Vergelijkende laesies analyse door middel van een gerichte sequentie benadering

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een methode voor het identificeren van klonale en subclonale veranderingen tussen verschillende specimens van een bepaalde patiënt. Hoewel de hier beschreven experimenten gericht zijn op een specifiek tumor type, is de aanpak algemeen toepasbaar op andere vaste tumoren.

Samenvatting

Beoordeling van intra-tumorele heterogeniteit (ITH) is van het allergrootste belang om te anticiperen op falen van gerichte therapieën en het ontwerp dienovereenkomstig effectieve anti-tumor strategieën. Hoewel bezorgdheid vaak wordt opgeworpen als gevolg van verschillen in monsterverwerking en diepte van dekking, de volgende generatie sequencing van solide tumoren hebben ontrafeld een zeer variabele mate van ITH over tumortypen. Het vastleggen van de genetische verwantschap tussen primaire en gemetastaseerde laesies door de identificatie van klonale en subklonale populaties is van cruciaal belang voor het ontwerp van therapieën voor aandoeningen aan de voor fase. Hier rapporteren we een methode voor vergelijkende laesies analyse die de identificatie van klonale en subklonale populaties tussen verschillende specimens van dezelfde patiënt mogelijk maakt. De hier beschreven experimentele aanpak integreert drie gevestigde benaderingen: histologische analyse, High-coverage multi-Lesion sequencing, en immunophenotypic analyses. Om de effecten op de detectie van subklonale gebeurtenissen te minimaliseren door ongepaste monsterverwerking, hebben we weefsels onderworpen aan zorgvuldig pathologisch onderzoek en neoplastische celverrijking. Op kwaliteit gecontroleerd DNA van neoplastische laesies en normale weefsels werd vervolgens onderworpen aan een hoge dekkings volgorde, gericht op de codeer gebieden van 409 relevante kanker genen. Terwijl we alleen naar een beperkte genomische ruimte kijken, maakt onze aanpak het mogelijk om de mate van heterogeniteit te evalueren bij somatische veranderingen (single-nucleotide mutaties en Copy-Number variaties) in verschillende laesies van een bepaalde patiënt. Door middel van vergelijkende analyse van sequentie gegevens konden we klonale versus subklonale wijzigingen onderscheiden. De meerderheid van ITH wordt vaak toegeschreven aan passagiers mutaties; Daarom gebruikten we ook immunohistochemie om functionele gevolgen van mutaties te voorspellen. Hoewel dit protocol is toegepast op een specifiek tumor type, verwachten we dat de hier beschreven methodologie algemeen toepasbaar is op andere vaste tumortypen.

Inleiding

De opkomst van Next generation sequencing (NGS) heeft een revolutie teweeggebracht in de manier waarop kanker wordt gediagnosticeerd en behandeld¹. NGS gekoppeld aan multiregionale sequencing hebben blootgesteld een hoge mate van intra-tumorele heterogeniteit (ITH) in vaste tumoren², die verklaart deels het falen van gerichte therapie als gevolg van de aanwezigheid van subklonen met verschillende geneesmiddel gevoeligheid² . Een belangrijke uitdaging van genoom-brede sequentie studies is de noodzaak om onderscheid te maken tussen passagier (d.w.z. neutraal) en bestuurders mutaties in individuele kankers³. Verschillende studies hebben inderdaad aangetoond dat, in bepaalde tumoren, passagiers mutaties rekening voor de meerderheid van ITH, terwijl de wijzigingen van de bestuurder neiging om te worden bewaard tussen laesies van dezelfde persoon⁴. Het is ook belangrijk op te merken dat grote mutationele last (zoals te zien in longkanker en melanoom) niet noodzakelijkerwijs een grote subklonale mutationele last²impliceert. Daarom kan een hoge mate van ITH worden gevonden in tumoren met een lage mutationele Last.

Metastasen zijn verantwoordelijk voor meer dan 90% van de kanker-gerelateerde dood wereldwijd⁵; Daarom is het vastleggen van de mutationele heterogeniteit van de bestuurders genen bij primaire en gemetastaseerde laesies van cruciaal belang voor het ontwerpen van effectieve therapieën voor gevorderde-fase ziekten. Klinische sequentie wordt over het algemeen uitgevoerd op nucleïnezuren uit vaste weefsels, waardoor genoom verkenning moeilijk is vanwege de slechte DNA-kwaliteit. Aan de andere kant is de intentie van klinische sequencing om bruikbare mutaties en/of mutaties te identificeren die de responsiviteit/onresponsiviteit op een bepaald therapeutisch regime kunnen voorspellen. In de huidige stand kan sequentiëren worden beperkt tot een kleinere fractie van het genoom voortijdige extractie van klinisch relevante informatie. De overgang van DNA-profilering met een lage doorvoer (bijvoorbeeld Sanger-sequencing) naar NGS heeft het mogelijk gemaakt om honderden kankerrelevante genen te analyseren op een hoge dekkingsgraad, waardoor de detectie van subklonale gebeurtenissen mogelijk is. Hier rapporteren we een methode voor vergelijkende laesies analyse die de identificatie van klonale en subklonale populaties tussen verschillende specimens van dezelfde persoon mogelijk maakt. De hier beschreven methode integreert drie gevestigde benaderingen (histologische analyse, High-coverage multi-Lesion sequencing en immunophenotypic analyses) om functionele gevolgen van de geïdentificeerde variaties te voorspellen. De aanpak wordt schematisch beschreven in Figuur 1 en is toegepast op de studie van 5 gemetastaseerde gevallen van vaste pseudopapillaire Neoplasmata (spn's) van de alvleesklier. Terwijl we de verwerking en analyse beschrijven van formalin-vaste paraffine-ingesloten (FFPE) weefsel specimens, kan dezelfde procedure worden toegepast op genetisch materiaal uit vers bevroren weefsel.

Protocol

Het materiaal dat in de studie werd gebruikt, werd verzameld onder een specifiek protocol, dat door de lokale ethische commissie werd goedgekeurd. Schriftelijke geïnformeerde toestemming van alle patiënten was beschikbaar.

1. histologische en immunofenotypische herziening van weefsel specimens

Opmerking: een deskundige patholoog is verantwoordelijk voor de hierna beschreven activiteiten.

1. Histopathologische herziening van geselecteerde gevallen volgens gevestigde diagnostische criteria.
   1. Gebruik de microtoom om 4 − 5 μm dikke weefsel secties te knippen van representatieve FFPE weefsel blokken en monteer de secties op standaard histologische dia's.
   2. Voer HEMA oxylin en eosine kleuring uit voor elke dia met behulp van een geautomatiseerde tissue Slide Stainer (tabel met materialen).
   3. Bekijk de histopathologische diagnose van de geselecteerde tumor gevallen volgens de diagnostische criteria van de WHO.
      Opmerking: in dit stadium kan de patholoog morfologisch verschillende delen van de tumor binnen dezelfde weefsel sectie identificeren. Het is mogelijk om die gebieden afzonderlijk te oogsten (zie rubriek 2). Histologische gelijkenis van tumor en normale cellen voor Spn's is te vinden in Figuur 2.
   4. Voer immunohistochemische kleuring uit voor gevestigde markers ter aanvulling van histologische analyse en schatting van immunophenotypische heterogeniteit.
      Opmerking: de patholoog kan immunofenotypisch afzonderlijke delen van de tumor binnen dezelfde weefsel sectie identificeren. Het is mogelijk om die gebieden afzonderlijk te oogsten (zie rubriek 2).
2. Evalueer neoplastische cellulariteit van de tumorweefsel sectie en plan handmatige microdissectie dienovereenkomstig.
   Opmerking: dit is een patholoog-gegenereerde schatting van tumor cellulariteit.
   1. Als de neoplastische celinhoud van de weefsel sectie hoger is dan 70%, is handmatige microdissectie niet verplicht; Ga rechtstreeks naar stap 3,1.
      Opmerking: Streef naar 70% van de neoplastische celinhoud om (i) te zorgen voor voldoende gevoeligheid voor gemuteerde allel-frequentie schattingen en (II) om eventueel klonale mutaties te valideren door minder gevoelige methodologieën (bijv. capillaire sequencing).
   2. Als de neoplastische celinhoud van de weefsel sectie lager is dan 70%, is microdissection noodzakelijk en gaat u naar stap 2.
3. Evalueer weefsel secties van het FFPE-blok waar niet-neoplastisch weefsel is bemonsterd. Dit weefsel wordt gebruikt als een bron van kiembaan DNA.
   Opmerking: bloed is een alternatieve bron van kiembaan DNA. In dit geval gaat u verder met DNA-extractie zoals aanbevolen in de nota van stap 4,1.
   1. Als alleen niet-neoplastisch weefsel zichtbaar is in de weefsel sectie (figuur 2D), is handmatige microdissectie niet nodig; Ga rechtstreeks naar stap 3,1.
   2. Als er substantiële verontreiniging van neoplastische cellen aanwezig is in de weefsel sectie, dan is handmatige microdissectie noodzakelijk; Ga naar sectie 2.

2. handmatige microdissectie

Opmerking: deze methode is van toepassing op verschillende soorten vaste tumor, en het is bedoeld om het gehalte aan neoplastische cellen van weefsel specimens te verhogen. Als alternatief kan deze methode worden gebruikt om morfologisch en/of immunofenotypisch afzonderlijke gebieden binnen dezelfde weefsel sectie te oogsten.

1. Gebruik een microtoom, snijd tot tien 4 − 6 μm dikke FFPE tumorweefsel secties en monteer ze op onopgeladen glijbanen.
   Opmerking: als er slechts één 1 mm² nest van kankers cellen in het preparaat zichtbaar is, moeten 10 weefsel glaasjes worden gesneden en onderworpen aan handmatige microdissectie om de beoogde hoeveelheid DNA te verkrijgen (40 ng); Dit ervan uitgaande dat 1 mm² cluster tussen 700 en 1000 tumor kernen bevat.
2. Incubate glaasjes bij 60 °C gedurende 10 min.
3. Plaats de dia's in een rek en voer de volgende wassingen uit: xyleen gedurende 20 min, 100% ethanol gedurende 10 min, 80% ethanol gedurende 10 min, 70% ethanol gedurende 10 min, gedistilleerd water gedurende 1 minuut, hematoxyline-tegen werk voor 10 sec., kraanwater gedurende 1 minuut.
4. Op een standaard omgekeerde Microscoop, gebruik een 27 G naald op een spuit als de microdissection tool en verzamelen representatieve clusters van tumorcellen. Oogst minimaal tien 1 mm² clusters cellen om de vereiste hoeveelheid DNA voor sequentiëren te garanderen.
   Opmerking: als morfologisch verschillende gebieden zijn bedoeld om te worden geanalyseerd als verschillende entiteiten, gebruik dan de microdissection tool om die gebieden afzonderlijk te oogsten.
5. Plaats geoogste clusters in 1,5 mL buisjes (tabel met materialen) die eerder zijn gevuld met 20 μl protease K en 180 μl lysisbuffer (tabel van de materialen, beide opgenomen in de DNA-extractie Kit) en meng door vortexing.

3. verwerking van weefsels zonder voorafgaande microdissectie

Opmerking: deze procedure wordt gebruikt voor weefsel blokken die alleen niet-neoplastische cellen (bron van kiembaan-DNA) bevatten of ten minste 70% van de morfologisch homogene kankercellen bevatten.

1. Met behulp van een microtoom geknipt tot zes 4 − 5 μm dikke weefsel secties van geselecteerde FFPE weefsel blokken. Plaats weefsel schuift in 1,5 mL buizen zoals beschreven in stap 2,5.

4. DNA-extractie uit normale en neoplastische cellen

1. Zuiver DNA van normaal en neoplastisch weefsel met behulp van de DNA FFPE weefsel extractie Kit (tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
   Opmerking: wanneer bloed wordt gebruikt als bron van nucleïnezuur van kiembaan, zuiver DNA met behulp van een DNA bloed extractie Kit (tabel van materialen).
2. DNA-kwantificering en kwaliteitscontrole
   1. Om de hoeveelheid dubbel gestrande (dsDNA) te kwantificeren, voegt u een aliquot van het DNA-monster toe aan een oplossing die een fluorescerende nucleïnezuur vlek (tabel met materialen) bevat en meet de fluorescentie met behulp van een tafel-fluor meter (tabel met materialen ).
      Opmerking: de bepaling meet de intensiteit van het fluorescerende signaal dat wordt afgegeven door fluorescerende kleurstoffen die aan dsDNA zijn bevestigd en bepaalt de hoeveelheid DNA met behulp van een standaard curve.
   2. Gebruik een microvolume spectrofotometer (tabel met materialen) om de verhouding 260/280 en 260/230 van het monster te meten om DNA te kwalificeren. "Zuiver" DNA moet een 260/280 van 1,8 en een 260/230 in het bereik van 1.8 − 2.2 hebben.
      Opmerking: spectrofotometrische evaluatie van het monster is bedoeld om de aanwezigheid van chemische verontreinigingen (bv. fenol) te bewijzen die van invloed zijn op de downstreamreacties. In geval van verontreiniging door chemische reagentia voert u een opruimings stap uit met behulp van een op een kolom gebaseerde Kit.

5. voorbereiding en kwantificering van de bibliotheek

Opmerking: het schematische stroomschema van de voorbereiding van de bibliotheek en de kwantificerings stappen wordt gerapporteerd in Figuur 3.

1. DNA-bibliotheek voorbereiding (4 primer Pools voor elk monster ingesteld)
   Let op: de 4 primer Pools behoren tot het kanker panel gerapporteerd inTabel met materialen. Elke pool bevat primer paren die zijn ontworpen voor een multiplexed target selectie van 409 genen. Een link naar de lijst van genen die het NGS-paneel componeren isTabel met materialen.
   1. Bereid vier DNA-doel versterkings reacties voor elk monster, één per primer pool. Voeg voor elke primer pool (tabel met materialen) een tube van 0,2 ml (tabel metmaterialen) toe: 4 ΜL Master Mix (tabel metmaterialen, opgenomen in de Bibliotheekset), 10 μL High Fidelity primer pool mix (tabel metmaterialen, opgenomen in de kanker panel Library) en 6 μL DNA (10 ng totaal).
   2. Versterk de doelgebieden van elke primer pool afzonderlijk in vier 1,5 mL tubes met het volgende programma: vasthouden bij 99 °C gedurende 2 min (activering van de Hot-start polymerase), 16 cycli (denature bij 99 °C gedurende 15 s, anneal en verlengen bij 60 °C gedurende 8 minuten) , vasthouden bij 4 °C.
      Opmerking: stoppunt. Bewaar target versterkings reacties bij 4 °C 's nachts of bij-20 °C gedurende langere tijd.
   3. Gedeeltelijke vertering van amplicons eindigt
      Opmerking: de handleiding van de NGS-constructeur Kit voorziet in een stap waarin de verschillende versterkings reacties van elk monster worden gecombineerd vóór gedeeltelijke spijsvertering. Vermijd die stap en blijf elke amplificatie vertering afzonderlijk verwerken.
      1. Voeg aan elke versterkte pool van elk monster 2 μL specifiek verterings mengsel (tabel met materialen, opgenomen in de bibliotheekset) toe (het totale volume van elke buis van 0,2 ml is 22 μL). Vortex grondig en centrifugeer elke buis om druppels te verzamelen.
      2. Laad de buizen in de thermische cycler en voer het volgende programma uit: 50 °C gedurende 10 min, 55 °C gedurende 10 min, 60 °C gedurende 20 min, 10 °C (voor maximaal 1 uur).
         Opmerking: stoppunt. Bewaar plaat bij-20 °C gedurende langere periodes.
   4. Ligate adapters voor amplicons en zuiveren.
      Opmerking: gebruik een andere barcode adapter voor elk sample bij het sequentiëren van meerdere bibliotheken op een enkele chip. Alle vier de versterkings reacties van hetzelfde monster moeten dezelfde streepjescode ontvangen.
      1. Voorbereiden van adapters (tabel van materialen, barcodes adapters Kit). Voor elke streepjescode X bereidt u een combinatie van P1-adapter en unieke barcode adapters (tabel met materialen) voor bij een uiteindelijke verdunning van 1:4. Meng 4 μL water met 2 μL P1-adapter en 2 μL unieke barcode adapters. Gebruik 2 μL van deze barcode adaptermix voor downstreampassages.
      2. Voer de ligatie reactie door toe te voegen aan elke versterkte pool van elk monster in deze volgorde: 4 μL switchoplossing (tabel van de materialen, opgenomen in de bibliotheekset), 2 μl barcode adaptermix en 2 μl DNA ligase (Inhoudsopgave, inbegrepen in de Library Kit) (totaal volume = 30 μL).
      3. Vortex grondig en centrifugeer kort om druppels te verzamelen.
      4. Laad elke buis in de thermische cycler en voer het volgende programma uit: 22 °C gedurende 30 min, 68 °C gedurende 5 min, 72 °C gedurende 5 min, 4 °C (voor maximaal 24 uur).
         Opmerking: stoppunt. Bewaar plaat bij-20 °C gedurende langere periodes.
   5. Bibliotheek zuivering en-versterking
      1. Centrifugeer elke buis en breng vervolgens elk gebarcoded monster over in een buis van 1,5 mL. Voeg 45 μL op parels gebaseerde zuiverings reagens (tabel met materialen) toe aan elke pool van elk monster. Pipet op en neer 5x om de kraal suspensie te mengen met het DNA.
      2. Inbroed het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT), plaats vervolgens elke buis in een magnetisch rek en incuberen gedurende 2 min. Verwijder en gooi de supernatant voorzichtig weg zonder de pellet te storen.
      3. Voeg in elke Tube 150 μL verse 70% ethanol toe. Was de parels die elke buis aan de zijkant van de twee posities van de magneet bewegen. Gooi de supernatant weg en Let op dat je de pellet niet verstoort.
      4. Herhaal de procedures beschreven in stap 5.1.5.3 en houd de buizen in de magneet en lucht-droog de parels bij RT gedurende 5 minuten.
      5. Verwijder buisjes met gezuiverde bibliotheken van elke primer pool van de magneet en voeg 50 μL High-Fidelity PCR mix (tafel van de materialen) en 2 μL Library Amplification primer mix (tabel met materialen, opgenomen in de bibliotheekset) toe aan de kralen pellet van elke buis.
      6. Vortex elke 1,5 mL buis en kort Centrifugeer om druppels te verzamelen.
      7. Plaats 1,5 mL buisjes in de magneet gedurende 2 minuten en breng voorzichtig het supernatant (~ 50 μL) van elke buis over naar een nieuwe 0,2 mL Tube zonder de pellet te storen.
      8. Amplify bibliotheken van elke primer pool met het volgende programma: Houd bij 98 °C gedurende 2 minuten om het enzym te activeren, 5 cycli (denature bij 98 °C gedurende 15 s, anneal en strek bij 64 °C 1 min), vasthouden bij 4 °C. Bewaar voorbeelden bij-20 °C.
   6. Zuivering van versterkte bibliotheek
      1. Centrifugeer elke buis om de inhoud onderaan te verzamelen en breng elk versterkt bibliotheek monster over naar een buis van 1,5 mL.
      2. Voeg 25 μL op parels gebaseerde zuiverings reagens toe. Pipet op en neer 5x om de kraal suspensie te mengen met het DNA.
      3. Inbroed het mengsel gedurende 5 minuten bij RT, en plaats vervolgens de buisjes in de magneet gedurende 5 minuten.
      4. Breng het supernatant voorzichtig over, dat de amplicons bevat, van elke buis naar nieuwe buizen zonder de pellet te storen.
      5. Voeg 60 μL op parels gebaseerde zuiverings reagens toe aan de supernatant van elke buis en pipet op en neer om de kraal suspensie en het DNA te mengen.
      6. Inbroed het mengsel gedurende 5 min bij RT en plaats de buisjes in de magneet voor 3 min.
      7. Gooi het supernatant van elke tube weg en Let op dat je de pellet niet verstoort.
         Let op: de amplicons zijn gebonden aan de parels.
      8. Voeg in elke Tube 150 μL verse 70% ethanol toe. Was de kralen in de twee standen van de magneet om de buizen van de zijkant naar de zijkant te bewegen. Gooi de supernatant weg en Let op dat je de pellet niet verstoort.
      9. Herhaal de procedure in stap 5.1.6.8 en lucht droog de parels bij RT gedurende 3 min. Vermijd overmatig drogen van de kralen.
      10. Verwijder de buisjes van de magneet en voeg 50 μL lage tris EDTA (TE) (tabel met materialen, opgenomen in de bibliotheekset) toe aan de pellet om de kralen te dispergeren.
      11. Pipet teren van het mengsel meerdere malen op en neer en incuberen bij RT gedurende 2 minuten.
      12. Plaats de buizen in de magneet voor ten minste 2 min en voorzichtig overbrengen van de supernatant, die de amplicons bevat, nieuwe buizen zonder verstoring van de kralen.
2. Kwantificering van de bibliotheek
   1. Gebruik een fragment analyse-instrument (tabel met materialen) om een DNA-chip uit te voeren volgens het hoge gevoeligheids Protocol van de DNA-Kit.

6. bibliotheken groeperen en sequentiëren uitvoeren

1. Verdun elke wisselaar tot 100 pM met Nuclease-vrij water. Combineer 10 μL van elke 100 pM-bibliotheken voor een enkele hardloopsessie in een enkele buis. Meng de gecombineerde bibliotheken door te pipetteren en door te gaan met het templates en sequentiëren.
2. Gepland uitvoeren maken
   Opmerking: een typische run bevat vier samples die kunnen worden geladen op twee verschillende soorten halfgeleider chip (Ion PI chip of Ion 540 chip) op basis van de sequencer beschikbaar in het laboratorium (Ion Proton systeem of GeneStudio S5 systeem, tabel van de materialen). Deze systemen produceren meestal 80.000.000 leesbewerkingen per run.
   1. Open de torrent-browser op een computer die is aangesloten op het volgorde systeem (bijv. ion chef-systeem) en plan een nieuwe uitvoering met behulp van de algemene sjabloon voor de geselecteerde toepassing (AmpliSeqDNA).
   2. Schakel over naar het tabblad kits van het plan. Selecteer Ion Proton System of Ion genestudio S5 systeem uit de instrument dropdown lijst op basis van de sequencing systeem wordt gebruikt.
   3. Afhankelijk van het volgorde systeem, selecteert u de juiste chip (PI-chip voor Ion Proton systemen; 540-chip voor Ion GeneStudio S5-systemen) uit de keuzelijst met chip typen .
   4. Selecteer Ion AmpliSeq 2,0 Library Kit in de vervolgkeuzelijst Library Kit .
   5. Selecteer de Ion chef knop voor template Kit, selecteer vervolgens de juiste chef Kit (Ion Pi Hi-Q chef Kit voor PI chip of Ion 540 Kit-chef voor 540 chip) uit de sjabloon Kit vervolgkeuzelijst.
   6. Selecteer de juiste sequencing Kit (Ion PI Hi-Q sequencing 200 Kit voor PI-chip of Ion S5 sequencing Kit voor 540 chip) uit de Sequentiëren Kit vervolgkeuzelijst, selecteer vervolgens Ionxpress van de streepjescode instellen vervolgkeuzelijst.
   7. Schakel over naar het tabblad plugin en selecteer de plugin voor dekkingsanalyse .
   8. Schakel over naar het tabblad plan. Selecteer het GRCh37/hg19 genoom in de vervolgkeuzelijst referentie bibliotheek. Selecteer in de vervolgkeuzelijst doelregio's het juiste deelvenster dat moet worden gesequentieerd.
   9. Stel het aantal streepjescodes in dat moet worden gesequentieerd en het label van de buisjes voor de bibliotheek in de juiste velden.
   10. Stel de streepjescode naam en de voorbeeld naam in voor elke bibliotheek.
3. Monster bibliotheken verdunning en laden.
   1. Verdun de voorraad bibliotheek met Nuclease-vrij water tot 25 pM voor PI-chip of 32 pM voor 540-chip.
   2. Pipet keer 50 μL van elke verdunde wisselaar naar de onderzijde van de juiste bibliotheek monsterbuis.
   3. Schakel het volgorde systeem in en volg de instructies op het scherm om alle vereiste reagentia te laden en het uitvoeringsplan te importeren.
   4. Laad de bibliotheek sample tube met de gepoolde bibliotheken en start het van klonen Amplification programma.
      Let op: het ion chef-systeem vereist twee chips voorbereid per run.
4. Sequencing op Ion proton of Ion GeneStudio S5.
   1. Schakel het volgorde systeem in en volg de instructies op het scherm om de volgorde te initialiseren en het uitvoeringsplan te importeren.
   2. Laad de volgorde-chip na het verwijderen uit het volgorde systeem.
      Opmerking: Wees geaard voordat u een chip ophaalt om spaan beschadiging door elektrostatische ontlading te voorkomen. Spaan verwerking/positionering samen met voorbeelden van succesvolle/mislukte belasting worden gerapporteerd in Figuur 4.
   3. Sluit het deksel van het spaan compartiment en wacht tot het pictogram van de chip status "Ready" aangeeft.
   4. Leeg de afvalbak wanneer de eerste uitvoering is voltooid en volg de resterende chip zo snel mogelijk.

7. mutaties en kopie-nummer variaties (Cnv's) analyse

Opmerking: de uitlijning van sequentiegegevens naar het menselijk referentie genoom van de GRCh37/hg19 wordt automatisch uitgevoerd eenmaal ingesteld in het plan (stap 6.2.8).

1. Gebruik de invoegtoepassing dekkingsanalyse (tabel met materialen) om de diepte van de dekking en uniformiteit te controleren.
2. Voer de variant aanroepen met behulp van de torrent variant beller plug-in (tabel met materialen), selecteren van de kiembaan of somatische werkstroom indien van toepassing.
3. Download bestanden van de variant Call Format (VCF) van gefilterde varianten. Annoteren varianten met behulp van de variant effect Predictor (VEP) software⁶ en de NCBI refseq database.
4. Load sequentie gegevens op de Ion reporter software met behulp van de Ion reporter Uploader plugin en gebruik de uitgebreide kanker panel tumor-normale paar werkstroom om de gegevens te analyseren om cnv's te schatten.
5. Filter mutaties en Cnv's handmatig op basis van de door de software toegewezen scores en verifieer ze visueel met de Integrative Genomics Viewer (IGV)⁷.
   1. Inspecteer visueel de uitlijning op ongebruikelijke leesbewerkingen (bijvoorbeeld door het afknippen van het voorkomen, overamplificatie of leest) die artefeitelijke oproepen kunnen genereren.
   2. Verifieer Cnv's door de genormaliseerde dekking te inspecteren voor alle amplicons in een bepaald gen tegen de genormaliseerde dekking van de baseline.
      Opmerking: dit helpt bij het corrigeren van valse oproepen vanwege de segmentatie software, die soms een CNV noemt op basis van symmetrisch abnormale dekking van enkele amplicons aan het einde van een gen en aan het begin van het opeenvolgende gen.
6. Indexering van somatische mutaties
   1. Voor elk geval, index mutatie aanroepen van sequencing van normaal weefsel/bloed, primaire tumor en metastasen.
   2. Markeer als kiembaan en gooi de oproepen die ook blijken uit sequentiëren van gegevens van kiembaan DNA.
   3. Markeer als clonal/oprichter van de mutaties die worden gedeeld tussen alle laesies van een bepaalde patiënt.
   4. Markeer als subklonale/progressor de mutaties die in sommige, maar niet alle laesies van een bepaalde patiënt worden gedetecteerd.

8. immunophenotypic analyse: immunohistochemie voor relevante eiwit expressie

Opmerking: immunohistochemie werd gebruikt om de functionele gevolgen van het inactiveren van mutaties in tumor suppressor genen te valideren.

1. Gebruik een microtoom, snijd 3 − 4 μm dikke FFPE weefsel secties en monteer ze op opgeladen glijbanen en incuberen de glijbanen bij 60 °C gedurende 10 minuten.
2. Plaats de dia's in een rek en voer de volgende stappen uit: xyleen gedurende 10 min, xyleen gedurende 10 min, 95% ethanol gedurende 4 min, 95% ethanol gedurende 4 min, 70% ethanol gedurende 4 min, 70% ethanol gedurende 4 min, gedistilleerd water gedurende 4 min.
3. Antigeen-opvraging uitvoeren op basis van de indicatie van de fabrikanten van antilichamen (tabel met materialen).
   1. Plaats de dia's in een rek met de specifieke antigeen-ophaal oplossing en dompel ze onder in een waterbad bij sub-kooktemperaturen.
   2. Verwijder de dia's uit het bad en voer kraanwater uit om gedurende 10 minuten af te koelen.
4. Plaats dia's in een nieuw rek met 3% H₂O₂ in 1x tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 20 minuten bij RT om endogene peroxiasen te deactiveren.
5. Plaats dia's in een nieuw rek en was 3x met TBS en 0,1% van tween 20 (TBST).
6. Gebruik een PAP-pen (tabel met materialen) om een hydrofobe cirkel rond op een dia gemonteerd weefsel te tekenen.
7. Plaats de glaasjes in een vochtige kamer en voer gedurende 1 uur bij RT een blokkering uit met 5% boviene serumalbumine (BSA) in TBST als blokkerende oplossing.
8. Incuberen de glijbanen met primaire antilichamen (tafel van de materialen) in een vochtige kamer, 's nachts bij 4 °c. Verdun primair antilichaam met blokkerende oplossing zoals aanbevolen.
9. Plaats dia's in een nieuw rek en was 3x met TBST.
10. Inincubatie van dia's met specifieke secundaire antilichamen (anti-muis of anti-konijn) (4 − 5 druppels voor 1 glijbaan) gedurende 30 min bij RT in een vochtige kamer.
11. Plaats dia's in een nieuw rek en was 3x met TBST en daarna in gedistilleerd water.
12. Bereid een 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) oplossing die 1 druppel in 1 mL verdunningsbuffer (tabel met materialen) verdunnen. Incubate dia's maximaal gedurende 5 minuten controle onder de Microscoop.
13. Gebruik een positieve controle om de incubatietijd te berekenen door de ontwikkeling van de reactie onder de Microscoop te volgen.
    Opmerking: elk antilichaam heeft een specifieke incubatietijd nodig.
14. Inactieve DAB (stop chromogeen neerslag) door het samenvoegen van dia's in gedestilleerd water.
15. Contrastain dia's door ze te domlen in een nieuw rek met hematoxyline voor 10 s en vervolgens spoelen met kraanwater.
16. Plaats de dia's in een rek en voer de volgende stappen uit: 70% ethanol voor 4 min, 70% ethanol gedurende 4 min, 95% ethanol gedurende 4 min, 95% ethanol gedurende 4 min, xyleen gedurende 10 min, xyleen gedurende 10 min.
17. DICHTING schuift een paar druppels afdekmedium (Inhoudsopgave) op elke weefsel glijbaan en dek af met dekglaasje.
18. Druk op de dekslip toe om overtollig medium en luchtbellen weg te bewegen van het weefsel en uit de dekslip en lucht drogen.
19. Evalueer en scoor de kleuringsresultaten onder omgekeerde Microscoop met een deskundige patholoog.
    Opmerking: het scorings systeem is afhankelijk van de specifieke antigenen, waarvoor al informatie in de literatuur bestaat. Indien informatie niet beschikbaar is in de literatuur, wordt een scorings systeem afgeleid met behulp van de uitdrukking van het antigeen in normaal weefsel als referentie.

Resultaten

De studie werkstroom wordt geïllustreerd in Figuur 1. Multi-laesies (n = 13) de sequencing van 5 SPN-gevallen gericht op de coderings sequenties van 409 kanker gerelateerde genen identificeerden in totaal 27 somatische mutaties in 8 genen (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1en FGFR3). Mutaties werden gedefinieerd als oprichter/clonal wanneer ze werden gedeeld door alle laesies van een bepaalde patiënt, en progre...

Discussie

Onze methode maakt de identificatie mogelijk van moleculaire veranderingen die betrokken zijn bij de progressie van vaste tumoren door integratie van verticale gegevens (d.w.z. morfologie, DNA-sequencing en immunohistochemie) van verschillende laesies van een bepaalde patiënt. We toonden het vermogen van onze methode voor het opsporen van klonale en subklonale gebeurtenissen in een mutatie Silent tumor type (dat wil zeggen, SPN, Solid-pseudopapillaire neoplasma van de alvleesklier) door het ondervragen van de codeer sequ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939BA	Geautomatiseerd elektroforesetool
Agencourt AMPure XP Kit	Fisher Scientific	NC9959336	Bead-technologie voor de zuivering van PCR-producten; bead-gebaseerd zuiveringsreagens
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4627	Bibliotheekkwantificering
Anti-BAP1	Santa Cruz Biotechnology	sc-28383	Antilichaam
Anti-GLUT1	Thermo Scientific	RB-9052	Antilichaam
Anti-KDM6A	Cell Signaling	#33510	Antilichaam
Anti-p53	Novocastra	NCL-L-p53-DO7	Antilichaam
Anti-βcatenin	Sigma-Aldrich	C7207	Antilichaam
Blocking Solution	zelfgemaakt	-	5 % bovien serum albumine (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivatie oplossing	zelfgemaakt	-	3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra	Leica	70937891	Entellan montagemedia
Epitope Retrieval Solution 1	Leica Biosystems	AR9961	Citraat gebaseerde pH 6,0 epitope retrieval oplossing
Epitope Retrieval Solution 2	Leica Biosystems	AR9640	EDTA gebaseerde pH 9,0 epitope retrieval oplossing
Eppendorf 0,2 ml PCR Tubes, clear	Eppendorf	951010006	Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1,5 mL	Eppendorf	22431021	Tubes
Ethanol	DIAPATH	A0123	IHC deparaffinisatie reagens
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H­4000	Hydrofobe pen
ImmPACT DAB Peroxidase	Vector Laboratories	SK­4105	HRP substraat
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase	Vector Laboratories	MP­7401­50	Secundair antilichaam
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase	Vector Laboratories	MP­7402­50	Secundair antilichaam
Integrative Genomics Viewer (IGV)	Broad Institute	-	https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel	Thermofisher Scientific	4477685	Multiplexed doelselectie van 409 kanker gerelateerde genen. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0	Thermofisher Scientific	4480441	Voorbereiding van amplicon bibliotheken met behulp van Ion AmpliSeq panelen
Ion Chef Instrument	Thermofisher Scientific	4484177	Geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding, template voorbereiding en chip laden
Ion PI Chip Kit v3 of Ion 540 Chip	Thermofisher Scientific	A26771 of A27766	Gebarcodete chips voor sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit of Ion 540 Kit-Chef	Thermofisher Scientific	A27198 of A30011	Template voorbereiding
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit of Ion S5 Sequencing Kit	Thermofisher Scientific	A26433 of A30011	Sequencing
Ion Proton of Ion GeneStudio S5 System	Thermofisher Scientific	4476610 of A38196	Sequencing systeem
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumor-normaal paar	Thermofisher Scientific	4487118	Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin	Thermofisher Scientific	4487118	Gegevensanalysetool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin	Thermofisher Scientific	4483643	Plugin die het niveau van sequentiedekking beschrijft
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin	Thermofisher Scientific	4483643	Plugin die in staat is om single-nucleotide polymorfismen (SNP's), inserties en deleties in een monster te identificeren via een referentie
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit	Thermofisher Scientific	4474517	Unieke barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermofisher Scientific	ND-2000	DNA zuiverheid detectie
NCBI reference sequence (RefSeq) database	NCBI	-	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity	Fisher Scientific	12532-016 of 12532-024	SuperMix voor PCR versterking; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Quiagen	51106 0r 51104	DNA bloed extractie kit
QIAamp DNA FFPE Tissue	Quiagen	56404	DNA FFPE weefsel extractie kit
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermofisher Scientific	Q32866	DNA kwantificering
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermofisher Scientific	Q32850	Kit voor DNA kwantificering op Qubit 2.0 Fluorometer
TBST	zelfgemaakt	-	Tris-buffered saline (TBS) en 0,1% van Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film	Sakura Europe	6172	Geautomatiseerd weefselschuif kleuring instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software	EMBI-EBI	-	http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres	Carlo Erba	492306	IHC deparaffinisatie reagens