Eiwit-eiwit-interacties (PPI's) zijn fundamenteel voor het genereren van biologische effecten. Vele zijn nauw verbonden met ziekten, en ze worden steeds meer erkend als belangrijke doelwitten voor geneesmiddelwerking1. Er zijn tal van technieken beschikbaar om deze eiwitinteracties te bestuderen, waarvan sommige in deze verzameling of in andere JoVE-artikelen worden besproken. Elke techniek heeft zijn eigen voordelen en beperkingen2; er is echter geen perfecte techniek voor alle PPI's vanwege de enorme diversiteit van deze interacties die plaatsvinden in verschillende subcellulaire compartimenten, met een breed scala aan affiniteiten (picomolair tot millimolair), en die van tijdelijke aard kunnen zijn.
In vitro kinase assays zijn een indirecte benadering voor het bestuderen van PPI's die kunnen worden gebruikt om te analyseren hoe kinasen hun functionele rol vervullen door een fosfaatgroep van ATP over te brengen naar een substraat. Cui et al.3 gebruiken deze techniek, gekoppeld aan tryptische spijsvertering en massaspectrometrie, om de cycline-afhankelijke kinase-1-specifieke fosforyleringsplaatsen op een fragment van het menselijke centromeereiwit F (CENP-F) te identificeren. Voor functionele verificatie van nieuwe fosforyleringsplaatsen gebruiken de auteurs een bindingsassay, die CENP-F met een fosfomimetische mutatie en karyoferine α, een nucleair transportreceptor, combineert, waardoor kruisvalidatie wordt geboden.
Co-immunoprecipitatie is een veel gebruikte methode voor het bestuderen van PPI's waarbij een antilichaam wordt gebruikt om een specifiek doelwit samen met alle andere eiwitmoleculen die eraan zijn geassocieerd te vangen. Zheng en collega's4 passen deze techniek toe om hypoxie-inducibele factoren (HIF's) te bestuderen die functioneren als heterodimeren bestaande uit een zuurstofgereguleerde α subeenheid en een constitutief tot expressie gebrachte β subeenheid, ook bekend als ARNT3. Een interessante opmerking over hun protocol is dat de cellen worden geïnduceerd en geoogst onder hypoxische omstandigheden, en endogene eiwitten uit nucleaire fracties worden vervolgens geco-immunoprecipiteerd. Zoals de auteurs opmerken, is een beperking van de methode dat het niet kan bepalen of PPI's direct of indirect zijn.
Nolan et al.5 presenteren een protocol voor de meting van het aantal moleculen en hun helderheid in beeldvorming met fluorescentiemicroscopie ‘Aantal en Helderheid’ (N&B), dat kan worden toegepast op het detecteren van eiwithomo-oligomerisatie. De techniek kan zowel in vitro als in vivo worden toegepast en is toegepast om de oligomere toestand van mVenus-gelabeld FKBP12F36V vóór en na de toevoeging van een dimeriseermiddel nauwkeurig te kwantificeren. De auteurs bespreken de voordelen van de techniek ten opzichte van gerelateerde technologieën en benadrukken het belang van correctie voor verbleking en intensiteitsfluctuaties op lange termijn. Confocale microscopen uitgerust met digitale detectoren vergemakkelijken de kwantificering, maar N&B is ook mogelijk met analoge detectoren.
Affiniteitszuivering van multi-eiwitcomplexen, samen met de identificatie van hun componenten, is een veel gebruikte techniek voor het begrijpen van de functies van dergelijke complexe eiwitten. In het protocol van Luzarowski et al.6 wordt deze techniek een stap verder genomen door tegelijkertijd zowel PPI's als eiwit-metabolieteninteracties (PMI's) in transgene Arabidopsis plantencellen te karakteriseren. Getagde nucleosiddifosfaatkinases worden gezuiverd door de tandem-affiniteitszuivering (TAP) tag-procedure met gevangen eiwitten en kleine moleculen die vervolgens worden geïdentificeerd door massaspectrometrie. De uniciteit van dit protocol is de mogelijkheid om zowel hydrofobe als hydrofiele liganden te identificeren; het is een drie-in-een extractieprotocol dat zowel PPI's als PMI's mogelijk maakt en toepassing van affiniteitszuivering tot het planten van cellen.
De nabijheidsligatie assay heeft het voordeel dat het kan worden gebruikt om interacties tussen endogene eiwitten in cellen en weefsels te detecteren. Karchugina en Chernoff7 gebruiken de techniek om de aanwezigheid van heterodimeren van de kinasen MST1 en MST2 in humane Schwann-cellen (HSC's) en humane embryonale niercellen (HEK-293) aan te tonen. Hun artikel bevat verschillende waardevolle aanwijzingen voor het succesvol uitvoeren van de techniek. Geschikte primaire antilichamen, opgewekt in verschillende soorten tegen elk interacterend eiwit, zijn vereist, en aangezien de specificiteit en gevoeligheid van de antilichamen cruciaal zijn, moeten de antilichaamconcentraties fijn worden afgesteld. De auteurs vonden glazen kamerslides handig voor het analyseren van meerdere cellijnen en antilichaamcombinaties, maar merkten op dat het essentieel is om alle siliconeninzet tussen de putjes te verwijderen om verschillen in de confocale afstand tijdens microscopie te voorkomen. Bovendien worden verschillende positieve en negatieve controles gebruikt om de resultaten te valideren.
Kernspinresonantie (NMR) spectroscopie is een gevoelige assay die kan worden gebruikt om atoomniveauresolutie en kwantitatieve informatie te verschaffen over eiwitinteracties en eiwit-ligandinteracties. Winkelaar en collega's8 gebruiken de techniek om de interactie van twee eiwitten (vimentine en envoplakin) te bestuderen die in desmosomen worden gevonden, celadhesiestructuren die typisch worden aangetroffen in weefsels die intense mechanische stress ervaren. De auteurs gebruiken een 15N-gelabelde vimentine domein en verwerven een 2D-spectrum met behulp van heteronucleaire enkele kwantumcorrelatie (HSQC). In aanwezigheid van een domein van envoplakin worden uitgebreide lijnverbreding en piekverdwijning waargenomen, consistent met eiwitinteractie. De auteurs onderzoeken verder de basis van de interactie met behulp van mutagenese en microschaalthermoforesis (MST) om kwantitatieve informatie te verschaffen.
Kleinhoekige röntgenstralingsscattering (SAXS) is een techniek die kan worden gebruikt