Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Vesiculo synthese van peptide membraan precursoren voor autonome Vesicle groei

5.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59831

⸱

28 juni 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics of Synthetic Systems - E14, Physics-Department and ZNN, Technische Universität München, 2Departmant of Chemistry, Center for Integrated Protein Science (CIPSM), Technische Universität München, 3Nanosystems Initiative Munich

In dit artikel

Samenvatting

Hier gepresenteerd zijn protocollen voor de creatie van peptide-gebaseerde kleine unilamellaire blaasjes in staat van groei. Om de vesiculo productie van het membraan peptide te vergemakkelijken, zijn deze blaasjes uitgerust met een transcriptie-vertaalsysteem en de peptide-encoding plasmide.

Samenvatting

Compartimenalisatie van biochemische reacties is een centraal aspect van synthetische cellen. Voor dit doel, peptide-gebaseerde reactie compartimenten dienen als een aantrekkelijk alternatief voor liposomen of vetzuur gebaseerde vesicles. Uitwendig of binnen de blaasjes kunnen peptiden gemakkelijk worden uitgedrukt en de synthese van membraan precursoren vereenvoudigen. Hier is een protocol voor het maken van blaasjes met diameters van ~ 200 nm gebaseerd op de amfifiele elastïne-achtige polypeptiden (ELP) met behulp van uitdroging-rehydratatie van glas kralen. Ook zijn de protocollen voor bacteriële ELP expressie en zuivering via inverse temperatuur fietsen, evenals hun covalente functionalisatie met fluorescerende kleurstoffen. Bovendien beschrijft dit verslag een protocol om de transcriptie van RNA aptamer dBroccoli in ELP-blaasjes als een minder complex voorbeeld voor een biochemische reactie mogelijk te maken. Ten slotte wordt een protocol verstrekt, dat toelaat in vesiculo expressie van fluorescerende eiwitten en het membraan peptide, terwijl de synthese van de laatste resulteert in vesikel groei.

Inleiding

De creatie van synthetische levende cellulaire systemen wordt meestal benaderd vanuit twee verschillende richtingen. In de top-down methode wordt het genoom van een bacterie gereduceerd tot de essentiële componenten, wat uiteindelijk leidt tot een minimale cel. In de bottom-up benadering, worden kunstmatige cellen geassembleerd de Novo van moleculaire componenten of cellulaire subsystemen, die functioneel moeten worden geïntegreerd in een consistente cel-achtige systeem.

In de de Novo aanpak wordt de compartimenlise ring van de noodzakelijke biochemische componenten meestal bereikt met behulp van membranen gemaakt van fosfolipiden of vetzuren1,2,3,4. Dit komt omdat "moderne" celmembranen voornamelijk bestaan uit fosfolipiden, terwijl vetzuren worden beschouwd als plausibele kandidaten van prebiotische membraanbehuizingen5,6. Voor de vorming van nieuwe membranen of om membraan groei te vergemakkelijken, moeten amfifiele bouwstenen worden geleverd vanaf de buitenkant7 of idealiter door productie binnen een membraneus compartiment met behulp van de overeenkomstige anabole processen4 ,8.

Hoewel lipide-synthese een relatief complex metabolisch proces is, kunnen peptiden vrij gemakkelijk worden geproduceerd met behulp van celvrije genexpressie-reacties9,10. Vandaar, peptide membranen gevormd door amfifiele peptiden vertegenwoordigen een interessant alternatief voor lipide membranen als Behuizingen voor kunstmatige cel nabootst die in staat zijn om te groeien11.

Amfifiele elastïne-achtige di-Block copolymeren (Elp's) zijn een aantrekkelijke klasse van peptiden, die als bouwsteen voor dergelijke membranen12kunnen dienen. Het basis aminozuursequentie motief van ELPs is (gagvp)n, waarbij "a" elk aminozuur kan zijn behalve Proline en "n" het aantal motief herhalingen13,14,15,16,17 . Elp's zijn gemaakt met een hydrofoob blok met voornamelijk fenylalanine voor a en een hydrofiel blok, voornamelijk samengesteld uit glutaminezuur11. Afhankelijk van een parameter en oplossings parameters, zoals pH en zoutconcentratie, vertonen Elp's een zogenaamde inverse temperatuur overgang bij temperatuur Tt, waarbij de peptiden een volledig omkeerbare faseovergang ondergaan van een hydrofiele naar hydrofobe Staat. De synthese van de peptiden kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in blaasjes met behulp van de "TX-TL" bacteriële cel extract11,18,19,20,21, die biedt alle benodigde componenten voor gekoppelde transcriptie-en vertaal reacties.

Het TX-TL-systeem werd samen ingekapseld, met de DNA-sjabloon die de Elp's codeert in ELP-blaasjes met behulp van uitdroging-rehydratatie van glas parels als een solide ondersteuning. De vorming van blaasjes gebeurt door rehydratatie van de gedroogde peptiden van het kraal oppervlak11. Andere methoden22 voor de vorming van blaasje kunnen worden gebruikt, die mogelijk een lagere polydispersiteit en grotere blaasje grootten vertonen (bijv. elektro vorming, emulsie faseoverdracht of microfluidics-gebaseerde methoden). Om de levensvatbaarheid van de inkapings methode te testen, kan een transcriptie van de fluorogene aptamer dBroccoli23 ook worden gebruikt11, wat minder complex is dan GENEXPRESSIE met het TX-TL-systeem.

Door de expressie van de membraan bouwstenen in vesiculo en hun daaropvolgende opname in het membraan, beginnen de blaasjes11te groeien. Membraan opname van de Elp's kan worden aangetoond door middel van een FRET assay. Daartoe worden de elp's die worden gebruikt voor de vorming van de initiële blaasje populatie geconjugeerd met fluorescerende kleurstoffen in gelijke delen die een fret paar vormen. Na expressie van niet-gelabelde Elp's in vesiculo en hun opname in het membraan, worden de gelabelde Elp's in het membraan verdund en bijgevolg daalt het FRET-signaal11. Als een veelzijdige en gemeenschappelijke methode voor conjugatie, koper gekatalyseerde azide-alkyne cycloadditie wordt gebruikt. Met het gebruik van een stabiliserende ligand zoals tris (benzyltriazolylmethyl)-amine, kan de reactie worden uitgevoerd in een waterige oplossing met een fysiologische pH zonder de hydrolyse van reactanten11, die geschikt is voor conjugatie reacties waarbij peptiden betrokken zijn.

Het volgende protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding op het kweken van peptidosomes op basis van ELP. De uitdrukking van de peptiden en vesikel vorming met behulp van de glas kralen methode wordt beschreven. Bovendien wordt beschreven hoe u de transcriptie van de fluor Gene dBroccoli aptamer en de transcriptie-Vertaal reactie voor eiwit expressie in de ELP-blaasjes implementeert. Tot slot is er een procedure voor de conjugatie van Elp's met fluoroforen, die kan worden gebruikt om de groei van de vesikel te bewijzen door middel van een FRET assay11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. expressie van Elastin-achtige polypeptiden

  1. Dag 1: voorbereiding van een starter cultuur en benodigdheden voor Peptide expressie
    1. Bereiding en autoclaaf expressie kweek kolven (4 x 2,5 L) en 3 L LB medium. Voeg voor 1 L LB medium 25 g LB poeder toe aan 1 L ultrazuiver water.
    2. Bereid een starter cultuur met 100 mL LB medium, 50 μL steriel-gefilterd (0,22 μm filter) chlooramfenicol oplossing (25 mg/mL in EtOH), en 50 μL steriel-gefilterd (0,22 μm filter) carbenicillin oplossing (100 mg/mL in 50% EtOH en 50% ultrapuur water).
    3. Voeg een kleine streep uit een vooraf gemaakte bacteriële kolf met E. coli stam BL21 (DE3) plyss met de pET20b (+) expressie vector codering van de polypeptide sequentie MGHGVGVP ((gegvp) 4(gvgvp))4((gfgvp)4(gvgvp))3 (Gfgvp)4GWP (afgekort als EF) naar een pre-warmed 100 ml starter cultuur en incuberen bij 37 °c gedurende 16 uur met 250 rpm in een schud incubator (E. coli stammen en vectoren zijn beschikbaar op aanvraag).
    4. Verwarm de Expression Culture-kolven en de LB-media bij 37 °C 's nachts, zodat ze voorbereid zijn op de volgende dag.
  2. Dag 2: eiwit expressie
    1. Voeg 750 mL LB medium toe aan elke expressie kweek kolf, 375 μL steriel-gefilterd (0,22 μm filter) chlooramfenicol voorraad (25 mg/mL in EtOH), en 375 μL steriel-gefilterd (0,22 μm filter) carbenicillin voorraad (100 mg/mL in 50% EtOH en 50% ultrapuur water).
    2. Neem na het schudden de antibiotica te verdelen 2 mL van de media als referentiemonster voor de optische dichtheidsmeting bij 600 nm (OD600).
    3. Voeg 7,5 mL van de start cultuur toe aan de uitdrukkings kolf en incuberen gedurende 1 uur bij 37 °C met 250 rpm.
    4. Na deze stap wordt elke 20 minuten de OD600 van elke kolf gecontroleerd.
    5. Wanneer de optische dichtheid ongeveer 0,8 bereikt, verlaagt u de temperatuur tot 16 °C en induceert u peptide expressie door 750 μL van 1 M steriele-gefilterde β-isopropylthiogalactoside (IPTG) in ultrapuur water in elke uitdrukkings kolf te voegen.
    6. Inbroed de uitdrukkings kolf met de geïnduceerde bacteriën bij 16 °C gedurende 16 uur met 250 rpm.
  3. Dag 3: extractie van de uitgesproken polypeptide
    1. Weeg de Centrifugeer kolf vooraf af om de massa van de celpellet na het oogsten te kunnen bepalen.
    2. Oogst alle bacteriën uit de uitdrukkings kolven door centrifugeren gedurende 20 minuten met een voorgekoelde centrifuge bij 4.000 x g en 4 °c.
    3. Giet het supernatant uit en DEP de centrifuge flessen op een steriele papieren handdoek.
    4. Weeg de Centrifugeer kolven af en bereken de celpellet massa.
    5. Respendeer de cellen, die zijn gepelleteerd uit 750 mL oorspronkelijke celkweek, in 15 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) door pipetteren en centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c. Giet het supernatant uit en DEP de centrifuge flessen op een steriele papieren handdoek.
    6. Respendeer de celpellet voor de lysisstap in 2 ml buffer per 1 gram celpellet met PBS (pH 7,4) aangevuld met lysozym (1 mg/ml), 1 mm fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 1 mm benzamidine en 0,5 U van DNase I.
    7. Soniceren de cellen voor verdere lysis op ijs met een sonicator op 8 W gedurende 9 minuten met afwisselend 10 s sonicatie en 20 s onderbroken stappen, gevolgd door een pauze van 9 minuten waarbij het monster op ijs moet worden gekoeld. Herhaal de 9 min ultrasoonapparaatstap nogmaals.
    8. Voeg 2 mL 10% (w/v) polyethyleenmine (PEI) toe per 1 L van de oorspronkelijke celcultuur voor de neerslag van nucleïnezuur.
    9. Verdeel het monster in 2 mL centrifugebuizen en incubeer gedurende 10 minuten bij 60 °C, gevolgd door een incubatie gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    10. Centrifugeer de oplossing bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en verzamel het supernatant dat de Elp bevat.
  4. Eiwit zuivering via inverse temperatuur fietsen:
    1. Pas de supernatant aan op een pH van 2 om het hydrofiele deel van de peptide te schakelen naar hydrofoob en aggregatie te induceren. Om de pH aan te passen, worden fosforzuur en natriumhydroxide gebruikt. pH-strepen volstaan om de pH-graad te bepalen.
    2. Om de opbrengst van de zuivering van het monster te verbeteren, verwarm het monster tot 60 °C en voeg natriumchloride toe tot 2 M.
    3. Vervolgens Centrifugeer het monster op 16.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    4. Gooi de supernatant weg en los de pellet opnieuw op in PBS (maar slechts de helft van het aanvankelijke volume wordt gebruikt in vergelijking met de vorige stap).
    5. Breng de pH op 7 met fosforzuur en natriumhydroxide. pH-strepen zijn voldoende nauwkeurig om de pH te bepalen.
    6. Centrifugeer het monster vervolgens op 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
    7. Verzamel de supernatant en herhaal stappen 1.4.1 – 1.4.6 tot 3x totaal, behalve dat in de laatste herhaling van stap 1.4.4, alleen water wordt toegevoegd in plaats van PBS.
    8. Meet de concentratie van de peptiden met een absorptie spectrometer. Gebruik een extinctiecoëfficiënt van 5500/M/cm bij 280 nm.
    9. Stel de concentratie van de ELP in op 700 μM.

2. Vesicle productie met behulp van de glas kralen methode

  1. Concentreer de ELP-oplossing op 1,1 mM met een centrifugale vacuümconcentrator.
  2. Meng 200 μL van de geconcentreerde ELP-oplossing met 1.250 μL van een 2:1 chloroform/methanol mengsel, gevolgd door vortexing.
  3. Voeg 1,5 g bolvormige glas parels (212 – 300 μm in grootte) toe aan een ronde bodem kolf van 10 mL.
  4. Voeg de oplossing met ELP en het chloroform/methanol mengsel toe aan de ronde bodem kolf en meng door zacht schudden.
  5. Sluit de kolf aan op een roterende verdamper. Stel de snelheid in op 150 rpm en regel de druk tot-0,2 x 105 PA (-200 mbar) gedurende ongeveer 4 minuten totdat de vloeistof bij kamertemperatuur is verdampt.
  6. Plaats de ronde bodem kolf gedurende ten minste 1 uur in een exsiccator om ervoor te zorgen dat de resterende chloroform en methanol worden verdampt. Om verlies van de glas kralen te voorkomen, moet losjes bevestigde aluminiumfolie worden gewikkeld rond de opening van de ronde bodem kolf.
  7. Meng voor een enkel experiment 100 mg van de met peptide bedekte glas parels met 60 μL van de zwellingen oplossing, zoals PBS. Inincuberen dit monster bij 25 °C gedurende 5 min.
  8. Centrifugeer het monster snel met een tafel-top centrifuge om de glas kralen te sediment.
  9. Gebruik een pipet om het supernatant te verzamelen dat de blaasjes bevat.

3. transcriptie van RNA Aptamer dBroccoli in de blaasjes

  1. Reinig de labbank met doekjes met een decontaminatieoplossing van RNase om een RNase-vrije werkomgeving te creëren.
  2. Meng de ssDNA (5 μM), bestaande uit de T7 promotor en de dBroccoli sequentie (GAGACGGTCGGGTCCATCTGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCAGATGTCGAGTAGAGTGTGGGCTC), naast de niet-Codeer bare streng (5 μM) in Nuclease-vrij water, aangevuld met RNAPol-reactiebuffer [40 mm tris-HCl (pH = 7,9), 6 mm MgCl2, 1 mm dithiotreïtol (DTT) en 2 mm spermidine], om de DNA-template voor de transcriptie reactie voor te bereiden.
  3. Inbroed de oplossing gedurende 5 minuten bij 90 °C, gevolgd door een langzame temperatuurverlaging tot 20 °C gedurende 30 minuten.
  4. Bereid een 1 mM (5Z)-5-(3, 5-difluoro-4-hydroxybenzylideen)-2, 3-dimethyl-3, 5-dihydro-4H-imidazol-4-One (DFHBI) oplossing door het oplossen van 1,26 mg DFHBI in 5 mL DMSO.
  5. Bereid de transcriptie reactie voor door de RNAPol-reactiebuffer te mengen [40 mm tris-HCl (pH = 7,9), 6 mm MgCl2, 1 mm dithiotreïtol (DTT) en 2 mm spermidine] met 125 mm KCl, 15 mm MgCl2, 4 mm rntp, 10 μM dfhbi, 200 nm DNA-template, 0,5 U/μL RNase remmer van Murine en water.
  6. Voeg, vlak voordat de reactie begint, 4 U/μL T7 polymerase toe.
  7. Gebruik deze reactiemix als de zwellingen oplossing in stap 2,7 en inbroed bij 37 °C gedurende de duur van het experiment, meestal 1 uur.

4. transcriptie-translatie (TX-TL) reactie

Opmerking: Voor de transcriptie-Vertaal reactie is een ruw celextract nodig, evenals een reactiebuffer en DNA. Het ruwe celextract wordt bereid zoals beschreven in zon et al.18. Voor een TX-TL-reactie gebruikt u het volgende: 33% (v/v) van het ruwe E. coli -extract, 42% (v/v)-reactiebuffer en 25% (v/v) fenol-chloroform gezuiverd DNA plus additieven. De uiteindelijke concentraties zijn ongeveer 9 mg/ml eiwit, 50 mm HEPES (pH = 8), 1,5 mm ATP, 1,5 mm GTP, 0,9 mm CtP, 0,9 mm UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mm co-enzym A, 0,33 mm nad, 0,75 mm kamp, 68 mm folinezuur acid, 1 mm spermidinerijk , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13,3 mM maltose, 1 U T7 RNA polymerase en 50 nM plasmide DNA in ultrapuur water.

  1. Fenol-chloroform zuivering van de DNA-template
    1. Bereid zes nachtelijke culturen met 5 mL LB medium en 5 μL steriel-gefilterd (0,22 μm filter) carbenicillin oplossing (100 mg/mL in 50% EtOH en 50% ultrazuiver water).
    2. Voeg een kleine streep toe van een vooraf gemaakte bacterie kolf met DH5α E. coli met de pET20b (+) expressie vector aan elke voorverwarmde 5 ml nachtelijke kweek en inincubate bij 37 °c gedurende 16 uur met 250 rpm. Afhankelijk van welke peptide (EF) of eiwit (YPet of mVenus) moet worden uitgedrukt, wordt een specifieke codering plasmide gebruikt.
    3. Extraheer het plasmide met een mini-prep Kit zoals beschreven in de gebruikershandleiding of door het protocol te volgen dat wordt geleverd door Zhang et al.24.
    4. Bereid 100 μL van het voorgezuiverde plasmide DNA (concentratie kan variëren van 200 – 600 ng/μL) en meng met 100 μL Roti-fenol/chloroform/Isoamylalcohol (pH = 7,5 – 8,0) in een micro centrifugebuis om een betere fasescheiding mogelijk te maken.
    5. Keer de buis voorzichtig om tot 6x en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 16.000 x g bij RT.
    6. Voeg 200 μL chloroform toe aan de bovenste fase van de buis en keer de buis om tot 6x.
    7. Centrifugeer het monster bij 16.000 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    8. Pipet de supernatant naar een aparte buis en voeg 10 μL van 3 M Natriumacetaat toe voor de neerslag van ethanol.
    9. Voeg 1 mL van-80 °C koude ethanol toe en bewaar het monster bij-80 °C gedurende 1 uur.
    10. Centrifugeer het monster bij 16.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c.
    11. Decanterende het supernatant en voeg 1 mL-20 °C koude 70% (v/v) ethanol toe.
    12. Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
    13. Verwijder de vloeistof door pipetten. Wees voorzichtig om de DNA-pellet niet te storen.
    14. Bewaar het monster op RT gedurende ongeveer 15 minuten om de resterende ethanol te verdampen.
    15. Voeg ultrapuur water toe aan het monster om de monsterconcentratie aan te passen tot ongeveer 300 nM, dat wordt gemeten door absorptie bij 260 nm.
  2. Bereiding van de TX-TL-reactie
    1. Het bereide ruwe celextract en de reactiebuffer op ijs ontdooien.
    2. Voeg voor een reactiemengsel van 60 μL het plasmide DNA (fenol-chloroform gezuiverde) toe aan 37,5 μL van de reactiebuffer [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM co-enzym A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM kamp, 68 mM folinezuur, 1 mM spermidine, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000 en 13,3 mM maltose), gevolgd door de toevoeging van 28,7 μL ruw celextract. Vul aan tot een eindvolume met ultrapuur water tot 58,8 μL.
    3. Voeg, vlak voordat de reactie begint, 1,2 μL van de T7 RNA polymerase oplossing toe en meng het monster door Pipetteer op en neer.
    4. Gebruik deze reactiemix als een zwellingen oplossing in stap 2,7 en inbroed bij 29 °C gedurende de duur van het experiment, meestal 4 – 8 uur.

5. conjugatie van Elastin-achtige polypeptiden met Fluoroforen via koper gekatalyseerde azide-alkyne Huisgen cycloadditie

  1. Bereid een 20 mM NHS-azide linker (γ-azidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester) oplossing in DMSO.
  2. Meng 250 μL van de ELP-oplossing (600 μM) met PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L na2HPO4, 0,27 g/l K2hpo4, pH = 7,2) en NHS-azide (1,2 mm) en incuberen gedurende 12 uur bij RT.
  3. Laad het monster in een 10 kDa dialyse cassette en bewaar het bij 4 °C gedurende 12 uur in 1 L ultrapuur water om de zouten en de residuele NHS-azide te verwijderen.
  4. Meng de geactiveerde ELP (500 μM) met de alkyne-geconjugeerde kleurstof (500 μM), Cy5-alkyne of Cy3-alkyne.
  5. Meng dit monster met 1 mM TBTA (tris (benzyltriazolylmethyl) amine), 10 mM TCEP (tris (2-carboxyethyl)-Fosfine hydrochloride) en 10 mM CuSO4 en incuberen bij 4 °c gedurende 12 uur.
  6. Laad het monster in een 10 kDa dialyse cassette en bewaar het bij 4 °C gedurende 12 uur in 1 L ultrapuur water, om de zouten en de residuele alkyne-geconjugeerde kleurstoffen te verwijderen.
  7. Deze kleurstof gemodificeerde Elp's worden gebruikt in een 1:1 mengsel van de Cy3 gelabeld ELPs en de Cy5 gelabeld Elp's analoog aan de peptiden in deel twee.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vesicle productie
Figuur 1 toont transmissie elektronenmicroscopie (TEM)-beelden van blaasjes, bereid met verschillende zwelling oplossingen en de glas kralen methode (Zie ook vogele et al.11). Voor het monster in Figuur 1awerd alleen PBS gebruikt als zwelling oplossing om de vorming van blaasjes te bewijzen en om hun grootte te bepalen. Toen TX-TL werd gebruikt als zwelling oplossing (Figuur 1b

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Film rehydratie is een veelgebruikte procedure voor het maken van kleine unilamellaire blaasjes. De belangrijkste bron van falen is de verkeerde omgang met de materialen die in de procedure worden gebruikt.

In eerste instantie worden de Elp's geproduceerd door E. coli cellen. De opbrengst na de zuivering van de ELP kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van hoe zorgvuldig het protocol wordt uitgevoerd tijdens de crucia...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Wij erkennen financiële steun via de DFG TRR 235 (opkomst van Life, project P15), de Europese Onderzoeksraad (subsidieovereenkomst nr. 694410 AEDNA) en de TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (project nr. 9,05) . Wij danken E. Falgenhauer voor haar hulp met monstervoorbereiding. We bedanken A. Dupin en M. Schwarz-Schilling voor hun hulp bij het TX-TL-systeem en nuttige discussies. Wij danken N. B. Holland voor nuttige discussies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2xYTMP biomedicals3012-032
3-PGASigma-AldrichP8877
5PRIME Phase Lock GelTM tubeVWR733-2478
alkine-conjugated Cy3Sigma-Aldrich777331
alkine-conjugated Cy5Sigma-Aldrich777358
ATPSigma-AldrichA8937
BenzamidinCarl RothCN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli strainNovagen71402
Bradford BSA Protein Assay KitBio-rad500-0201
cAMPSigma-AldrichA9501
CarbenicillinCarl Roth6344.2
ChloramphenicolSigma-AldrichC1919
ChloramphenicolCarl Roth3886.3
ChloroformCarl Roth4432.1
CoASigma-AldrichC4282
CTPUSB14121
CuSO4Carl RothP024.1
DFHBILucerna Technologies410
DMSOCarl RothA994.1
DNase INEBM0303S
DTTSigma-AldrichD0632
EthanolCarl Roth9065.2
Folinic acidSigma-AldrichF7878
Glass beads, acid-washedSigma-AldrichG1277
GTPUSB16800
HEPESSigma-AldrichH6147
IPTG (β-isopropyl thiogalactoside )Sigma-AldrichI6758
KClCarl RothP017.1
K-glutamateSigma-AldrichG1149
LB BrothCarl RothX968.2
LysozymeSigma-AldrichL6876
MethanolCarl Roth82.2
MgCl2Carl RothKK36.3
Mg-glutamateSigma-Aldrich49605
Micro Bio-Spin Chromatography ColumnsBio-Rad732-6204
NADSigma-AldrichN6522
NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)BaseclickBCL-033-5
PEG-8000Carl Roth263.2
pH stripesCarl Roth549.2
Phenylmethylsulfonyl fluorideCarl Roth6367.2
Phosphate-buffered salineVWR76180-684
Phosphoric acidSigma-AldrichW290017
PolyethyleneimineSigma-Aldrich408727
Potassium phosphate dibasic solutionSigma-AldrichP8584
Potassium phosphate monobasic solutionSigma-AldrichP8709
Qiagen Miniprep KitQiagen27106
RNAPol reaction bufferNEBB9012
RNase inhibitor murineNEBM0314S
RNaseZap WipesThermoFisherAM9788
rNTPNEBN0466S
Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcoholCarlrothA156.1
RTS Amino Acid Sampler5 Prime2401530
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)Thermo-Scientific66382
Sodium chlorideCarl Roth9265.1
Sodium hydroxideCarl Roth8655.1
SpermidineSigma-Aldrich85558
Sterile-filtered (0.22 µm filter)Carl RothXH76.1
T7 polymeraseNEBM0251S
TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)Sigma-Aldrich678937
TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)Sigma-AldrichC4706
Tris baseFischerBP1521
tRNA (from E. coli)Roche Applied ScienceMRE600
UTPUSB23160

Referenties

  1. Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
  2. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
  3. Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
  4. Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058(2016).
  5. Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
  7. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
  8. Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
  9. Chu, H. -S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
  10. Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
  11. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).
  12. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  13. McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
  14. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  15. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  16. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  17. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
  18. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  19. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  20. Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
  21. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
  22. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  23. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  24. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  25. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

PeptidevesikelsELP expressievesikelvormingdehydratie rehydratieglaskralenmethodedynamische lichtverstrooiingfluorescentieplaatlezerFRET assayRNA transcriptie
In Vesiculo synthese van peptide membraan precursoren voor autonome Vesicle groei
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.