Manipulatie van kleur patronen in springen spinnen voor gebruik in gedrags-experimenten

Samenvatting

Het doel van dit protocol is het manipuleren van de kleur patronen van springen spinnen en andere zeer kleine geleedpotigen met verf om te studeren vragen met betrekking tot seksuele selectie, seksueel kannibalisme, predatie, aposematism, of enig ander gebied van dierlijke kleuring.

Samenvatting

Op het gebied van gedrags-ecologie, zijn veel experimenten ontworpen om de evolutionaire doeleinden van kleurrijke eigenschappen te onderzoeken in de context van seksuele selectie en predatie. Methoden zijn divers, maar meestal bestaan uit het wijzigen van de kleur patronen van individuen met diverse kleurstoffen. Dergelijke technieken zijn gebruikt in vele gewervelde taxa, met name in vogels, maar zijn gebleven onderontwikkeld voor ongewervelden vanwege de moeilijkheid van het effectief manipuleren van kleur in kleine organismen. In plaats daarvan, om de verschijning van ongewervelden te manipuleren, hebben de wetenschappers gewoonlijk de verlichtings omgeving gewijzigd om bepaalde golflengten uit te filteren. Nochtans, beïnvloedt zulk een methode niet alleen de fenotypische trek van belang maar de volledige verschijning van het individu en zijn het omringen. Hier, schalen vaststelling van de technieken die eerder gebruikt op kleurrijke vogels, presenteren we manieren van het manipuleren van de kleuren van kleine geleedpotigen, met behulp van even symbolische, maar bestudeerde soorten: de kleurrijke springen spinnen.

Inleiding

Dieren hebben vaak uitgebreide kleur patronen die ze weer te geven tijdens seksuele ontmoetingen, Agonistische ontmoetingen, of om predatie af te schrikken. Deze eigenschappen kunnen informatie over te brengen aan ontvangers, zoals de individuele kwaliteit van de signalering als een mate¹, vechten vermogen als een concurrent², of smakelijkheid als een prooi punt³. Om te begrijpen de adaptieve doeleinden van kleurrijke eigenschappen, hebben onderzoekers ontworpen experimenten die betrekking hebben op het manipuleren van kleuren op verschillende manieren. Sommige onderzoekers hebben gebruikt gekleurde Decoy stimuli zoals modellen^4,5,6,7,8, Foto's⁹, of Video's^{10,11, 12} die aan ontvangers in gedragsexperimenten worden voorgesteld. Anderen, vooral bij het gebruik van ongewervelde dieren, hebben gemanipuleerd de verlichting omgeving van invloed op de verschijning van kleuren van levende personen^{13,14,15,16, 17}. al deze manipulaties, terwijl ingenieuze, hebben het nadeel van het verwijderen van potentieel belangrijke natuurlijke gedrag en/of van invloed zijn veel meer dan de eigenschap van belang. In grote gewervelde dieren, zoals vogels, de onderzoekers zeer vaak manipuleren kleur rechtstreeks op Live Animals (beoordeeld in Hill en McGraw, 2006¹⁸). Individuele veren of snavels zijn direct gekleurd met markers^{2,19,20,21,22,23,24}, kleurstoffen met waterstofperoxide vaak gebruikt in haar lichters^25,26,27, of verschillende verven waaronder nagellak²⁸. In ongewervelden, dergelijke studies die kleur patronen direct manipuleren op levende dieren zijn relatief zeldzaam, maar hebben nog steeds enorme inzicht in de functie en de evolutie van kleur^{29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39}. Zelfs geleedpotige studies lijken te zijn bevooroordeeld naar grotere taxa die gemakkelijker kunnen worden behandeld en geschilderd, waardoor kleur patronen in zeer kleine soorten relatief onderbestudeerd.

Hier beschrijven we een delicate kleur manipulatie techniek die werd ontwikkeld voor zeer kleine dierlijke taxa. Concreet, deze methode gaat het manipuleren van de gezichts verkleuring van mannelijke springen spinnen onder een microscoop om het belang van dergelijke kleurrijke eigenschappen in de context van mate keuze en seksueel kannibalisme te onderzoeken. In dit geval gebruikten we Habronattus pyrrithrix (verzameld uit Phoenix, AZ, USA) als een model soort (Figuur 1). We hebben gepubliceerd van de resultaten van de experimentele werk met behulp van een aantal van deze technieken elders^38,39, maar hier beschrijven we de methoden in meer detail dan eerder is gedaan, op een manier die moeten ze toegankelijk te maken voor anderen een poging om ze te repliceren of aan te passen voor gebruik op andere zeer kleine taxa. Dergelijke protocollen zouden experimentele kansen op dieren moeten openstellen die zo kleurrijk kunnen zijn zoals de meest symbolische vogels maar die gewoonlijk onderbestudeerd zijn.

Protocol

1. apparatuur voorbereiding

1. Selecteer de gewenste verven.
   1. Voor een succesvolle toepassing, gebruik verven die snel drogen en hebben een textuur die gemakkelijk is gemanipuleerd met dunner. De producten die met succes zijn gebruikt omvatten niet-waterdichte eyeliners die met water kunnen worden verdund, en emailverven die met glazuur dunner (lijst van materialen) kunnen worden verdund.
   2. Bij het schilderen van spinnen, van mening dat de schaal van de meeste soorten heeft een geharde Exoskeleton, terwijl de zachte buik vaak strekt zich uit en vernauwt met voeding⁴⁰.
      1. Geëmailleerde verven produceren een stevige, geharde coating op het geschilderde oppervlak; Daarom passen ze op harde delen van de cuticula (bijv., schaal, benen, pedipalps). Dergelijke emaille coatings zijn minder effectief voor Spider buik, omdat ze afpellen van de spin als de buik verandert vorm met voeding.
      2. In tegenstelling, eyeliners produceren geen geharde coating, maar sijpelen in de gekleurde lichaams schalen; Als dusdanig, gebruik hen op zowel harde als zachte lichaamsdelen (met inbegrip van spin buiken).
         Opmerking: in de komende stappen, is de meest delicate techniek gepresenteerd die bestaat uit het schilderen van het gezicht en pedipalps van de spinnen; emaille verf wordt gebruikt, dat is de meest generaliserende methode te wijten aan de kleur diversiteit van glazuur verf beschikbaar.
   3. Voor het testen van verven op levende dieren, indien mogelijk, eerste maatregel de spectrale eigenschappen van de verf (gewoon toegepast op papier of een ander oppervlak) met behulp van een UV-VIS reflectie spectrofotometer om ervoor te zorgen dat er geen ongewenste UV-pieken in het spectrum dat onzichtbaar voor de mens, maar mogelijk zichtbaar voor de onderzochte soorten.
2. Gebruik een ontleden Microscoop aangesloten op een camera en een computer om gemakkelijker Foto's te maken van de uitkomst van de manipulatie voor documentatie en het verhogen van dupliceerbaarheid (tabel van materialen).
   1. Schakel de Microscoop, computer en software die de camera-ingang verwerkt.
   2. Selecteer de relevante zoom waarop de uiteindelijke foto zal worden genomen.
   3. Plak een insect montage PIN of een kleine spijker (met het hoofd naar buiten gericht) in een bal van niet-verharding modelleren klei (ongeveer de grootte van een druif). (De levende te schilderen spin zal tijdelijk aan het hoofd van deze speld in stap 3,1 hieronder) worden opgezet. Plaats de modellering klei en PIN onder de Microscoop om de doelstellingen aan te passen, zodat ze ruwweg richten op het hoofd van de PIN (waar de spin moet worden gemonteerd).
   4. Zorg ervoor dat de doelstellingen op de juiste afstand voor de ogen van de schilder, en dat de camera is niet het gezichtsveld belemmeren tijdens het schilderen (zoals het geval is als de camera is gemonteerd in een van de oculairen, belemmeren diepte perceptie).
3. Breng de spin in een schone plastic snap-Cap flacon (ongeveer 12 drams, zonder singels of dode prooi).
4. Bereid montage-en schilder apparatuur.
   1. Plaats een extra dunne insect montage PIN in een bal van niet-verharding modelleren klei (in aanvulling op de een gebruikt in stap 1.2.3) en plaats ze aan de linkerkant van de Microscoop (voor rechtshandige mensen). Deze pin wordt gebruikt om de posities van de poten van de spin en pedipalps (indien nodig) voorzichtig aan te passen tijdens het schilderen.
   2. Hier krijg je een klein stukje absorberend papier (zoals een papieren handdoek), een stuk wit printer papier, de verven toe te passen (hier, emailverf), aparte containers van verfverdunner (een voor elke kleur plus een gehouden transparant en schoon), individuele micro borstels voor elke kleur (Zie de lijst van materialen), en een micro-penseel alleen worden gebruikt met schone dunner, alle gepositioneerd op een georganiseerde manier aan de rechterkant van de Microscoop (voor rechtshandige mensen).
   3. Met behulp van een tandenstoker, voeg een druppel verf in een open plastic schaal (zoals een kleine Petri schaaltje of een flacon dop) en voeg verf dunner, bijvoorbeeld met een kleine spuit. Meng de twee met de tandenstoker naar de juiste consistentie (wanneer de verf is volledig gehomogeniseerd, maar niet te loopneus) door het te testen op de witte printer papier met een micro-borstel.
      Opmerking: in bepaalde gevallen, als de verf droogt snel, bereid het met iets meer vloeistof dan gewenst voor de toepassing, en laat de borstels genieten in de pot van verfverdunner tot later gebruik (stap 4).
   4. Zet een druppel erwt-gerangschikte van op water-gebaseerde lijm (Zie lijst van materialen) op een hoek van het printerdocument.
      Opmerking: dit moet de laatste fase van het voorbereiding en de volgende stap moet gebeuren onmiddellijk na deze, zodat de lijm niet uitdrogen.

2. verlamming de spin

1. Met de spin in de flacon en een hand gecupt over de opening om te ontsnappen te voorkomen, Voeg langzaam CO₂ gas tot het derde paar van de spin benen strekt zich uit tot 180 graden.
2. Gebruik een tijd van blootstelling aan CO₂ van ongeveer 20 seconden tot 1,5 minuten, afhankelijk van de gemiddelde grootte van de soort en op de individuele spin. We hebben de uitbreiding van de derde paar poten om een betrouwbare indicator van het juiste niveau van anesthesie in H. pyrrithrix, maar dit waarschijnlijk varieert over soorten. Als het gebruik van deze technieken met een andere soort voor de eerste keer, eerste test de anesthesie op een paar exemplaren om hun reactie te beoordelen.
3. Geef spinnen zo weinig CO₂ mogelijk om het benodigde niveau van de anesthesie te bereiken. Terwijl de korte periodes van de anesthesie hier beschreven geproduceerd geen mortaliteit (en geen merkbare gedragsverschillen van niet-verdoofd spinnen), geven alle dieren in een experiment gelijke niveaus van anesthesie (met inbegrip van Sham controles).
4. Houd de flacon gesloten na het toevoegen van CO₂ aan de spin onder narcose te handhaven; Daarom, ook deze tijd bij de berekening van hoe lang de spin wordt blootgesteld aan CO₂.
5. Zodra de spin is verwijderd uit de flacon om kleur manipulatie te beginnen, zal het blijven volledig verdoofd voor ongeveer 1 tot 2 minuten; Voer daarom de volgende stappen (secties 3-6) onmiddellijk uit. Wegens dit beperkte tijdvenster, poging de volgende het schilderen methode met dode specimens eerst (voor praktijk) alvorens te proberen om levende spinnen te schilderen.

3. montage van de spin onder de Microscoop

1. Voeg een zeer kleine hoeveelheid lijm op het hoofd van de montage PIN of spijker in de modellering klei voorbereid op het gebied van visie van de Microscoop.
   Opmerking: gebruik de kleinste hoeveelheid lijm die het mogelijk maakt het handhaven van de spin in de plaats om ervoor te zorgen dat ik) de spin niet glijdt uit de pinhead (als er te veel lijm wordt gebruikt), en II) de spin beheert om zichzelf te bevrijden na het ontwaken.
2. Schuif de verdoofd spin van de flacon op de tafel met de buik omhoog.
   Nota: omdat de buiken van spinnen zacht zijn, zou de zorg moeten worden genomen om de spinnen op de lijst niet te onttrekken of te laten vallen, aangezien dit verwonding kan veroorzaken.
3. Druk voorzichtig op de pinhead (met lijm) op het borstbeen van de spin (het centrale gebied waar de spin de benen hechten aan het lichaam) zodanig dat de spin zal iets stuiteren en uit te breiden zijn benen onder de kleine druk toegepast. Voor extra controle van de toegepaste druk, houd de modellering klei met beide handen, met beide handen stevig gestabiliseerd tegen de tafel.
4. Plaats de modellering klei onder de Microscoop, zodat het gebied te schilderen is naar boven gericht en in focus.

4. het schilderen van de spin

1. Beoordeel de verf consistentie voorafgaand aan het aanraken van de kwast aan de spin.
   1. Hertest de verf consistentie (gebruik het absorberende papier om de borstels te vegen als ze werden gehandhaafd in de dunner), opnieuw aan te passen indien nodig, en altijd eerst proberen de toepassing van verf op de printer papier om de controle voor de verf hoeveelheid in de borstelharen.
   2. Met de rechterhand en terwijl u door de Microscoop, breng het topje van de borstel op het gebied van visie, en zorg ervoor dat (een tweede keer) dat de borstelharen niet te veel verf bevatten, in welk geval veeg een deel van het op de printer papier.
2. Test de verf consistentie op de spin.
   1. Raak de spin met de borstel op het grootste gebied dat zal moeten worden geschilderd over. Dit zal de schilder de vraag of de consistentie en de hoeveelheid verf juist is(dat wil zeggen, wanneer de verf iets en langzaam doorweekt in het haar/schalen van de spin).
      1. Als er geen verf wordt toegepast, genieten van de borstel in de verf en terug te keren naar stap 4,1 om de procedure te herhalen.
      2. Als de verf doorweekt in snel en morsen over op een gebied dat niet mag worden gedekt door verf, en ervan uitgaande dat het morsen is minimaal en dat het individu nog zou kunnen deelnemen aan het experiment, veeg de borstel op de absorberende papier en terug te keren naar stap 4,1 te herhalen de procedure.
         Opmerking: dit type vloeibare lekkage kan niet worden vastgesteld. Als het morsen bereikt de chelicerae of de ogen, of andere delen die kunnen worden dodelijk of giftig voor het individu, overweeg dan het plaatsen van de spin onmiddellijk in de vriezer om het te euthanaseren voordat het wakker wordt en met uitzondering van de spin uit het experiment.
3. Verf alle gebieden die kleuren nodig hebben na stap 4,1 en 4,2.
   1. Als het schilderen van het gezicht van de spin, gebruik maken van de extra dunne pin met de linkerhand te houden van de voorste poten en pedipalps (zodat ze zullen worden uit de weg van de kwast). Dit wordt het best gedaan terwijl het kijken door de Microscoop om het beschadigen van de spin aanhangsels te vermijden. Bovendien, als het schilderen van het gezicht van de spin, en afhankelijk van de borstels gebruikt om te schilderen, overweeg dan het schilderen van beide zijden van het gezicht voordat je probeert om het centrale deel tussen de ogen verf-beide geschilderde gebieden kunnen worden samengevoegd door het vasthouden van de borstel evenwijdig aan de spin gezicht en het induceren van capillaire werking.
      Opmerking: bij het schilderen van het gezicht van de spin, is het makkelijkst om eerst verf de kant het dichtst bij de dominante hand, en draai vervolgens de bal van klei (met de gemonteerde spin) rond onder de Microscoop aan de andere kant verf, gevolgd door het midden.
   2. Bij het schilderen van pedipalps of benen, zorg ervoor dat u geen gewrichten aanraken als de verf is een verharding een (zoals het glazuur verf), en zorg ervoor dat niet verf toe te passen op sperma van de mannelijke aflevering organen (aan de onderzijde van het distale segment van de pedipalps).

5. het beeld van de spin nemen

1. Schakel de doelstelling in op de cameramodus.
2. Neem een foto met behulp van de computer software, zorg ervoor dat de geplukte zoom is het een geselecteerd op de Microscoop, zodat een schaalbalk kan worden toegevoegd.

6. het vrijgeven van de spin van de PIN of nagel

1. Wanneer de spin begint te bewegen, houd de PIN, zodat de voorpoten van de spin zijn het aanraken van de spin flacon.
2. Laat de Spider release zelf, en indien nodig, zachtjes geneigd de PIN te helpen de spin zich weg te trekken uit de gedroogde lijm.
   1. Als de spin wakker wordt voordat het schilderij is voltooid, laat de spin ten minste 15 minuten om te herstellen voordat ze verdoofd weer. Als dit gebeurt, zorg ervoor dat alle groepen krijgen dezelfde niveaus van anesthesie (met inbegrip van Sham-behandelde individuen, indien van toepassing).
      Opmerking: spinnen lijken hun normale gedrag snel te hervatten na manipulatie (< 15 min), maar we raden een standaard rusttijd van 12 uur voorafgaand aan het gebruik van de spin in een gedrags-test.

7. analyse van het gedrag van de spinnen

1. Vergelijk het gedrag van ongemanipuleerde, schijn-behandeld, en gemanipuleerde onderwerpen om de potentiële toxiciteit van de toepassing (die kan variëren door specifieke verftype, kleur, toepassingsgebied, en studie soorten) te beoordelen. Relevant gedrag te vergelijken kan omvatten activiteit tarief, type activiteit uitgevoerd, succes bij het uitvoeren van specifieke activiteiten (bijv. het vastleggen van prooi), enz.
   1. Gebruik Sham-behandelde spinnen als deel van het experimentele ontwerp (bijvoorbeeld ontvangend de verf toepassing op een niet-zichtbaar gebied of het hebben van neutraal-gekleurde verven die op de zelfde gebieden worden toegepast) om de kleur van het individu slechts te veranderen terwijl het controleren voor andere factoren (bijv. verwerkingstijd, geur, oppervlaktetextuur, enz.).
      Opmerking: als het schilderen benen of pedipalps, overweeg dan de mogelijkheid dat dit kan interfereren met sensorische haren (overwegend op spin benen en pedipalps, zie Foelix 2010⁴⁰) en, in deze gevallen Sham-behandelde mannetjes moeten neutraal gekleurde verven toegepast op de dezelfde gebieden als een besturingselement.
   2. Bij het ontwikkelen van nieuwe methoden, vergelijk geschilderde spinnen met ongemanipuleerde spinnen om te beoordelen of kleur gemanipuleerde individuen nog steeds normaal gedragen.

8. het meten van de reflectie eigenschappen van de kleur manipulatie op het geschilderde onderwerp

1. Zodra euthanized (na spinnen waren betrokken bij een experiment of specifiek euthanized voor dit doel, zie noot hieronder), meet de spectrale eigenschappen van de kleur manipulatie met behulp van een standaard draagbare UV-VIS spectrofotometer (tabel van materialen ), met name voor gebieden groter dan 1 mm in diameter.
2. Voor kleinere gebieden, gebruik maken van een custom-built microspectrophotometer (een UV-VIS spectrofotometer gerouteerd door een Microscoop) voor eenvoudiger en nauwkeuriger metingen, hoewel de optiek van de Microscoop uitgesneden UV-licht, wat betekent dat de metingen zijn beperkt tot de mens-zichtbare golflengten (Zie Taylor et al. 2011⁴¹).
3. In gevallen waar kleur gemanipuleerde gebieden zijn zeer klein en UV-reflectie gegevens nodig zijn, gebruik commercieel beschikbare UV-VIS microspectrophotometers, hoewel ze duurder zijn (Zie Taylor et al. 2014⁴²).
   Opmerking: de lichtbron van UV-VIS spectrofotometers bevat UV-licht en kan gevaarlijk zijn voor dieren ' ogen (met inbegrip van de onze), zodat spectrale maatregelen moeten alleen worden gedaan nadat de dieren zijn euthanized en niet alleen verdoofd. Voor glazuur-geschilderde spinnen, kan dit worden gedaan nadat de spinnen zijn gebruikt in experimenten, omdat de verf niet slijten (Zie representatieve resultaten hieronder). Voor verf op waterbasis die soms kan vervagen na dagen of weken, kan een set van spinnen worden opgeofferd voor de meting op het moment dat hun tegenhanger zou worden betrokken bij een experiment (om gegevens die de werkelijke kleur manipulatie gebruikt in de opname weerspiegelt experiment). Het rapporteren van de spectrale eigenschappen van de verven zal replicatie mogelijk maken van andere onderzoekers die de kleur manipulatie willen repliceren, maar geen toegang hebben tot dezelfde specifieke verf producten.

Resultaten

Effectiviteit van kleur manipulatie

Met behulp van deze technieken, verschillende graden van kleur manipulatie effectief zijn, met inbegrip van het verbergen van kleuren volledig of vermindering of verbetering van hun intensiteit. Dit blijkt uit zowel Foto's als metingen van spectrale reflectie (Figuur 2, Figuur 3, en Figuur 4). Hier tonen wij kleur-gemanipuleerde mannelijke Habronattus pyrrithrix in vergelijking met natuurlijke rood-onder ogen gezien mannetjes. Spectrale eigenschappen werden gemeten met behulp van een UV-VIS spectrofotometer (zie tabel van materialen) die nauwkeurig kan meten gekleurde gebieden zo klein als 1mm in diameter. Metingen werden genomen ten opzichte van een diffuse reflectie witte standaard (zie tabel van materialen).

In zeldzame gevallen (5 van de 108 mannetjes geschilderd met zwarte eyeliner 1 (Zie tabel van materialen) op hun gezicht), de in water oplosbare eyeliner begon te slijten van de spinnen ' gezichten na een week of twee. Dit werd niet waargenomen voor het andere merk van eyeliner (eyeliner 2; Zie lijst van materialen). In beide gevallen, werden de kooien van de spin besproeid met water drie tot vijf keer per week. Verschillende onderhoudsvoorwaarden kunnen de slijtage van verf op waterbasis beïnvloeden. Het glazuur verf was nog steeds intact voor alle gemanipuleerde mannetjes (n = 221), zelfs voor degenen die nog in leven na 6 maanden.

Mogelijke toxiciteit van de kleur manipulatie

Men moet voorkomen dat je verf op de ogen van de spinnen zo niet om hun visie te belemmeren, noch op hun chelicerae, monddelen en andere openingen, en eventueel andere zachte lichaamsdelen om mogelijke inslikken en vergiftiging te voorkomen. Men moet ook voorzichtig zijn met het schilderen van gewrichten of onderdelen die sensorische haren bevatten (zoals de benen en pedipalps) om niet te beperken hun mobiliteit of zintuiglijke systeem. Nochtans, als dergelijke kleuren manipulaties op deze lichaamsgebieden noodzakelijk zijn, of als er om het even welke twijfel over de mogelijkheid van subtiele negatieve gevolgen is, is het dan best om verven aan individuen in alle behandelings categorieën toe te passen. Op deze manier zou men voorkomen dat onbedoeld manipuleren van de zintuiglijke systemen van individuen op een manier die zou kunnen worden bevooroordeeld tegen een van de behandelingen alleen. Bijvoorbeeld, in een experiment met behulp van mannetjes gemanipuleerd getoond in Figuur 4, het doel was om het aantal rode vlekken weergegeven door mannen tijdens het Hof te verhogen en te verlagen. Aangezien sommige mannetjes hun natuurlijke rode gezichten zouden krijgen die met grijze geëmailleerde verf worden verborgen (om de hoeveelheid rood getoond te verminderen), de andere mannetjes waarvoor wij een rood gezicht wilden handhaven werden geschilderd rood over hun natuurlijk rood gezicht met het zelfde product zoals grijs-onder ogen gezien Mannen. Evenzo, omdat we wilden rode vlekken toe te voegen aan de Pedipalp op bepaalde mannetjes om de hoeveelheid rode kleur patches weergegeven te verhogen, grijze verf werd gebruikt om de Pedipalp van andere mannen te dekken, zodat alle mannetjes zou worden geschilderd op dit gevoelige gebied (Zie Figuur 4) . Hoewel de voorkeur verdient, kan deze strategie niet altijd haalbaar zijn. Bijvoorbeeld, in een ander experiment, de rode kleur werd verwijderd met behulp van een zwarte eyeliner het geven van dezelfde spectrale eigenschap als de onderliggende cuticula van de mannelijke, terwijl het verlaten van de andere mannelijke kleuren intact en natuurlijk (Figuur 2). In dit geval, voor natuurlijk uitziende mannetjes, dezelfde hoeveelheid eyeliner werd toegepast op het gebied op de top van hun schaal net achter hun voorste mediaan ogen (een gebied dat niet duidelijk zichtbaar is voor vrouwen), de controle voor de potentiële geur of de algehele toxiciteit van de Product. Echter, de locatie waar de verf wordt toegepast kunnen spinnen anders beïnvloeden. Daarom, om subtiele verschillen in de weg of de locatie waar de verf werd toegepast te beoordelen kan hebben op de integriteit van de spin, het gedrag van beide soorten mannen in een context die relevant was voor onze hypothesen (ten opzichte van mate keuze en seksueel kannibalisme) werd vergeleken. Mannetjes werden gebracht twee-door-twee in de aanwezigheid van een vrouwtje, en we vergeleken hun vertraging actief te worden, hun vertraging bij de rechterlijke macht, en de totale duur die ze besteed Hof met algemene lineaire Mixed effect modellen (met behulp van de functie lmer met de R-pakket lme4⁴³ in R versie 3.5.2⁴⁴ met de vrouwelijke identiteit als een willekeurig effect, en met behulp van de maximale waarschijnlijkheid criterium om p-waarden te verkrijgen). In dit geval, alle vergelijkingen onthullen geen verschillen tussen de behandelingen (zie tabel 1) en het was daarom geconcludeerd dat we niet een bias in het voordeel van een of de andere behandeling categorie in te voeren.

In beide gevallen, wanneer het hebben van zeer vergelijkbare behandeling categorieën (Figuur 4), of alleen schijnvertoning behandeld personen (Figuur 2 en Figuur 3), onderzoekers moeten beoordelen hoe hun modelsoorten worden beïnvloed door de verf die ze gebruiken en ervoor zorgen dat ze gedragen zich nog steeds op een gelijkaardige en ecologisch relevante manier. Men kon gegevens registreren om de mogelijke gevolgen van giftigheid zo veel mogelijk te beoordelen, bijvoorbeeld door activiteiten tarieven tussen behandelde en ongemanipuleerde individuen te vergelijken. Onze spinnen geschilderd met glazuur verf zoals in Figuur 4 werden vergeleken met ongemanipuleerde mannetjes in een anders identieke context. Specifiek, werden de mannetjes afzonderlijk geïntroduceerd aan een vrouwelijke kooi en hun vertraging om de flacon, vertraging te verlaten aan het Hof en het Hof van tarief (voorafgaand aan de paring, en voorafgaand aan wordt aangevallen of kannibaliseren) werden vergeleken. Er zijn geen verschillen gevonden (bij gebruik van vergelijkbare lineaire Mixed effect modellen als hierboven) en daarom hebben we geconcludeerd dat onze geschilderde mannetjes zich natuurlijk gedragen (tabel 2).

Ten slotte is het belangrijk op te merken dat alle spinnen in de experimenten (meestal vrouwen) dat kannibaliseren kleur-gemanipuleerde mannetjes nooit bleek te lijden aan negatieve effecten. Spinnen verteren hun prooi extern, meestal het verlaten van de geschilderde gebieden van de cuticula achter. Echter, als de aanpassing van deze methode voor andere systemen waar de kleur gemanipuleerde dieren zullen worden verbruikt, moet men beoordelen van de potentiële Risico's van toxiciteit.

Figuur 1 . Volwassen mannelijke Habronattus pyrrithrix illustreren hoe klein hun gekleurde lichaam regio's zijn. Gefotografeerd door Lyle Buss. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2 . Experimentele kleur manipulatie gebruikt om rode gezichts verkleuring te verbergen in Habronattus pyrrithrix. (A) de intact rode gezichts kleuring vóór kleur manipulatie. (B) de gezichts kleuring van het zelfde mannetje na het verbergen van de natuurlijke rode kleuring met zwarte eyeliner 1. (C) representatieve reflectie Spectra voor de natuurlijke rode gezicht, de natuurlijke onderliggende zwarte cuticula, en het rode gezicht geschilderd met zwarte eyeliner 2. Gewijzigd van Taylor en McGraw 2013³⁹. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3 . Experimentele kleur manipulatie gebruikt om de grootte en roodheid van de rode gezicht patch van mannelijke Habronattus pyrrithrix te verminderen. (A) de intact rode gezichts kleuring vóór kleur manipulatie. (B) de gezichts verkleuring van het zelfde mannetje na het aanbrengen van verdunde zwarte eyeliner (stedelijk bederf) aan het voorste deel van het gezicht, en niet-verdunde zwarte eyeliner langs de randen van de gezichts flard om de grootte van het rode gebied te verminderen. (C) betekenen spectrale krommen van schijn-behandelde controle mannetjes (n = 21) en kleur-gemanipuleerde mannetjes (n = 21), vergeleken met het bevolkingsgemiddelde (n = 57) en de 10 wereld drabbest mannetjes van een vorige studie⁴¹. Figuur gereproduceerd van Taylor et al. 2014³⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4 . Experimentele kleur manipulatie gebruikt om de kleur van de rode gezicht patch van Male te wijzigen Habronattus pyrrithrix. Habronattus pyrrithrix mannetjes geschilderd met (A) rood, (B) rood en grijs, en (C) grijs glazuur verf over hun natuurlijke rode gezicht en natuurlijk crème-gekleurde pedipalps. Dbetekenen spectrale krommen voor ongemanipuleerde mannetjes (n = 9), en mannetjes met hun gezicht bedekt met rode glazuur verf (n = 9). Door het aanbrengen van een helderder rood over het gezicht van de spin, hebben we effectief versterkt de rode gezichtskleur. Omdat glazuur verf volledig betrekking op de onderliggende schalen, kleur kan ook volledig worden veranderd, zoals het geval is met de grijze glazuur. (E) in dit experiment, rood en grijs glazuur verven werden gekozen om te worden geëvenaard voor de totale helderheid (totale reflectie over het bereik van golflengten zichtbaar voor deze spinnen). Verschillen in de schaal van de Y-assen in D en E zijn te wijten aan verschillende technieken (zoals afstand tot het monster en de grootte van de gemeten gebieden) voor het meten van kleurmonsters op papier (E) versus directe metingen van de kleuren op het gezicht van de spin (D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

N	Afhankelijke variabele	P	T	Rood-geconfronteerd	± SE	Zwart-faced	± SE	nFID
202b	Male vertraging te verlaten schotel	0,35	-0,93	140,0	23,9	109,8	23,9	102
179c	Male vertraging voor de rechter	0,74	0,33	983,4	127,1	1031,0	126,5	95
204a	Mannelijke gerechts inspanning	0,52	0,63	181,2	24,4	203,0	24,4	102
204a	Mannelijke gerechts inspanning voorafgaand aan een aanval	0,41	0,68	89,0	15,7	97,5	15,7	102

Tabel 1. Effect van mannelijke gezichtskleur manipulatie op gedrag, wanneer geschilderd met zwarte eyeliner vs. Sham behandeld (Figuur 2). De structuur van elk model wordt gegeven, alsmede de gemiddelde schattingen in seconden (± SE) voor elke behandelgroep. N = aantal mannetjes, p en t = p-waarde en t-waarde voor de mannelijke behandeling, nFID = het aantal niveaus in het Random effect vrouwelijke identiteit. ^een Uit de 104 mannelijke tests uitgevoerd, 102 werden met succes opgenomen, wat leidt tot 204 unieke mannen waargenomen. ^b2 mannetjes werden kannibaliseren door het vrouwtje voorafgaand aan ooit het verlaten van de petrischaaltje. ^c25 mannetjes werden kannibaliseren door het wijfje voorafgaand aan ooit het Hof van het wijfje.

N	Afhankelijke variabele	P	T	Ongemanipuleerd	± SE	Geschilderd	± SE
32a	Male vertraging te verlaten schotel	0,87	-0,17	380,8	143,1	345,4	152,4
31b	Male vertraging voor de rechter	0,93	-0,09	502,6	105,8	488,1	116,6
31b	Mannelijke gerechts inspanning	0,74	-0,33	2324,3	455,0	2102,1	484,4
31b	Mannelijke gerechts inspanning voorafgaand aan een aanval	0,68	0,42	1495,1	450,8	1770,1	479,9

Tabel 2. Effect van mannelijke gezichtskleur manipulatie op gedrag, wanneer geschilderd met rode of grijze glazuur verf (n = 15, Figuur 4) versus ongemanipuleerde mannetjes (n = 17). De structuur van elk model wordt gegeven, alsmede de gemiddelde schattingen in seconden (± SE) voor elke behandelgroep. N = aantal mannetjes, p en t = p-waarde en t-waarde voor de mannelijke behandeling. ^een17 ongemanipuleerde mannetjes werden vergeleken met een subset van alle geschilderde mannetjes in ons experiment (n = 221). Concreet werden ze vergeleken met 15 geschilderde mannetjes (5 rood (Figuur 2a), 5 rood en grijs (Figuur 2b), en 5 grijs (figuur 2c)) getest in dezelfde context (in aanwezigheid van een vrouwtje) en in dezelfde specifieke periode. Dit is belangrijk omdat de ongemanipuleerde mannetjes aan het eind van het experiment (in augustus en september 2018) werden getest, dat aan het eind van hun natuurlijk het fokkenseizoen beantwoordt en waar de mannetjes over het algemeen minder actief zijn. Het houden van al deze andere variabelen gelijk stelt ons in staat om het schilderen behandeling te vergelijken zonder de invoering van andere vooroordelen. ^b Één mannetje (al grijs) werd kannibaliseren voorafgaand aan ooit het Hof van het wijfje.

Discussie

Hier laten we zien dat de kleuren van kleine lichaamsdelen van geleedpotigen effectief kan worden gemanipuleerd met behulp van kleurstoffen zoals make-up en glazuur verven.

De eerste kritieke stap om dergelijke delicate manipulatie te bereiken is om kleine dieren te kunnen immobiliseren die meestal niet in de hand kunnen worden gespannen. Hier, om te kunnen gevoelige gebieden zoals Jumping Spider gezicht te schilderen, we verdoofd personen met CO₂ en gemonteerd ze op het hoofd van een pin. Dit maakt het werk dicht bij de ogen van de spin met minder stress dan de spin zou waarschijnlijk ervaring als het wakker was (met licht uit de Microscoop schijnt in hun gezichten tijdens het schilderij proces).

De methode vereist ook het krijgen van goede kwaliteit micro borstels, en, meest kritisch, passende kleurstoffen. De moeilijkste stap bij de toepassing van verf zonder morsen, maar met een goede dekking is om de juiste consistentie te krijgen. Daarom, de kleurstoffen moeten gemakkelijk worden verdund met een dunner, en gemakkelijk uitgedroogd voor verdikking. Verschillende soorten verven kunnen worden gebruikt; Hier worden de resultaten gepresenteerd met water oplosbare (niet-waterdichte) eyeliners en emailverven. De niet-waterdichte eyeliners hebben het voordeel om gemakkelijk vloeibaar te zijn wanneer gemengd met water. Echter, dit verhandelt met de verdunning van de pigmentatie (die niet kan of kan wenselijk zijn (zie bijvoorbeeld Figuur 3)). Emaille verven hebben een consistentie die gemakkelijk kan worden gecontroleerd door het toevoegen van glazuur dunner, terwijl nog steeds het verstrekken van volledige dekking. Nochtans, handelt dit kenmerk weg met de mogelijkheid om het haar of de schaalstructuur van het geschilderde lichaamsdeel te handhaven. Bovendien zijn emailverven langdurig. Het nadeel hiervan is dat glazuur verf en dunner sterke geuren uitstoten tijdens de toepassing en voor het drogen. Een extra moeilijkheid met betrekking tot de kleurstoffen kunnen worden om de juiste schaduw te vinden, met de juiste spectrale eigenschappen. Het is bijvoorbeeld moeilijk te krijgen rode eyeliner te gebruiken in parallel met zwarte eyeliner, zoals eyeliners zijn vaak meer roze dan rood. Het is ook moeilijk te krijgen make-up poeder (of pigmenten) die geen glitter bevatten (die soms alleen zichtbaar onder de Microscoop). Veel make-up producten ook weerspiegelen UV-licht, die, terwijl onzichtbaar voor de experimenten, kunnen worden opvallend aan de onderzochte dieren.

Het manipuleren van de kleur van geleedpotigen door direct toe te passen kleurstoffen op hun lichaamsdelen komt met voordelen en ongemakken in vergelijking met andere methoden. De belangrijkste beperking is dat men niet kan absoluut ontslaan de mogelijkheid van een aantal subtiele toxiciteit effecten. Nochtans, kan men ervoor zorgen om geen biases tegen één behandelingsgroep te introduceren door verf aan alle behandelings categorieën toe te passen, en/of men kan testen of de verf toepassing zich met gedrag van belang mengt. Met de hier voorgestelde methodes, verzamelden wij genoeg bewijsmateriaal om voor te stellen dat de verf toepassing tot verwaarloosbaar aan geen negatief effect (lijst 1 en lijst 2) leidde. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat kleine patches van kleur kan worden gericht, hun kleur ' verwijderd ' (Zie Figuur 2), gemaakt saaier (Figuur 3) of helderder (Figuur 4), in isolement van de rest van het lichaam kleur en het individu Milieu. Dit contrasteert met de meest voorkomende alternatieve methode die bestaat uit het manipuleren van de lichtomstandigheden, en daarmee het wijzigen van de visuele verschijning van het hele individu en zijn omgeving. In feite, zelfs wanneer niet specifiek het manipuleren van lichtomstandigheden, kan men met succes manipuleren van kleur en Zie beperkte of geen effecten van deze manipulatie als de verlichting omgeving is niet geschikt³⁹. Daarom is het belangrijk om te meten en te overwegen de lichte omgeving waar alle experimenten zullen worden uitgevoerd (dat wil zeggen, maatregel straling) en zorg ervoor dat nauw aansluiten bij de natuurlijke lichtomstandigheden (bijvoorbeeld met behulp van full spectrum gloeilampen die na te bootsen natuurlijk licht in gevangenschap). Globaal, door micro-borstels en een microscoop te gebruiken, staat dit protocol voor nauwkeurigere manipulatie van uiterst kleine kleuren flarden dan de meeste andere directe kleurende methodes toe die eerder op ongewervelden zijn gebruikt. De meeste eerdere studies hebben gebruikt dieren met kleur patches die relatief groot zijn in vergelijking met de gezichten van springen spinnen (bijv. manipulatie van vlinder vleugel kleuren^29,34,35, de lichamen van volwassen hemipterans (' ware insecten ')^30,36 en sprinkhanen³¹, of de benen van vrij grote wolfspinnen^32,33,37). De hier gepresenteerde methoden open te stellen mogelijkheden om de verbazingwekkende diversiteit van kleur patches te bestuderen op taxa die zijn onderbestudeerd vanwege hun geringe omvang.

Soortgelijke technieken kunnen worden toegepast op andere geleedpotigen die kunnen worden gemobiliseerd of verdoofd en voor gebieden waar verf zou niet van invloed op de mobiliteit of de gezondheid van het individu (dat wil zeggen, met uitzondering van gebieden zoals gewrichten, structuren zoals haar of arolia die nodig zijn voor passende motoriek, monddelen, of andere openingen zoals Ademhalings structuren). Deze technieken kunnen ook worden uitgebreid tot een groter palet van kleurstoffen, verven, en makeups die op grote schaal beschikbaar zijn te nemen.

Ten slotte kunnen deze delicate technieken niet alleen worden gebruikt om kleur te manipuleren op kleine organismen, maar ook om patronen te manipuleren (zoals strepen) in relatief grotere organismen. Dit moet gunstig zijn voor een breed scala van onderzoekers die onze methoden kunnen aanpassen aan hun eigen studies van seksuele selectie, communicatie, aposematic prooi signalen, en andere contexten waarin dieren gebruik van kleur.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CO2 tank	AirGas (Radnor, PA)	#CD 50	om spinnen te verdoven
Enamel paint thinner	Testors (Vernon Hills, IL)	75611792569	om emailverf te verdunnen
Flat enamel paint	Testors (Vernon Hills, IL)	rood: 075611115009, zwart: 075611114903, wit: 075611116808	kan worden verdund met emailverfverdunner
Lichtmicroscoop	Zeiss (Jena, Duitsland)	stemi 508	om kleine gebieden nauwkeurig te beschilderen
Lichtmicroscoopcamera	Zeiss (Jena, Duitsland)	Axiocam 105 color	om foto's te maken voor en na manipulatie ter documentatie
Lichtmicroscoopcamerasoftware	Zeiss (Jena, Duitsland)	Zen 2 blue edition	om foto's te verwerken die zijn gemaakt voor en na manipulatie
Vloeibare eyeliner, kleur “Perversion”	Urban Decay (Costa Mesa, CA)	(niet meer verkrijgbaar)	niet-waterdichte eyeliner die kan worden verdund met water; eyeliner 2
MegaLiner vloeibare eyeliner, zwart	WetnWild (Los Angeles, CA)	SKU# 871A	niet-waterdichte eyeliner die kan worden verdund met water; eyeliner 1
Microborstels	MicroMark (Berkeley Heights, NJ)	#84648	om kleine gebieden nauwkeurig te beschilderen
Niet-harden modelklei	Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC)	18165	om kleine spijker of insectenpin erin te steken en hun hoeken flexibel aan te passen
Kleine spijker of insectenmontagepinnen	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#1208B7	om spinnen vast te lijmen en de ledematen van de spin voor het te schilderen gebied te verplaatsen
Kleine plastic containers zoals de deksels van insectenverzamellichamen met kliksluiting	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#8912	om verf en verdunner tot de juiste consistentie te mengen
Kleine spuit	Fisher Scientific	1482910F	om een kleine hoeveelheid emailverfverdunner over te brengen
Spectralon witte standaard	Labsphere Inc. (North Sutton, NH)	WS-1-SL	om spectrale eigenschappen van kleuren te meten
UV-VIS-spectrofotometer	Ocean Optics (Dunedin, FL)	USB 2000 (spectrofotometer) met PX-2 (lichtbron)	om spectrale eigenschappen van kleuren te meten
Wateroplosbare schoollijm	Elmer's (High Point, NC)	#E304	om de spinnen op een spijker/pin te monteren
Houtsplinters	Up&Up, Target Corporation (Minneapolis, MN)	#253-05-0125	om druppels emailverf over te brengen