Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Summary

We kenmerkten een nieuwe kinase eiwit met behulp van robuuste biochemische benaderingen: Western Blot analyse met een dedicated specifieke antilichaam op verschillende cel lijnen en weefsels, interacties door coimmunoprecipitation experimenten, kinase activiteit gedetecteerd door westerse Vlek gebruikend een phospho-specifiek antilichaam en door γ [³²P] ATP etikettering.

Abstract

Het uitgebreide gehele genoom rangschikken heeft vele open lezings kaders (ORFs) geïdentificeerd die vele potentiële proteïnen verstrekken. Deze eiwitten kunnen belangrijke rollen voor de cel en kunnen ontrafelen nieuwe cellulaire processen. Onder eiwitten, kinases zijn belangrijke acteurs als ze behoren tot cel signalering paden en hebben de mogelijkheid om in-of uitschakelen vele processen van cruciaal belang voor het lot van de cel, zoals celgroei, divisie, differentiatie, beweeglijkheid, en de dood.

In deze studie, concentreerden wij ons op een nieuwe potentiële kinase proteïne, LIMK2-1. Wij toonden zijn bestaan door westelijke vlek gebruikend een specifiek antilichaam aan. We evalueerden de interactie met een upstream regulerend eiwit met behulp van coimmunoprecipitation experimenten. Coimmunoprecipitation is een zeer krachtige techniek in staat om de interactie tussen twee doel eiwitten te detecteren. Het kan ook worden gebruikt om nieuwe partners van een aas proteïne te ontdekken. Het aas proteïne kan of via een markering worden gezuiverd die aan zijn opeenvolging of via een antilichaam wordt ontworpen dat specifiek het richt. Deze eiwitcomplexen kunnen vervolgens worden gescheiden door SDS-pagina (natrium dodecyl sulfaat Polyacrylamide gel) en geïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie. Immunoprecipitated LIMK2-1 werd ook gebruikt om zijn kinase activiteit in vitro te testen door γ [³²P] ATP etikettering. Deze gerenommeerde assay kan gebruik maken van veel verschillende substraten, en gemuteerde versies van het aas kan worden gebruikt om de rol van specifieke residuen te beoordelen. De effecten van farmacologische agentia kunnen ook worden geëvalueerd, aangezien deze techniek zowel zeer gevoelig als kwantitatief is. Toch vereist de behandeling van radioactiviteit bijzondere voorzichtigheid. Kinase activiteit kan ook worden beoordeeld met specifieke antilichamen gericht op de phospho groep van het gemodificeerde aminozuur. Dit soort antilichamen zijn niet commercieel beschikbaar voor alle phospho gemodificeerde residuen.

Introduction

Voor vele decennia, zijn talrijke signalering trajecten opgehelderd en hun betrokkenheid bij cruciale cellulaire processen zoals celdeling, differentiatie, beweeglijkheid, geprogrammeerde celdood, immuniteit en Neurobiology, is aangetoond. Kinases spelen een belangrijke rol in deze signalering trajecten als ze vaak fijn reguleren hun activering of inactivatie en zijn onderdeel van voorbijgaande veelzijdige complexen die reageren op externe stimuli^1,2,3. Mutatie en ontregeling van kinases vaak leiden tot ziekten bij de mens, en ze hebben daarom uitgegroeid tot een van de belangrijkste drug targets in de afgelopen 40 jaar⁴.

In deze context is het belangrijk om de kinase interactie met hun stroomopwaartse regulatoren of stroomafwaartse substraten te kunnen detecteren en nieuwe partners te identificeren. De reiniging van de affiniteit en Immunoprecipitation zijn zeer krachtige technieken voor de isolatie van eiwitcomplexen⁵. Het aas proteïne of kinase kan met een specifieke peptide opeenvolging worden geëtiketteerdd toestaand het gebruik van commerciële parels in combinatie met antilichamen die het peptide richten. Dit materiaal laat een hoge reproduceerbaarheid toe in experimenten^6,7,8. Endogene proteïnen kunnen ook worden immunoprecipitated gebruikend antilichamen die direct het aas proteïne richten. De antilichamen kunnen cross-linked aan proteïne A of proteïne G agarose parels of eenvoudig met deze parels voorafgaand aan het toevoegen van lysate worden uitgebroed. Lysis buffers moeten worden geoptimaliseerd om proteïne oplosbaar maken te laten zonder interactie te verliezen en eiwit degradatie te vermijden. Een belangrijk nadeel van deze aanpak is dat de interactie wordt gedetecteerd op Cell Lysis; Daarom kunnen voorbijgaande of zwakke interacties, samen met die die subcellulaire context vereisen worden gemist. Andere technieken kunnen worden gebruikt om direct te werken in de cel, zoals proximity afbinding assay (PLA)⁹, in vivo cross-linking-Assisted affiniteit zuivering (XAP)¹⁰, bioluminescentie resonantie energieoverdracht (BRET) of Förster resonantie energie Overdracht (fret)^11,12. Bovendien is Immunoprecipitation niet geschikt om de thermodynamische constanten van de binding te bepalen, waarvoor fysische technieken zoals oppervlakte Plasmon resonantie, isotherme titratie calorimetrie of Microscale Thermophoresis zijn vereist ^13,14.

Kinase activiteit kan worden beoordeeld met behulp van meerdere technieken. Hierin hebben we ons geconcentreerd op phospho antilichamen en in vitro γ [³²P] ATP (adenosine trifosfaat) etikettering. Phospho-specifieke antilichamen richten de fosfaat wijziging van een bepaald residu binnen een proteïne. Zij kunnen in westelijke vlek of ELISA (enzym-verbonden ImmunoSorbent assay) na cel lysis, voor Immunohistochemistry, en ook op intacte cellen worden gebruikt gebruikend Stroom Cytometry of immunofluorescentie. Hun nadelen kunnen hun gebrek aan specificiteit omvatten, die kan worden geëvalueerd gebruikend een gemuteerde versie van de doel proteïne, en hun die niet commercieel beschikbaar voor alle proteïnen zijn. In vitro γ [³²P] ATP labeling is een zeer robuuste, goed gevestigde en zeer gevoelige methode¹⁵. Immunoprecipitated of recombinante eiwitten kunnen worden gebruikt, en verschillende substraten kunnen worden getest. De effecten van drugs kunnen ook worden beoordeeld als deze methode is kwantitatief. Het belangrijkste nadeel is dat de radioactiviteit in verband met de aanpak vereist behandeling met voorzichtigheid. Alternatieve methoden zijn ook mogelijk op basis van de meting van fluorescerende of lichtgevende peptide substraten en gebruik te maken van gewijzigde TL/lichtgevende eigenschappen op phosphorylation. Dergelijke methoden kunnen ook een hoge doorvoersnelheid, die nodig is, bijvoorbeeld in de screening van moleculen die kunnen worden potentiële remmers van de doelgroep kinase. Inderdaad, kinases vertegenwoordigen een van de grootste klassen van drugs doelstellingen nagestreefd door farmaceutische bedrijven¹⁶.

In deze studie concentreerden we ons op de LIMK2-1 proteïne (LIMK2-1 staat voor Lin11, Isle1, Mec3 kinase isovorm 2-1). De LIMK2 kinase proteïne werd voor het eerst beschreven in 1995¹⁷. Drie isovormen van LIMK2 worden geproduceerd door alternatieve splicing: LIMK2a, LIMK2b en LIMK2-1. Momenteel, is LIMK2-1 slechts beschreven op het niveau mRNA in één enkele studie¹⁸. Hierin karakteriseren we deze potentiële nieuwe kinase proteïne op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen. Ten eerste tonen we aan dat LIMK2-1 inderdaad gesynthetiseerd is. Gelijkaardig aan zijn twee tegenhangers, LIMK2a en LIMK2b, communiceert het met de stroomopwaarts kinase rots (Rho-bijbehorend proteïne kinase). We tonen LIMK2-1 heeft een kinase activiteit op myeline Basic protein (MBP), maar niet op cofilin, de canonieke substraat van LIM kinases.

Protocol

1. Cell voorbereiding voor Transfectie

Let op: alle stappen van de cel cultuur moet worden uitgevoerd in een dedicated laboratorium, en cellen worden gemanipuleerd binnen een klasse 2 microbiologische kabinet.

1. Zaad HEK-293 (menselijke embryonale nier) cellen in Ø 10 cm platen in 10 mL DMEM (Dulbecco modified Eagles medium) aangevuld met 10% foetale kalf serum. Cultuur voor 3 tot 5 dagen onder 5% CO₂, bij 37 °c, tot de cellen bereiken ~ 90% samenloop.
2. Behandel Ø 10 cm platen met collageen R om de hechting van de cellen aan de plastic platen te verhogen.
   1. Voeg 5 mL van een oplossing van collageen R toe, 200-voudig verdund in fosfaat zout buffer (PBS) in een plaat van Ø 10 cm. Bedek de vloeistof over het hele oppervlak van de plaat.
   2. Incubeer bij kamertemperatuur voor ten minste 1 uur in het bioveiligheid kabinet.
   3. Verwijder collageen oplossing, en gooi het. Voeg 5 mL PBS, verspreid het over het oppervlak van de plaat, verwijder het en gooi het. Herhaal deze wasbeurt een keer.
   4. Voeg 8 mL DMEM aangevuld met 10% foetale kalf serum. Bewaar de voor bereide platen in het bioveiligheid kabinet.
3. Neem HEK-293 platen van stap 1,1 binnen het bioveiligheid kabinet. Verwijder het medium van de platen en gooi het in een speciale Bleach prullenbak. Voeg 2 mL van de aangevulde DMEM toe en spoel de cellen om ze los te maken met de stroom van een 1 mL micropipet en zorg ervoor dat er geen schuim ontstaat.
4. Verzamel de cellen in een 15 mL buis en voeg 4 mL van de aangevulde DMEM. Meng met een pipet van 10 mL, door 3 maal omhoog en omlaag te pipetteren.
5. Neem 2 mL van deze cel oplossing en voeg ze toe aan collageen-behandelde platen met aangevuld DMEM van stap 1.2.4.
6. Groeien voor 24 uur in de incubator op 5% CO₂ en 37 ° c. Cellen moeten worden 50-80% Confluent op het moment van transfectie.

2. voorbijgaande transfections

1. Verwijder het medium uit de platen, gooi het in een speciale Bleach prullenbak, en voeg 10 mL verse aangevuld DMEM. Zet de platen terug in de incubator op 37 °C tijdens de voorbereiding van de transfectie mengsel.
2. Voeg in een buis van 15 mL 450 l van een 10 mM tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA toe (tris staat voor tris (hydroxymethyl) aminomethane, en EDTA voor ethylenedinitrilotetraacetic acid) oplossing en 50 l van een 2,5 M CaCl₂ oplossing. Mix door inversie.
3. Voeg 10 μg van plasmide DNA (desoxyribonucleïnezuur zuur) toe die van een voorbereiding van Midi op een vloeibare cultuur van bacteriën wordt voorbereid die met de specifieke plasmide worden omgezet. Mix door inversie.
4. Onder gladde agitatie op een Vortex, voeg 500 l van BES gebufferde zoutoplossing 2x concentraat (samenstelling: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, na₂HPO₄, 0,27 g/l; BES tribunes voor N, N-BIB (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic zuur, N, N-bis (2-hydroxyethyl) taurine) langzaam daling door daling.
5. Incubeer gedurende ten minste 15 min (tot 45 min) bij kamertemperatuur binnen het bioveiligheid kabinet. Niet vortexen, niet mengen! Verplaats de buizen zeer zorgvuldig om de complexe vorming tussen DNA en calciumfosfaat niet te verstoren.
6. Neem de platen van stap 2,1 naar de veiligheidskast. Voeg de complexen van DNA toe zeer zorgvuldig, daling door daling, op de cellen helemaal over de oppervlakte van de plaat.
7. Incubeer gedurende 24 tot 72 uur in de incubator bij 37 °C. Gewoonlijk wordt de maximum eiwituitdrukking bereikt binnen 48 uren.

3. lysis

Nota: het werk aangaande ijs, en met koude buffers om eiwit degradatie te verhinderen.

1. Bereid lysis buffer: 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM Natriumpyrofosfaat, 1 mM na₃vo₄, 20 mm p-Nitrophenyl fosfaat, 20 mm β-glycerophosphate, 10 μg/ml aprotinin, 0,05 μg/ml okaidic zuur , 1 μg/mL leupeptin, en 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride). Voor elke transfected plaat is ongeveer 4 mL lysis buffer vereist.
2. Verwijder platen met transfected cellen uit de incubator. Leg ze op ijs.
   Nota: van deze stap, is het mogelijk om aan een "normale" Bank te werken.
3. Verwijder de media, en gooi het in een speciale Bleach prullenbak.
4. Was tweemaal met 3 mL koude PBS: Voeg 3 mL PBS aan de kant van de plaat daling door daling toe om het losmaken van transfected cellen te vermijden, die helemaal over de oppervlakte van de plaat worden uitgespreid, PBS verwijderen en het verwerpen; Herhaal deze stap nogmaals. Aan het eind, verwijder zorgvuldig de rest van PBS door de plaat te overhellen om lysis buffer verdunning voor volgende stap te verhinderen.
5. Voeg 500 l van koude lysis buffer op de transfected gewassen cellen. Verspreid het allemaal over het oppervlak van de plaat.
6. Incubeer gedurende 10 minuten op het ijs. Van tijd tot tijd (ten minste tweemaal), verspreid opnieuw de buffer over het oppervlak van de plaat.
7. Schraap de cellen en Verzamel ze in een micro centrifugebuis.
8. Centrifugeer gedurende 10 min bij 10.000 x g bij 4 °c.
9. Verzamel bovendrijvende in een nieuwe micro centrifugebuis. Deze fractie komt overeen met de lysate (whole Cell extract). Gooi de pellet die overeenkomt met celmembraan puin.
10. Verzamel een hoeveelheid van deze fractie naar een nieuwe micro centrifugebuis (rond 50 l). Deze fractie komt overeen met de "totale breuk" of "cel lysate" of "hele cel-extract" waardoor de analyse van de vraag of transfected eiwitten worden uitgedrukt door Western Blot.
    Nota: op dit punt, kunnen de steekproeven direct voor westelijke vlek analyses worden gebruikt. Laemmli buffer moet worden toegevoegd aan de steekproef, die vervolgens wordt verwarmd op 95 °C voor 5 min, centrifugeren bij 10.000 x g voor 5 min, en geladen op passende sds-pagina. Monsters kunnen ook worden opgeslagen bij-80 ° c.

4. Immunoprecipitation

1. Voorzichtig hersuspenderen agarose kralen in combinatie met de juiste antilichaam: HA (humaan influenza hemagglutinin), vlag, of GFP (groene fluorescerende eiwit) door gladde inversie.
2. Snijd het uiteinde van een 200 l-Tip van een micropipet zodat de kralen de tip kunnen binnengaan. Pipetteer de kralen meerdere malen op en neer om de tip te verzadigen om ervoor te zorgen dat de juiste hoeveelheid kralen te nemen.
3. Neem 40 l van de kralen in een micro centrifugebuis.
4. Voeg 500 l van principe (30 mM tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) buffer toe. Mix door inversie. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g bij 4 °c. Verwijder zorgvuldig bovendrijvende en gooi het. Voeg 500 l van principe toe. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 4 °C op een roterend wiel.
   Nota: deze pre-incubatie stap in principe staat toe om niet-specifieke interactie te verminderen en zo achtergrond signaal te verminderen.
5. Was de kralen tweemaal met 500 l van lysis buffer.
   1. Centrifugeer 2 min bij 1.000 x g bij 4 °c.
   2. Verwijder zorgvuldig bovendrijvende buffer, en gooi het.
      Opmerking: Zorg ervoor dat u niet aspireren kralen tijdens deze wassen stappen.
   3. Voeg 500 l van lysis buffer toe. Meng door de buis te omkeren.
   4. Herhaal stappen 4.5.1-4.5.3.
6. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g bij 4 °c. Verwijder voorzichtig bovendrijvende buffer, en gooi het.
7. Incubeer kralen met de lysate van stap 3,9 voor 2 tot 4 uur bij 4 °C op een roterend wiel.
8. Was immunoprecipitated kralen.
   Nota: op dit punt, kunnen de immunoprecipitated parels vijf keer met de lysis buffer worden gewassen, en dan geëlueerd met Laemmli buffer. Eluaat kan voor westelijke vlek analyses worden gebruikt of worden opgeslagen bij-80 °C. Alternatief, kunnen de parels tweemaal met de lysis buffer en dan drie keer met de kinase buffer worden gewassen om γ [³²P] ATP etikettering uit te voeren.

5. Coimmunoprecipitation analyses

1. Was immunoprecipitated kralen van stap 4,7 met de lysis buffer.
   1. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 °c.
   2. Verwijder zorgvuldig de bovendrijvende, en gooi het.
   3. Voeg 500 l van lysis buffer toe. Meng door de buis te omkeren.
   4. Herhaal de stappen 5.1.1-5.1.3 vier keer.
2. Elutie
   1. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 °c.
   2. Verwijder zorgvuldig de bovendrijvende, en gooi het. Verwijder de laatste druppels bovendrijvende met een Hamilton spuit om aspiratie van de kralen te vermijden, en gooi de bovendrijvende.
   3. Voeg 40 l van 4x Laemmli buffer (200 mM tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% glycerol, 0,5 M β-mercaptoethanol, 0,02% bromophenol blauw) toe. Meng door voorzichtig te tikken op de buis.
   4. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Centrifugeer gedurende 5 min bij 10.000 x g bij kamertemperatuur.
   6. Met een Hamilton spuit, verwijder de bovendrijvende en verzamel het in een nieuwe micro centrifugebuis. Deze fractie komt overeen met de "eluaat", die kan worden opgeslagen bij-80 ° c, of direct geanalyseerd door Western Blot.

6. kinase assay

1. Bereid de kinase buffer voor: 50 mM HEPES-NaOH pH 7,5 (HEPES staat voor 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic zuur), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl_2,5mm MnCl₂, 50 mM NAF, 1 mm na₃vo₄, 20 mm β-glycerophosphate, 1 μg/ml leupeptin, en 1 mM PMSF. Voor elke Immunoprecipitation conditie is ongeveer 2 mL van de kinase buffer vereist.
2. Was immunoprecipitated kralen van stap 4,7 tweemaal met 500 l van lysis buffer.
   1. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 °c.
   2. Verwijder voorzichtig bovendrijvende, en gooi het. Voeg 500 l van lysis buffer toe. Meng door inversie.
   3. Herhaal stap 6.2.1 en 6.2.2.
3. Was immunoprecipitated kralen drie keer met 500 l van kinase buffer.
   1. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 °c.
   2. Verwijder voorzichtig bovendrijvende, en gooi het. Voeg 500 l van kinase buffer toe. Meng door inversie.
   3. Herhaal de stappen 6.3.1 en 6.3.2 tweemaal.
4. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 °c.
5. Verwijder voorzichtig bovendrijvende, en gooi het. Verwijder de laatste druppels bovendrijvende met een Hamilton spuit om aspiratie van de kralen te vermijden, en gooi de bovendrijvende.
6. Voeg 40 l van de kinase buffer toe aan de immunoprecipitated kralen. Hersuspendeer de kralen door voorzichtig te tikken op de buis.
7. Bereid de mix voor de γ [³²P] ATP labeling (eindvolume is 22,5 l, compleet met kinase buffer) in een veilige Lock-Tube.
   1. Voeg het vereiste volume van de kinase buffer toe om een eindvolume van 22,5 l te bereiken.
   2. Snijd het uiteinde van een 20 l punt van een micropipet. Hersuspendeer de immunoprecipitated kralen van stap 6,6 door meerdere malen op en neer te pipetteren. Verzamel 10 l van deze kralen in de Safe-lock Tube.
   3. Voeg ATP van een 10 μM voorraad oplossing te bereiken 50 mM van de finale concentratie. Volgens het aantal behandelde monsters wordt een verdunning van de voorraadoplossing van ATP in de kinase buffer voorgesteld om pipet 1 tot 2 l toe te staan, om er zeker van te zijn dat het volume correct is.
   4. Voeg 2,5 μg van substraat (cofilin of myeline Basisproteïne, MBP in het huidige studie geval) toe.
8. Voeg 5 μCi van γ [³²P] ATP (3.000 CI/mmol) toe om de reactie te initiëren. Meng door op en neer te pipetteren langzaam.
   Let op: vanaf dit punt, moet het werk worden gedaan op een veilige plaats gewijd voor radioactiviteit manipulaties met voorzichtige voorzorgsmaatregelen, speciale bescherming en passende controles (radioactieve schilden, Geiger teller, specifieke afval verzamelen, persoonlijke borst-en vinger badges op te sporen radioactieve blootstelling, filter tips).
9. Incubeer gedurende 20 min bij 30 °C.
10. Stop de reactie met 6 l van 5x Laemmli buffer.
11. Warmte bij 95 ° C voor 5 min.
12. Centrifugeer bij 10.000 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.
13. Belasting op een SDS-pagina. Ga verder met migratie.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de voorste lijn van de vrije γ [³²P] ATP niet de gel te verlaten om verontreiniging van de migratie tank te voorkomen.
14. Vlek de gel bij kamertemperatuur.
    1. Verwijder de gel uit de glazen platen.
    2. Ga verder met drie baden in het water bij kamertemperatuur.
    3. Vlek de gel 's nachts met Coomassie blauw bij kamertemperatuur.
    4. Devlek de gel met verschillende wassen baden met water bij kamertemperatuur.
15. Wikkel de gel met plastic wrap.
16. Expose voor een nacht of meer op een phosphorimager scherm.
17. Lees het scherm op een phosphorimager om gelabelde bands te detecteren.

Results

LIMK2-1 proteïne wordt samengesteld
LIMK2-1 wordt vermeld in databanken, maar tot dusver heeft slechts één document het bestaan van zijn mRNA¹⁸getoond. Vergeleken met de twee homologs, LIMK2a en LIMK2b, LIMK2-1 heeft een extra C-Terminal domein geïdentificeerd als een eiwit fosfatase 1 remmende domein (PP1i). We hebben een antilichaam ontworpen dat een peptide van dit domein target, aminozuren 671-684 (Figuur 1a).

Discussion

Hierin hebben we gebruik gemaakt van krachtige biochemische instrumenten te karakteriseren op moleculair niveau een nieuw eiwit, LIMK2-1, vermoedelijk een kinase gebaseerd op de volgorde en op de homologsen, LIMK2a en LIMK2b²⁰.

Ten eerste, toonden wij het bestaan van LIMK2-1 op het eiwit niveau gebruikend westelijke vlek analyse met een specifiek antilichaam. Na dit, evalueerden wij zijn interactie met het stroomopwaarts kinase ROCK1, dat gekend is om LIMK2a en LIMK2b, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody anti-actin	Sigma-Aldrich	A1978	voor Western Blot
Antibody anti-c-Myc	Invitrogen	MA1-21316	voor Western Blot
Antibody anti-cofilin	Cell signaling Technology	3312/5175	voor Western Blot
Antibody anti-GFP	Santa Cruz	sc-9996	voor Western Blot
Antibody anti-HA	Roche Applied Science	11687423001	voor Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin	Cell signaling Technology	3313	voor Western Blot
Antibody Anti-PP1i	Eurogentec	ontworpen voor dit onderzoek	voor Western Blot
Aprotinin	Euromedex	A-162B	voor lysis buffer
ATP	Invitrogen	PV3227	voor α[32P] labeling
α[32P] ATP	Perkin Elmer	NEG502A	voor α[32P] labeling
BES buffered saline	Sigma-Aldrich	14280	voor transfectie
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422	voor lysis en kinase buffer
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	voor Laemmli
BSA	Sigma-Aldrich	A3059	voor blocking buffer
Bromofenol Blauw	Sigma-Aldrich	B0126	voor Laemmli
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	voor transfectie
Centrifuge	Sigma	111-541
Collagen R	Pan Biotech	P06-20166	voor transfectie
Control siRNA	Ambion	AM4611	voor PP1i antilichaam specificiteit
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution	Thermo-Fisher	24620	voor gel kleuring
EDTA	Sigma-Aldrich	3690	voor lysis buffer
Electrophoresis Unit	Biorad	Mini-Protean	voor Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel	Sigma-Aldrich	E6779	voor immunoprecipitatie
GeneSys software	Ozyme		voor Western Blot acquisitie
GeneTolls software	Ozyme		voor Western Blot kwantificatie
GFP-trap beads	Chromtek		voor immunoprecipitatie
Glycine	Euromedex	26-128-6405	voor transfer buffer
GST-cofilin	Upstate Cell signaling	12-556	voor α[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL	Hamilton	710	om zorgvuldig supernatant van de kralen te verwijderen zonder ze te aspireren
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	voor kinase buffer
ImageQuant TL software	GE Healthcare		voor radioactiviteit acquisitie en kwantificatie
LIMK2 siRNA	Ambion	s8191	voor PP1i antilichaam specificiteit
Leupeptin	Sigma-Aldrich	SP-04-2217	voor lysis en kinase buffer
MBP	Upstate Cell signaling	13-173	voor α[32P] labeling
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	voor kinase buffer
MnCl2	Sigma-Aldrich	244589	voor kinase buffer
NaCl	Euromedex	1112	voor lysis en kinase buffer
NaF	Sigma-Aldrich	S-1504	voor lysis en kinase buffer
Okaïdische zuur	Euromedex	0-2220	voor lysis buffer
PMSF	Sigma-Aldrich	78830	voor lysis en kinase buffer
p-nitrofenylfosfaat	Euromedex	1026	voor lysis buffer
PVDF membraan Immobilon-P	Merck-Millipore	IPVH00010 poriëngrootte 0,45 mm	voor Western Blot
Roterende schaal	Labinco		voor kralen incubatie
Safe lock eppendorf	Eppendorf	0030120.086	voor kinase assay
SDS	Sigma-Aldrich	5030	voor Laemmli en migratie buffer
Natrium orthovanadate	LC Laboratories	S8507	voor lysis en kinase buffer
Natriumpyrofosfaat	Fluka	71501	voor lysis buffer
Super Signal West Dura	Protein Biology	34075	voor Western Blot
Syngene Pxi	Ozyme		voor Western Blot
Weefselextracten	Biochain	P1234035 Hersenen P12345152 Long P1234149 Lever P1234188 Pancreas P1234260 Testis	voor Western Blot analyse
Transfer Unit	Biorad	Mini-Trans-Blot	voor Western Blot
Tris	Euromedex	26-128-3094 B	voor lysis buffer
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949	voor blocking buffer
Typhoon FLA9500	GE Healthcare		om autoradiagrafie te lezen
Typhoon Trio	Amersham Bioscience		om autoradiagrafie te lezen
Whatman papier	GE Healthcare	3030-672	voor Western Blot