Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Pan-myeloïde differentiatie van menselijk snoer bloed afgeleid CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen

9.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59836

⸱

9 augustus 2019

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor immunophenotypic karakterisering en cytokine geïnduceerde differentiatie van snoer bloed afgeleide CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen tot de vier myeloïde lijn. De toepassingen van dit protocol omvatten onderzoeken naar het effect van myeloïde ziekte mutaties of kleine moleculen op myeloïde differentiatie van de CD34+ cellen.

Samenvatting

Ex vivo differentiatie van menselijke hematopoietische stamcellen is een veel gebruikt model voor het bestuderen van hematopoiese. Het protocol dat hier wordt beschreven, is voor cytokine geïnduceerde differentiatie van CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen tot de vier myeloïde Lineage cellen. CD34+ cellen zijn geïsoleerd van humaan navelstreng bloed en co-gekweekt met MS-5 stromale cellen in de aanwezigheid van cytokines. Immunophenotypische karakterisering van de stam-en voorlopercellen, en de gedifferentieerde myeloïde Lineage cellen worden beschreven. Met behulp van dit protocol, kunnen CD34+ cellen worden geïnineerd met kleine moleculen of met lentivirussen worden weergegeven om myeloïde mutaties uit te drukken om hun impact op myeloïde differentiatie te onderzoeken.

Inleiding

Normale differentiatie van hematopoietische stamcellen (HSCs) is van cruciaal belang voor het behoud van fysiologische niveaus van alle bloedcellen. Tijdens de differentiatie, in een gecoördineerde reactie op extracellulaire signalen, waaronder groeifactoren en cytokines, geven hscs eerst aanleiding tot multipotente voorlopercellen (MPP) die LYMPHO-myeloïde potentiaal hebben1,2,3 ,4 (Figuur 1). Mpp's geven aanleiding tot gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMPs) en gemeenschappelijke lymfoïde voorlopercellen (Clp's) die afstamming-beperkt zijn. CLPs differentiëren in de lymfoïde lijn afstanden die bestaan uit B, T en Natural killer cellen. CMPs genereren de myeloïde lijn door twee beperktere voorlopercellen, Megakaryocyt erytroïde voorlopercellen (EP-leden) en granulocyt monocyt-voor ouders (GMPs). Europarlementsleden geven aanleiding tot megakaryocyten en erytrocyten, terwijl Gmp's aanleiding geven tot granulocyten en monoytes. Naast het ontstaan via CMPS, zijn er ook megakaryocyten gemeld om zich rechtstreeks te voordoen bij hscs of vroege mpp's via niet-canonieke trajecten5,6.

Hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) worden gekenmerkt door de oppervlakte marker CD34 en het ontbreken van Lineage specifieke markers (Lin-). Andere oppervlakte markeringen die vaak worden gebruikt om HSCs-en myeloïde voorlopercellen te onderscheiden, zijn onder andere CD38, CD45RA en CD1232 (Figuur 1). HSCs en MPPs zijn respectievelijk Lin-/Cd34+/cd38- en Lin-/cd34+/cd38+. Myeloïde gepleegde voorlopercellen worden gekenmerkt door de aanwezigheid of afwezigheid van CD45RA en CD123. CMPS zijn Lin-/cd34+/cd38+/cd45ra-/cd123lo, gmps zijn Lin-/cd34+/cd38+/cd45ra+/cd123lo, en Europarlementsleden zijn Lin-/cd34+ /Cd38+/Cd45ra-/cd123-.

De totale populatie van CD34+ stam-en voorlopercellen kan worden verkregen uit humaan navelstreng bloed (UCB), beenmerg en perifeer bloed. CD34+ cellen vormen 0,02% tot 1,46% van de totale mononucleaire cellen (mnc's) in menselijke UCB, terwijl hun percentage tussen 0,5% en 5,3% in het beenmerg varieert en veel lager is bij ~ 0,01% in perifeer bloed7,8,9 . Het proliferatieve vermogen en het differentiatie potentieel van CD34+ cellen van UCB is significant hoger dan die van het beenmerg of perifere bloedcellen1,10, waardoor een duidelijk voordeel wordt verkregen voor het verkrijgen van voldoende materiaal voor moleculaire analysen in combinatie met het uitvoeren van immunophenotypische en morfologische karakterisering van de cellen tijdens differentiatie.

Ex vivo differentiatie van navelstreng bloed afgeleid CD34+ hspcs is een breed toegepast model voor het onderzoeken van normale hematopoiese en hematopoietische ziekte mechanismen. Wanneer gekweekt met de juiste cytokines, kunnen de UCB CD34+ hspc's worden geïnduceerd om te differentiëren langs de myeloïde of lymfoïde lijn11,12,13,14,15 , 16. hier beschrijven we protocollen voor isolatie en immunophenotypische karakterisering van de CD34+ hspc's van menselijke UCB, en voor hun differentiatie aan myeloïde Lineage cellen. Dit cultuur systeem is gebaseerd op cytokine-geïnduceerde differentiatie van Hspc's in de aanwezigheid van MS-5 stromale cellen om de micro-omgeving in beenmerg na te bootsen. De cultuuromstandigheden veroorzaken een initiële expansie van de CD34+ cellen, gevolgd door hun differentiatie naar cellen die de markers voor de vier myeloïde Lineage cellen uitdrukken, namelijk granulocyten (CD66b), MONOCYTEN (CD14), megakaryocyten (CD41), en erytrocyten (CD235a). Toepassingen van de CD34+ Cell differentiatie protocol omvatten studies over moleculaire mechanismen reguleren van hematopoiese, en onderzoeken van de gevolgen van de myeloïde ziekte geassocieerde mutaties en kleine moleculen op zelf vernieuwing en differentiatie van Hspc's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Menselijke navelstreng bloed voor experimenten werd geschonken door gezonde individuen na geïnformeerde toestemming voor Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix. De gedeidentificeerde eenheden werden verkregen door middel van een overeenkomst inzake materiaaloverdracht tussen de MIHS en de Universiteit van Arizona.

1. reagentia en buffers

Opmerking: Bereid alle reagentia en buffers onder steriele omstandigheden in een biologische veiligheidskast voor.

  1. Bereid steriele PBS-BSA-EDTA (PBE) buffer door toevoeging van 7,2 mL steriel 35% runderserum albumine (BSA; gebruik steriele weefselkweek graad 35% BSA) en 5 mL steriel 0,5 M ethyleen diamine tetra azijnzuur (EDTA) tot 487,8 mL steriele Dulbecco's fosfaat gebufferd Saline (DPBS). Filter steriliseren en de-gas de buffer door het filter bevestigd aan vacuüm in een biologische veiligheidskast voor ten minste 2 h. aliquot de vergasste buffer in kleinere hoeveelheden (250 mL) en bewaren bij 4 °C.
  2. Bereid 1x Hanks gebalanceerde zoutoplossing (1x HBSS). Verdun 100 mL 10x HBSS voorraad in 900 mL steriel gedestilleerd water om 1 L 1x HBSS te maken en stel de pH in op 7,2. Filter steriliseren de 1x HBSS voor gebruik.
  3. Bereid 2% azijnzuur oplossing door 2 mL ijsazijn toe te voegen aan 98 mL gedistilleerd water.
  4. Bereid 20 ng/mL recombinant humaan fibronectine fragment oplossing in 1x PBS. Maak 10 mL per 48-goed bord.
  5. Bereid 2% BSA voor. Tot 100 mL 1x PBS, voeg 2 gram BSA fractie V. filter steriliseren voor gebruik.
  6. Maak complete Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) door toevoeging van het DMEM poeder, 3,7 GM natriumbicarbonaat, 100 mL foetaal serum (FBS) en 5 mL penicilline-streptomycine (PS) tot 800 mL steriel gedestilleerd water. Meng en maak het volume tot 1 L, en filter steriliseren voor gebruik.
  7. Bereid Vries medium voor door menging van 90 mL FBS en 10 mL steriel dimethylsulfoxide (DMSO).
  8. Bereid het stimulatie medium voor. Aan serumvrij medium, voeg L-glutamine toe aan 2 mM en cytokines tot een eindconcentratie van 50 ng/mL voor stamcel factor (SCF), trombopoëtine (TPO) en FMS-achtige tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) en 20 ng/mL voor interleukine-3 (IL3) (Zie tabel met materialen voor de bereiding van cytokine stockoplossingen). Maak 5 mL per 48-goed bord.
  9. Bereid 1x myeloïde differentiatie medium. Om DMEM te voltooien, voegt u cytokines toe aan een uiteindelijke concentratie van 5 ng/mL voor SCF, Flt3L en IL3, 50 ng/mL voor TPO en 4 eenheden/mL voor Erytropoëtine (EPO). Maak 5 mL per 48-goed bord.
  10. Bereid 2x myeloïde differentiatie medium. Om DMEM te voltooien, voegt u cytokines toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 ng/mL voor SCF, Flt3L en IL3, 100 ng/mL voor TPO en 8 eenheden/mL voor EPO. Maak 5 mL per 48-goed bord.
  11. Stroom cytometrie-buffer voorbereiden. Tot 1 L 1x PBS, voeg 10 g BSA fractie V toe.
  12. Bereid 1% Paraformaldehyde in 1x PBS (Zie tabel met materialen voor meer informatie).
  13. Bereid poly-L-lysine oplossing door toevoeging van 500 μL van 10 mg/mL poly-L-lysine aan 49,5 mL 1x PBS.

2. isolatie van mononucleaire cellen van navelstreng bloed

Opmerking: Voor het protocol dat hieronder wordt beschreven, werden snoer bloed volumes van 90 tot 100 mL gebruikt. De isolatie van CD34+ cellen moet onder steriele omstandigheden in een biologische veiligheidskast worden uitgevoerd.

  1. Spray de zak met UCB met 70% ethanol om het buitenoppervlak te steriliseren voordat u het in de biologische veiligheidskast invoert. Breng de UCB in een steriele 250 mL plastic fles en Verdun deze 1:1 door een gelijke hoeveelheid kamertemperatuur (RT) 1x HBSS toe te voegen.
  2. Verdeel 15 mL MNC-fractionering medium (MFM; Zie tabel van de materialen) per buis in ongeveer zes steriele 50 ml conische buizen. Kantel de buis met MFM en giet voorzichtig 30 mL verdund UCB op de MFM-laag zonder deze te storen.
  3. Centrifugeer de buizen op 400 x g gedurende 30 minuten bij RT met langzame acceleratie en geen rem.
  4. Na centrifugeren, aspireren tussen 15-20 mL van het plasma boven de MNC-laag. Verzamel de Mnc's voorzichtig met een pipet en breng deze over naar een nieuwe conische buis van 50 mL.
    Opmerking: MNCs storten als een witte Buffy laag op de interface van plasma en MFM, en de rode bloedcellen (Rbc's) sediment op de bodem van de conische buis.
  5. Pool Mnc's verzameld van 2-3 buizen samen. Maak het volume van elke buis tot 50 mL met koude PBE-buffer.
  6. Centrifugeer de buizen op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c, met de rem op laag.
  7. Zuig de supernatant op en tik zachtjes op de buis om de celpellet los te maken.
  8. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 5 mL ijskoude PBE buffer. Gebruik dezelfde 5 mL hersuspendeerde cellen om cellen van andere buisjes te verzamelen. Combineer cellen van 3 tot 4 tubes samen in 1 50 mL conische buis.
  9. Voor het verzamelen van alle overgebleven cellen, was alle buizen met 5 mL koude PBE buffer en voeg toe aan de 50 mL conische buis.
  10. Tel de Mnc's door 10 μL celsuspensie in 490 μL azijnzuur oplossing te verdunen.
    Opmerking: Het azijnzuur lyseert eventuele verontreinigingen om het tellen van Mnc's gemakkelijker te maken.
  11. Maak het volume van de celsuspensie tot 50 mL met ijskoude PBE buffer. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c, met rem op laag.
    Opmerking: De MNC-suspensie kan onmiddellijk worden verwerkt voor isolatie van CD34+ cellen of bevroren voor latere toepassingen.
  12. Om de Mnc's te bevriezen, verwijdert u de supernatant en resuspendeer deze met een dichtheid van 2 x 107 cellen/ml in Vries medium bij RT.
  13. Vries de cellen bij-80 °C 's nachts in een cel ijskoude container en breng ze vervolgens over naar vloeibaar stikstof.

3. isolatie van CD34+ cellen uit mononucleaire cellen

  1. Als u vers geïsoleerde Mnc's gebruikt, ga dan direct naar stap 3,3.
  2. Als u bevroren MNCs gebruikt, ontdooit u de bevroren cellen snel in een waterbad van 37 °C en zet u over op een conische buis van 50 mL. Verzamel alle overgebleven cellen in de flesjes met 1 mL ijskoude PBE buffer en breng over naar de 50 mL conische buis.
  3. Maak het volume van de MNC-suspensie tot 50 mL met koude PBE-buffer en centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
  4. Verwijder het supernatant en tik zachtjes op de buis om de celpellet los te maken. Resuspendeer de Mnc's naar 1 x 108 cellen in 300 μL IJSKOUDE PBE buffer.
  5. Voeg 100 μL FcR-blokkerende reagens toe van de magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS) humane CD34 microbead Kit per 1 x 108 mnc's en meng zachtjes.
    Opmerking: Dit blokkeert niet-specifieke binding aan de CD34 microbeads.
  6. Voeg 100 μL van de CD34 microbeads toe per 1 x 108 cellen. Meng zachtjes en inincuberen bij 4 °C gedurende 30 minuten in de koelkast. Niet inincuberen op ijs.
  7. Terwijl de cellen worden geïnbroed, plaats een LS-kolom en een pre-scheidingsfilter in het magnetisch veld van het MACS-scheidingsteken. Evenwicht van de kolom met ijskoude PBE buffer door toevoeging van 2 mL direct in kolom en 1 mL in het voorscheidings filter. Laat de kolom leeg in een conische buis van 15 mL en gooi de stroom door.
  8. Verwijder de Mnc's van 4 °C, voeg ijskoude PBE buffer toe om het volume op 15 mL te maken en centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c, met de rem op laag.
  9. Zuig de supernatant op en onderbreek de cellen opnieuw in 1 mL ijskoude PBE buffer.
  10. Voeg de celsuspensie toe aan het voorscheidings filter dat op de LS-kolom is geplaatst.
    Opmerking: Het filter vóór scheiding verwijdert alle grote celaggregaten die de kolom kunnen blokkeren.
  11. Spoel de buis af met 3 mL ijskoude PBE buffer en voeg deze toe aan een voorscheidings filter geplaatst op de LS kolom. Gooi daarna het voorscheidings filter weg.
  12. Was de LS-kolom vier keer door 3 mL ijskoude PBE-buffer toe te voegen, zodat de kolom elke keer kan worden afgevoerd.
    Opmerking: De CD34+ cellen blijven gebonden aan de kolom en de niet-gelabelde cellen stromen door de kolom.
  13. Na de laatste wasbeurt, verwijder de kolom van de MACS separator magnetisch veld en plaats het in een nieuwe 15 mL conische buis, weg van de magneet.
  14. Voeg 5 mL ijskoude PBE buffer toe aan de kolom en verwijder de afhankelijke CD34+ cellen door de zuiger stevig in te duwen.
  15. Geef desgewenst CD34+ cellen die zijn geïsoleerd uit de eerste kolom over een andere ls-kolom door met het filter vóór scheiding zoals hierboven beschreven (stappen 3.10 − 3.13).
  16. Tel de geïsoleerde CD34+ cellen met trypan Blue (10 μl cellen en 10 μl trypan Blue) om het totale aantal levende cellen te bepalen.
    Opmerking: In dit stadium kunnen de geïsoleerde CD34+ cellen worden bevroren voor later gebruik of kunnen ze rechtstreeks worden verwerkt voor analyse van Hspc's door Flowcytometrie (rubriek 4) of voor differentiatie aan myeloïde Lineage cellen (sectie 5).
  17. Centrifugeer de celsuspensie bij 600 x g gedurende 5 minuten bij RT, met rem op laag.
  18. Om de CD34+ cellen te bevriezen, aspireren de supernatant en re-opschorten tot 5 x 106 cellen in 1 ml Vries medium en bevriezen zoals hierboven beschreven (stap 2,13). Ga anders verder met sectie 4 of 5.

4. bepaling van stam-en voorlopercellen doorstroming Cytometrie

  1. Om de fracties van stam-en voorlopercellen in de vers geïsoleerde CD34+ hspc's te bepalen, centrifugeer ze gedurende 5 minuten op 600 x g en resuspendeer de 1 x 106 -cel in 50 μL van de Flowcytometrie buffer.
  2. Tot 1 x 106 CD34+ cellen, voeg antilichamen (Zie tabel van de materialen voor verdunningen) toe aan Lineage markers (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 en CD235A — alle geëtiketteerd), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-CY7), CD123 (APC) en 7- aminoactinomycine D (7-AAD; als een levende/dode vlek) en maak het totale volume tot 100 μL. Inbroed op ijs in het donker gedurende 20 minuten.
    Opmerking: Voor analyse kunnen minder dan 1 x 106 CD34+ cellen worden gebruikt. Als minder cellen worden gekleurd, moeten het totale volume en het volume van de toegevoegde antilichamen dienovereenkomstig worden verlaagd. Voor Flowcytometrie analyse moeten Onbevlekte en enkelvoudig bevlekte Mnc's worden gebruikt als controle voor het instellen van positieve en negatieve poorten voor elke fluorophore.
  3. Na incubatie, was de cellen met 1 mL Flowcytometrie buffer en centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten.
  4. Bevestig desgewenst de gekleurde cellen in 0,5 mL 1% Paraformaldehyde oplossing gedurende 10 minuten in het donker bij RT.
  5. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten en zuig het supernatant op.
  6. Was de vaste/bevlekt cellen met 1 mL flow cytometrie buffer en centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
  7. Zuig de supernatant op, onderbreek de cellen in 500 μL van de Flowcytometrie buffer en Analyseer deze met een flow-cytometer (tabel met materialen).

5. myeloïde differentiatie van de CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen

Opmerking: Om de CD34+ hspc's te differentiëren naar de myeloïde Lineage cellen, worden ze eerst gestimuleerd in recombinant humaan fibronectine fragment gecoate platen en vervolgens geseëeerd op een laag van MS-5 stromale cellen in myeloïde differentiatie medium. Differentiatie kan elke week gedurende 3 weken worden gemonitord op basis van de expressie van celoppervlak markeringen die specifiek zijn voor de vier myeloïde kilometerstanden. Tijdens stimulatie en differentiatie worden alle incubaties uitgevoerd bij 37 °C en 5% CO2 in een bevoficeerde kamer. Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.

  1. Mantel de putjes van een steriele ongecoate 48-Wells plaat door 200 μL/goed van recombinant humane fibronectine oplossing toe te voegen in 1x PBS voor 2 uur bij RT.
  2. Verwijder na 2 uur voorzichtig de recombinant humane fibronectine oplossing en gooi deze weg.
  3. Blokkeer de putjes met 200 μL/goed van 2% BSA gedurende 30 min bij RT.
  4. Zuig de BSA-oplossing op en was de putjes tweemaal met 500 μL steriele 1x PBS.
    Opmerking: Fibronectin fragment gecoate platen kunnen gedurende maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
  5. Om de CD34+ hspc's te stimuleren, moet u de vers geïsoleerde cellen (vanaf stap 3,17) opnieuw opschorten met een dichtheid van 1 x 105 cellen/200 μL of 5 x 105 cellen/ml warm 1x stimulatie medium.
  6. Als u bevroren CD34+ cellen gebruikt, moet u de cellen snel ontdooien en overbrengen naar een conische buis van 15 ml met warme, volledige DMEM. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten en onderbreek de cellen opnieuw zoals beschreven in stap 5,5.
  7. Plaat 200 μL van de CD34+ celsuspensie per put van het fibronectin fragment gecoat 48-goed bord en inbroed voor 48 h.
  8. Op de volgende dag, zaad 15.000 MS-5 stromale cellen in 200 μL volledige DMEM per put van een 48-goed weefselcultuur behandeld plaat en inincuberen bij 37 °C gedurende 24 uur.
  9. Na 48 h van stimulatie, verzamel de CD34+ cellen door voorzichtig pipetteren. Was de putjes met 500 μL warme DMEM en pool met de celsuspensie.
  10. Tel de cellen met trypan blauw. Centrifugeer de suspensie bij 600 x g gedurende 5 minuten en onderbreek deze opnieuw met een dichtheid van 5.000 cellen/200 μL 1x myeloïde differentiatie medium.
  11. Van de 48-put weefselcultuur plaat geseede met MS-5 stromale cellen, zachtjes aspireren het medium zonder verstoring van de cellen. Laag 200 μL (5.000 cellen) van de CD34+ celsuspensie per put van de plaat en inincuberen bij 37 °c.
    Opmerking: De cultuur van MS-5-cellen kan in volledige DMEM worden gehandhaafd. Op de dag dat de CD34+ cellen worden geseeid, moeten de MS-5 cellen zich in een uniforme laag bevinden (80-90% samenvloeiing). Het wordt aanbevolen dat de MS-5-cellen ten minste 24 uur vóór het zaaien van de CD34+ cellen worden geplateerd.  Als MS-5 cellen moeten worden verguld 48 h of 72 h voorafgaand aan het zaaien van de CD34+ cellen, moet de celdichtheid dienovereenkomstig worden aangepast. Het wordt ook aanbevolen om de perifere putjes van de 48-Wells plaat leeg te laten of gevuld te worden met 200 μL steriel water om randeffecten te voorkomen.
  12. Voer elke 3 − 4 dagen een halfgemiddelde verandering door voorzichtig 100 μL van het medium van de bovenkant van elk goed te verwijderen en deze te vervangen door 100 μL van 2x myeloïde differentiatie medium per put.
  13. Op dag 21, oogst de cellen voor analyse van myeloïde Lineage marker expressie door flow Cytometry. Zonder de MS-5-laag te verstoren, Pipetteer het medium voorzichtig en breng cellen over naar een 5 mL-buis.
    Opmerking: Voor kleuring en flow cytometrie analyse, cellen uit 1-2 putten volstaan. Differentiatie kan ook op de dagen 1, 7 en 14 worden gemonitord. Als immunophenootypering op meerdere dagen wordt uitgevoerd, moet het aantal putten dat nodig is voor analyse dienovereenkomstig worden berekend.
  14. Vlek 5 x 105 cellen met antilichamen tegen CD34 (APC-Cy7), CD66B (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (PerCP-CY 5.5) en CD235a (APC) in een totaal volume van 50 μL. inbroed op ijs in het donker gedurende 20 min. inclusief Onbevlekte en enkelvoudig gekleurde Mnc's als besturingselementen positieve en negatieve poorten voor elke fluorophore, en 7-AAD als een levende/dode vlek om dode cellen uit de analyse te elimineren.
  15. Was en repareer (optioneel) de bevlekte cellen zoals hierboven beschreven (stappen 4.3-4.6).
  16. Resuspendeer de cellen in 500 μL van de Flowcytometrie buffer en Analyseer deze met een flow cytometer.

6. beoordeling van cellulaire morfologie

  1. Reinig de Microscoop-dia's door ethanol te spuiten en af te vegen tot piepende.
  2. Dompel schoon dia's in poly-L-lysine oplossing voor 5 min bij RT en drogen voor 1 uur op RT.
  3. Resumeer de Hspc's uit stap 3,14 en gedifferentieerde cellen uit stap 5,13 in 10 μL flow cytometrie buffer.
  4. Breng de celsuspensie over naar de gecoate dia's en laat ze aan de lucht drogen.
    Opmerking: Dia's van dag 1 en dag 21 kunnen op RT worden opgeslagen en tegelijkertijd worden gekleurd.
  5. Giet 0,5 mL van de Wright-Giemsa vlek op de glijbaan en laat 3 min staan bij RT.
  6. Voeg gelijk volume gedeïoniseerd water toe en laat 10 minuten extra staan bij RT.
  7. Was de glijbaan in gedeïoniseerd water.
  8. Visualiseer bevlekte cellen met een vergroting van 60x of 100x door een microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Toepassing van de bovenstaande protocollen levert 5,6 (± 0,5) x 108 mncs en 1 (± 0,3) x 106 CD34+ cellen uit een snoer bloed eenheid van ~ 100 ml. Het percentage van de totale CD34+ cellen varieert tussen 80-90% (afbeelding 2A, B). Immunophenotypic analyse door de door Manz et al.5 beschreven regeling toont aan dat de CD34+ cellen doorgaans bestaan uit ~ 20% hscs en ~ 72% MPPs die Lin-/...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven protocol is geschikt voor ex-vivo-differentiatie van UCB afgeleide CD34+ hspc's tot de vier myeloïde lijn afstanden. De initiële incubatie met een cytokine mix bestaande uit SCF, TPO, Flt3L en IL3 stimuleert de CD34+ cellen. Vervolgens wordt differentiatie gerealiseerd met een cocktail van SCF, IL3, Flt3L, EPO en TPO. In deze mix zijn SCF, IL3 en Flt3L belangrijk voor overleving en proliferatie van CD34+ hscs. EPO en TPO bevorderen differentiatie ten opzichte van erytr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Wendy Barrett, Rachel Caballero en Gabriella Ruiz van Maricopa Integrated Health Systems voor de geïdentificeerde en gedoneerde koord bloed eenheden, Mrinalini Kala voor hulp met Flow cytometrie, en homoseksuele boeven en Christopher Seet voor advies over ex vivo myeloïde differentiatie. Dit werk werd gesteund door fondsen aan S.S. van de National Institutes of Health (R21CA170786 en R01GM127464) en de American Cancer Society (het institutioneel onderzoek Grant 74-001-34-IRG). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.4% Trypan blue solutionThermo Fisher Scientific15250-061Verdunn werkoplossing tot 0,2% in steriel 1x PBS
0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0Gibco 15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen14185052Verdunn tot 1x met steriel gedistilleerd water & pH naar 7.2
2.5% Trypsin, geen fenol roodThermo Fisher Scientific15090046Verdun werkoplossing tot 1x met steriel 1x PBS
30 µm Pre-separation filtersMiltenyi biotech130-041-407
35% steriele boviene serum albumineSigma-AldrichA7979
7-AADBiolegend420404Gebruikt als een live/dood kleurmiddel om dode cellen uit FACS-analyse te elimineren
Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a)Biolegend312207Gebruik 1:20 verdunning
Anti-human CD11b-FITC (geactiveerd) antibody (Clone CBRM1/5)Biolegend301403Gebruik 1:5 verdunning
Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6)Biolegend306012Gebruik 1:20 verdunning
Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2)Biolegend301806Gebruik 1:20 verdunning
Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7)BD Biosciences347543Gebruik 1:5 verdunning
Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2))BD Biosciences551336Gebruik 1:20 verdunning
Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2)Biolegend306609Gebruik 1:50 verdunning
Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581)Biolegend343514Gebruik 1:20 verdunning
Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2)Biolegend303506Gebruik 1:20 verdunning
Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1)Biolegend300405Gebruik 1:20 verdunning
Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8)Biolegend303720Gebruik 1:20 verdunning
Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100)Biolegend304126Gebruik 1:20 verdunning
Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5)Biolegend305116Gebruik 1:20 verdunning
Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7)Biolegend343103Gebruik 1:20 verdunning
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificBP231-100Filter steriliseer voor gebruik
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) poeder met L-Glutamine Gibco12100046Reconstitueer 1 zakje om 1 L DMEM-medium  te maken met natriumbicarbonaat, 10% FBS & 1% penicilline & streptomycine 
Fetaal bovien serum, Australische bron, hitte-inactiveringOmega ScientificFB-22 Lot #609716
Human CD34 microbead kit Miltenyi biotech130-046-702
Human Thrombopoietin (TPO), onderzoekskwaliteitMiltenyi biotech130-094-011Maak een voorraad van 100 µg/mL in 1x PBS + 0,1% BSA. Gebruik 50 ng/mL voor zowel myeloide differentiatie & stimulatiemedium
L-GlutamineOmega ScientificGS-602 mM concentratie in stimulatiemedium
LS ColumnsMiltenyi biotech130-042-401
MACS Multi standMiltenyi biotech130-042-303
MidiMACS magnetische scheiderMiltenyi biotech130-042-302
MNC fractioneringsmedium (Ficol-Paque PLUS)GE Healthcare Biosciences17-1440-03
MS-5 cellenGift van het laboratorium van Gay Crooks, UCLA
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Verwarm 800 mL van 1x PBS in een glazen beker op een roerplaat in een chemische kap tot ~65 °C. Voeg 10 g paraformaldehyde poeder toe. Om de paraformaldehyde volledig op te lossen, verhoog de pH door 1 N NaOH toe te voegen. Koel en filter de oplossing en maak het volume aan tot 1 L met 1x PBS. Pas de pH aan tot 7,2. 
Penicilline & StreptomycineSigma-AldrichP4458-100ml
Poly-L lysineSigma-AldrichP2636Maak een 10 mg/mL voorraad in 1x PBS
Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α)BioBasicRC213-15Maak een voorraad van 2.000 eenheden/mL in 1x PBS + 0,1% BSA. Gebruik 4 eenheden/mL voor myeloide differentiatie
Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin)Takara T100BGebruik 20 µg/mL verdund in steriele 1x PBS om putjes te coaten voorafgaand aan stimulatie van CD34+ HSCs.
Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L)BioBasicRC214-16Maak een voorraad van 100 µg/mL in 1x PBS + 0,1% BSA. Gebruik 5 ng/mL voor myeloide differentiatie & 50 ng/mL in stimulatiemedium
Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3)

Referenties

  1. Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
  2. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
  3. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
  4. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
  5. Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
  6. Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
  7. Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
  8. Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
  9. Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
  10. Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
  11. Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
  12. Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
  13. Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
  14. Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
  15. Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
  16. Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
  17. Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
  18. Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
  19. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420(2017).
  20. Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813(2011).
  21. Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
  22. Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
  23. Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789(2016).
  24. Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
  25. Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
  26. Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
  27. Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).
  28. Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CD34 positieve cellenisolatie uit navelstrengbloedflowcytometrie analysemagnetische geactiveerde cel sorteringco cultuur van stromale cellenimmunofenotypische karakteriseringhematopo tische stamcellenmarkers voor myelo de lineage
Pan-myeloïde differentiatie van menselijk snoer bloed afgeleid CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.