theranostic applications of antibodies in oncology. Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).
  10. Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  11. Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
  12. Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
  13. Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
  14. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  15. Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
  16. Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
  17. Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
  18. Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
  19. Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
  20. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  21. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
  25. Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
  26. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  27. Ryman, J. T., Meibohm, B. Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).
  28. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
  29. Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
  30. Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
  31. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  32. de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
  33. Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
  34. Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Therapeutische antilichamendiagnostische antilichamenconfocale microscopieweefselcoupeskleuring met secundaire antilichamentumorvascularisatieoff-target levering
In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.